As mentioned before, the human ABCB

As mentioned before, the human ABCB10 proximal promoter contains
six high-probability binding sites for E2F factors identified in silico.
Therefore, to check if these (and other) factors are able to modulate the
activity of ABCB10 promoter,we cotransfected expression vectors carrying
cDNA for different TFs together with the phABCB10(−979/+133)
Luc vector in HEK293 cells. We decided to use this particular cell line
for two reasons: they transfect relatively easily and the activity of the
ABCB10 promoter constructs in this cell line is low, so potential induction
of the promoter could be more readily detected. Among the E2F
family members tested, overexpression of E2F1 had no effect on the
human ABCB10 promoter, while overexpression of the E2F2, E2F3, and
E2F4 TFs led to significant increases in ABCB10 promoter activity: by
14-, 3- and 14-fold respectively (Fig. 3A). This indicates that the
bioinformatically identified E2F binding sites are indeed capable of acting
as response elements in the cellular setting. To show the specificity
of the observed effects we performed similar experiment using the promoter
sequence of another human mitochondrial ABC gene, ABCB8. As
shown in Fig. 3B, E2F proteins exerted no effect on the ABCB8 promoter
in HEK293 cell line.
Two other transcription factors, used as negative control, Myb and
LEF-1, showed no effect of overexpression on ABCB10 promoter activity
(Fig. 3A).Moreover,we did not observe any effect of overexpressing the
pocket proteins RB1, RBL1, and RBL2, even when we cotransfect them
together with E2F2/4 (Supplementary Fig. 1). Since these proteins are
negative regulators of E2Fs by masking their transactivation domain
[23] resulting in inhibitory action of Rb-E2F complexes, the lack of
modulatory function of Rb proteins in our model supports the notion
that E2F TFs function as free activators of transcription [22] of the
ABCB10 gene.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดังกล่าวก่อน โปรโมเตอร์ที่ proximal ABCB10 มนุษย์ประกอบด้วยเว็บไซต์รวมความน่าเป็นสูงที่หกสำหรับปัจจัย E2F ที่ระบุใน silicoดังนั้น การตรวจสอบว่าเหล่านี้ (และอื่น ๆ) ปัจจัยมีการ modulate แบบกิจกรรมของ ABCB10 โปรโมเตอร์ เรา cotransfected เวกเตอร์นิพจน์ที่ถือครองcDNA สำหรับ TFs แตกต่างกับ phABCB10(−979/+133)เวกเตอร์ลุคในเซลล์ HEK293 เราตัดสินใจที่จะใช้บรรทัดเฉพาะเซลล์นี้ด้วยเหตุผลสองประการ: พวกเขา transfect ค่อนข้างง่าย และการโครงสร้างของโปรโมเตอร์ ABCB10 ในบรรทัดนี้เซลล์จะต่ำ เพื่อให้เกิดการเหนี่ยวนำของโปรโมเตอร์ที่มากขึ้นพบ ระหว่าง E2Fครอบครัวทดสอบ overexpression ของ E2F1 ก็ไม่มีผลในการโปรโมเตอร์ ABCB10 มนุษย์ ขณะ overexpression ของ E2F2, E2F3 และนำไปสู่การเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรม ABCB10 โปรโมเตอร์ TFs E2F4: โดย14- 3 - และ 14-fold ตามลำดับ (Fig. 3A) นี้หมายถึงการไซต์ผูก E2F bioinformatically ระบุเป็นแน่นอนสามารถทำหน้าที่เป็นองค์ประกอบตอบสนองในการตั้งค่าโทรศัพท์มือถือ แสดง specificity ที่ผลการสังเกต เราดำเนินเหมือนทดลองใช้โปรโมเตอร์ที่ลำดับอื่นมนุษย์ mitochondrial ABC ยีน ABCB8 เป็นแสดงใน Fig. 3B, E2F โปรตีนนั่นเองไม่มีผลต่อโปรโมเตอร์ ABCB8ในบรรทัดของเซลล์ HEK293สอง transcription ปัจจัยอื่น ๆ ใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ Myb และแนวตั้ง 1 การแสดงให้เห็นว่าไม่มีผลของ overexpression ABCB10 โปรโมเตอร์กิจกรรม(Fig. 3A)นอกจากนี้ ที่เราไม่ได้สังเกตผลใด ๆ ของ overexpressingpocket proteins RB1, RBL1, and RBL2, even when we cotransfect themtogether with E2F2/4 (Supplementary Fig. 1). Since these proteins arenegative regulators of E2Fs by masking their transactivation domain[23] resulting in inhibitory action of Rb-E2F complexes, the lack ofmodulatory function of Rb proteins in our model supports the notionthat E2F TFs function as free activators of transcription [22] of theABCB10 gene.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดังกล่าวก่อน ABCB10 ก่อการใกล้เคียงมนุษย์มี
ความน่าจะเป็นหกสูงผูกพันเว็บไซต์สำหรับปัจจัย E2F ที่ระบุไว้ใน silico.
ดังนั้นเพื่อตรวจสอบว่าเหล่านี้ (และอื่น ๆ ) ปัจจัยที่มีความสามารถในการปรับ
การทำงานของโปรโมเตอร์ ABCB10 เรา cotransfected เวกเตอร์แสดงออกถือ
cDNA ที่แตกต่างกันสำหรับ TFS ร่วมกับ phABCB10 (-979 / + 133)
ลัคเวกเตอร์ในเซลล์ HEK293 เราตัดสินใจที่จะใช้เซลล์นี้โดยเฉพาะอย่างยิ่ง
สำหรับสองเหตุผลที่พวกเขา transfect ค่อนข้างง่ายและการทำงานของ
โครงสร้างก่อการ ABCB10 ในสายเซลล์นี้อยู่ในระดับต่ำดังนั้นการเหนี่ยวนำที่มีศักยภาพ
ของผู้ก่อการจะได้รับการตรวจพบมากขึ้นได้อย่างง่ายดาย ท่ามกลาง E2F
สมาชิกในครอบครัวทดสอบแสดงออกของ E2F1 ไม่มีผลต่อการ
ก่อการ ABCB10 ของมนุษย์ในขณะที่แสดงออกของ E2F2, E2F3 และ
E2F4 TFS นำไปสู่การเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมก่อการ ABCB10: โดย
14, 3 และ 14 เท่าตามลำดับ (รูป. 3A) นี้บ่งชี้ว่า
ระบุ bioinformatically เว็บไซต์ผูกพัน E2F แน่นอนสามารถทำหน้าที่
เป็นองค์ประกอบการตอบสนองในการตั้งค่าโทรศัพท์มือถือ เพื่อแสดงความจำเพาะ
ของผลกระทบที่เราสังเกตได้ทำการทดลองที่คล้ายกันโดยใช้ก่อการ
ลำดับของยีนยลเอบีซีของมนุษย์อีก ABCB8 ในฐานะที่
แสดงในรูป 3B โปรตีน E2F ออกแรงไม่มีผลต่อการก่อการ ABCB8
ใน HEK293 เซลล์.
สองถอดความปัจจัยอื่น ๆ ที่ใช้ในการควบคุมการลบ Myb และ
LEF-1, แสดงให้เห็นผลกระทบของการแสดงออกในกิจกรรมก่อการ ABCB10 ไม่มี
(รูป. 3A) .Moreover เรา ไม่ได้สังเกตเห็นผลกระทบใด ๆ ของ overexpressing
โปรตีนกระเป๋า RB1, RBL1 และ RBL2 แม้เมื่อเรา cotransfect พวกเขา
ร่วมกับ E2F2 / 4 (เสริมรูป. 1) เนื่องจากโปรตีนเหล่านี้เป็น
หน่วยงานกำกับดูแลเชิงลบของ E2Fs โดยปิดบังโดเมน transactivation ของพวกเขา
[23] ผลในการดำเนินการยับยั้งคอมเพล็กซ์ RB-E2F ขาด
ฟังก์ชั่น modulatory ของโปรตีน Rb ในรูปแบบของเราสนับสนุนความคิดที่
ว่าฟังก์ชัน E2F TFS เป็น activators ฟรีถอดความ [ 22] ของ
ยีน ABCB10

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดังกล่าวก่อน , abcb10 มนุษย์การทำงานโปรโมเตอร์มี
6 ความน่าจะเป็นสูงผูกเว็บไซต์ e2f ปัจจัยที่ระบุใน Silico .
ดังนั้นหากต้องการตรวจสอบเหล่านี้ ( และอื่น ๆ ) ปัจจัยที่สามารถปรับ
กิจกรรมของโปรโมเตอร์ abcb10 เรา cotransfected เวกเตอร์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันแบก
TFS ด้วยกันกับ phabcb10 ( − 979 / 133 )
ลุคใน hek293 เวกเตอร์เซลล์เราตัดสินใจที่จะใช้ Cell โดยเฉพาะ
สำหรับสองเหตุผล : พวกเขา transfect ค่อนข้างง่าย และกิจกรรมของการสร้างในเซลล์
abcb10 นี้ต่ำ ดังนั้นศักยภาพเหนี่ยว
ในโปรโมเตอร์สามารถตรวจพบได้มากขึ้นพร้อม . ระหว่าง e2f
ครอบครัวสมาชิกทดสอบ overexpression ของ e2f1 ไม่มีผลต่อการ abcb10
มนุษย์ ในขณะที่ overexpression ของ e2f2 e2f3
, , และe2f4 TFS LED ที่จะเพิ่มขึ้นในกิจกรรมส่งเสริมการขาย abcb10 :
14 - 3 - 14 เท่าตามลำดับ ( ภาพที่ 3 ) นี้บ่งชี้ว่า
ระบุ bioinformatically e2f เต็มเปี่ยมแน่นอนความสามารถในการแสดง
เป็นองค์ประกอบในการตั้งค่าการตอบสนองของระบบ เพื่อแสดงความจำเพาะของการตรวจสอบผลเรา

ทดลองใช้โปรโมเตอร์ คล้ายลำดับอื่นยลมนุษย์ ABC ยีน abcb8 . ตามที่แสดงในรูปที่ 3B
, โปรตีน e2f นั่นเอง ไม่มีผลต่อ abcb8 promoter ในเซลล์ hek293
.
2 ปัจจัยการถอดความ อื่น ๆ , ใช้ควบคุมลบ myb
lef-1 และพบว่าไม่มีผลในการ overexpression abcb10 กิจกรรม
( รูปที่ 3 ) นอกจากนี้ เราไม่ได้สังเกตผลกระทบใด ๆของ overexpressing ที่
กระเป๋า Rb1 และโปรตีน rbl1 rbl2 , , ,แม้เมื่อเรา cotransfect พวกเขา
ร่วมกับ e2f2 / 4 ( เพิ่มเติมรูปที่ 1 ) เนื่องจากโปรตีนเหล่านี้จะถูกควบคุมโดยกาว e2fs
ลบของพวกเขา transactivation โดเมน
[ 23 ] ผลในการยับยั้งของ rb-e2f เชิงซ้อน ขาด
ฟังก์ชันอซีติลโคลีของ RB โปรตีนในรูปแบบของเราสนับสนุนความคิด
ที่ e2f TFS ฟังก์ชันเป็นอิสระตัวกระตุ้นของบัณฑิตยสถาน [ 22 ] ของ
abcb10 ยีน