DNA isolation, PCR amplification,an

DNA isolation, PCR amplification,
and sequence analysis of 16S rDNA,
gyrB, and rpoD. Genomic DNA of all
unknown isolates was extracted according
to manufacturer’s instructions (GenomicPrep
Kit, Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ). PCR amplifications of
partial 16S rDNA, gyrB, and rpoD were
performed using primer pairs fD1 and rD1,
LJ23f and LJ24r, and LJ25f and LJ26r,
respectively (Table 2). The PCR reactions
were performed using PTC-200 Peltier
Thermal Cycler (MJ Research, Inc., Watertown,
MA) in a 25-µl reaction consisting
of 1× buffer D (Epicentre Biotechnologies,
Madison, WI) and 1 unit of Taq polymerase
(New England BioLabs, Ipswich,
MA) under the following conditions: 94°C
for 2 min, 35 cycles of 94°C for 30 s, 60°C
for 30 s, and 72°C for 1 min, followed by a
final extension cycle of 10 min at 72°C.
PCR products were purified with a PCR
purification kit (QIAquick, Qiagen, Germantown,
MD) and were cloned into the
pCRII-TOPO cloning vector (Invitrogen,
Carlsbad, CA) and identified by direct
PCR amplification using M13 forward and
reverse primers. The identified clones were
grown in LB broth overnight, and DNA
was isolated using a plasmid mini kit
(Qiagen). DNA sequencing was performed
with the BigDye Terminator Cycle Sequencing
Kit v 3.1 and M13 universal
sequencing primers on the AB 3730xl
DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster
City, CA). Sequences were compared
with previously identified sequences in the
NCBI database using BLAST (2).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกดีเอ็นเอ PCR ขยายและการวิเคราะห์ของ 16S rDNAgyrB และ rpoD Genomic DNA ทั้งหมดไม่รู้จักแยกถูกแยกตามให้คำแนะนำของผู้ผลิต (GenomicPrepชุด Amersham Pharmacia เทคโนโลยีชีวภาพปิสกาตาเวย์ NJ) Amplifications PCR ของบางส่วน 16S rDNA, gyrB และ rpoDใช้รองพื้นคู่ fD1 และ rD1LJ23f และ LJ24r และ LJ25f และ LJ26rตามลำดับ (ตารางที่ 2) ปฏิกิริยา PCRดำเนินการใช้ Peltier PTC-200Cycler ความร้อน (MJ วิจัย Inc., WatertownMA) ในประกอบด้วยปฏิกิริยา 25 µlของซื้อ 1 บัฟเฟอร์ D (ลอต Biotechnologiesเมดิสัน WI) และพอลิเมอเรส Taq 1 หน่วย(นิวอิงแลนด์ BioLabs อิปสวิชMA) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 94 ° Cใน 2 นาที รอบ 35 ของ 94° C สำหรับ 30 s, 60° Cสำหรับ 30 s, 72° C สำหรับ 1 นาที ตามด้วยการวงจรขยายสุดท้าย 10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์กับ PCRชุดฟอก (QIAquick, Qiagen, GermantownMD) และมีโคลนเป็นการpCRII เดินโคลนเวกเตอร์ (Invitrogenคาร์ลส CA) โดยตรงขยาย PCR ใช้ M13 ไปข้างหน้า และกลับไพรเมอร์ โคลนที่ระบุได้ปลูกในป.ซุปค้างคืน และดีเอ็นเอถูกแยกโดยใช้ชุดมินิ plasmid(Qiagen) ทำการจัดลำดับของดีเอ็นเอด้วยวงจรเทอร์มิเนเตอร์ BigDye ลำดับเบสชุด v 3.1 และสากล M13ลำดับเบสไพรเมอร์ใน AB 3730xlวิเคราะห์ดีเอ็นเอ (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์เมือง CA) มีการเปรียบเทียบลำดับก่อนหน้านี้ระบุลำดับในการฐานข้อมูล NCBI ใช้ระเบิด (2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกดีเอ็นเอขยาย PCR,
และการวิเคราะห์ลำดับของ 16S rDNA,
gyrB และ rpoD ดีเอ็นเอของทุก
สายพันธุ์ที่ไม่รู้จักถูกสกัดตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต (GenomicPrep
ชุด Amersham Pharmacia ไบโอเทค,
พิสแคต, นิวเจอร์ซีย์) PCR เครื่องขยายเสียงของ
บางส่วน 16S rDNA, gyrB และ rpoD ถูก
ดำเนินการโดยใช้คู่ไพร FD1 และ Rd1,
LJ23f และ LJ24r และ LJ25f และ LJ26r,
ตามลำดับ (ตารางที่ 2) ปฏิกิริยา PCR
ได้ดำเนินการโดยใช้ PTC-200 Peltier
ร้อน Cycler (MJ Research, Inc, ทาวน์
MA) ในปฏิกิริยา 25 ไมโครลิตรประกอบด้วย
1 ×บัฟเฟอร์ D (Epicentre Biotechnologies,
Madison, WI) และ 1 หน่วย Taq polymerase
( นิวอิงแลนด์ BioLabs, Ipswich,
MA) ภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้: 94 ° C
เป็นเวลา 2 นาที, 35 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 60 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 30 วินาที, และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วย
นามสกุลสุดท้าย วงจรของ 10 นาทีที่ 72 ° C.
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR
ชุดฟอก (QIAquick, Qiagen ทาวน์,
MD) และถูกโคลนเป็น
pCRII-TOPO โคลนเวกเตอร์ (Invitrogen,
Carlsbad, CA) และระบุโดยตรง
ขยาย PCR โดยใช้ M13 ไปข้างหน้าและ
ย้อนกลับไพร โคลนระบุถูก
ปลูกในน้ำซุป LB ค้างคืนและดีเอ็นเอ
ที่แยกได้โดยใช้พลาสมิดชุดมินิ
(Qiagen) ลำดับดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการ
กับ BigDye Terminator วงจรลำดับ
ชุด V 3.1 และ M13 สากล
ไพรลำดับใน 3730xl AB
วิเคราะห์ดีเอ็นเอ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์
ซิตี้, แคลิฟอร์เนีย) ลำดับเมื่อเทียบ
กับลำดับระบุก่อนหน้านี้ใน
ฐานข้อมูล NCBI ใช้ระเบิด (2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดดีเอ็นเอซึ่งขยายและการวิเคราะห์ 16S rDNA sequence

gyrb , และ rpod . ดีเอ็นเอของเชื้อถูกสกัดตาม

ที่ให้คําแนะนําของผู้ผลิต ( genomicprep
ชุด ที่มุ่งมั่นของเรา
Piscataway , NJ ) amplifications
บางส่วนของยีน 16S rDNA gyrb , และ rpod ) โดยใช้ไพรเมอร์คู่

rd1 เพื่อการวิเคราะห์และ lj23f lj24r , และ และ และ lj26r
lj25f ,ตามลำดับ ( ตารางที่ 2 ) ปฏิกิริยา PCR โดยใช้เพลเทียร์

) ptc-200 ความร้อนรอบ ( MJ วิจัย , Inc , Watertown ,
มา ) ใน 25 - µ L ปฏิกิริยาประกอบด้วย
1 ×บัฟเฟอร์ D ( แผ่นดินไหวมาก
, Madison , WI ) และ 1 หน่วยของแท็กการ
( อังกฤษ biolabs อิปสวิช
MA ) ภายใต้ เงื่อนไขต่อไปนี้ : 94 ° C
2 นาที 35 รอบ 94 ° C เป็นเวลา 30 , 60 ° C
3 S , และ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาทีตามด้วยวงจรขยาย
สุดท้าย 10 นาทีที่ 72 ° C .
) ผลิตภัณฑ์มีความบริสุทธิ์ด้วย PCR
ฟอก Kit ( qiaquick เร็ง Germantown ,
, , MD ) และถูกโคลนเข้าไป
pcrii Topo โคลนเวกเตอร์ ( Invitrogen
, Carlsbad , CA ) และระบุโดยตรงแบบ PCR
M13 ไปข้างหน้าและใช้
ย้อนกลับรองพื้น ระบุปลูกใน LB broth โคลน

คืน และดีเอ็นเอแยกโดยใช้พลาสมิด Mini Kit
( เพิ่ม ) การจัดลำดับดีเอ็นเอได้ด้วย bigdye Terminator รอบ

ลำดับชุด v 3.1 และ M13 สากล
ลำดับไพรเมอร์ใน AB 3730xl
ดีเอ็นเอวิเคราะห์ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์
City , CA ) ลำดับการเปรียบเทียบกับลำดับในการระบุก่อนหน้านี้

ฐานข้อมูล ncbi ใช้ระเบิด ( 2 )