Cloning and sequencing of new house

Cloning and sequencing of new house fly P450s
Total RNA was isolated from abdomens of ten female adults
(3rd day) from each strain using TRIzol (Invitrogen, CA, USA)
according to the manufacture’s instruction. Isolated RNA was treated
by DNaseI (Takara, Japan) to eliminate the genomic DNA contamination.
The quality and concentration of each RNA sample
was examined by agarose gel electrophoresis and spectrophotometry.
The RNA was dissolved in RNase-free water and stored at
80 C until use. First-strand cDNA was synthesized using Prime-
Script™ reverse transcriptase (Takara, Japan) from 1 lg total
RNA. The cDNA preparations from three independent RNA sample
were used for amplification. Genomic DNA was isolated from 10
house fly adults (5 males and 5 females) by the method of Rinkevich
et al. [4]. Three biological replicates were prepared for each
strainDifferential display reverse transcription PCR (DDRT-PCR) [36]
was used to identify novel P450s that were potentially overexpressed
in the pyrethroid resistant strain (BJD) compared with the susceptible
strain (TJS). Based on house fly P450 cDNA sequences in
GenBank, eight degenerate primers (P1-P8) were designed based
on the conserved heme-binding region as forward primers and
AUAP as the common reverse primer (Life Technologies, USA).
The cDNAs of BJD and TJS house flies were respectively amplified
by PCR with the eight pairs of primers. The PCR was conducted following
a PCR cycle of 94 C for 3 min, 5 cycles of 95 C for 30 s,
40 C for 2 min and 72 C for 30 s, 35 cycles of 95 C for 30 s,
48 C for 2 min and 72 C for 30 s, and ending with an extension
at 72 C for 10 min. The PCR products with the same primer pair
from BJD and TJS were compared by polyacrylamide gel electrophoresis.
PCR bands that were more abundant in BJD, compared
with TJS, were recovered and sequenced for gene identification.
To clone the full-length of the putative P450 gene cDNAs identified
above, 50-RACE was performed using SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit (Clontech, USA). The first strand cDNAs were synthesized
with AMV reverse transcriptase using TJS mRNA as a template.
The gene-specific primers (CYP6A40-GSP, CYP6D8-GSP and
CYP6G4-GSP, Table 1) were synthesized, basing on the 30-end sequences
of three putative P450 cDNAs. The full-length cDNAs were
carried out according to the protocol described by the manufacturer
(Clontech). The 50-RACE products were purified with PCR™
purification Kit, and cloned into pMD19-T vector (Tiagen, China)
and sequenced (Invitrogen, China). The full length of three putative
P450 cDNAs was verified by RT-PCR using three gene-specific primer
pairs (6A40-F11/6A40-R11, 6D8-F12/6D8-R12 and 6G4-F12/
6G4-R12, Table 1), and cloning and sequencing from both directions
were repeated at least three times with different RNA samples
to confirm the sequencing results.
The Universal GenomeWalker™ Kit (Clontech, USA) was used
for cloning the promoter regions of the three putative P450 genes.
Promoter regions were generated following the protocol described
by the manufacturer with TJS genomic DNA as templates. The sixspecific primers (CYP6A40-SP1/CYP6A40-SP2, CYP6D8-SP1/CYP6D8-SP2 and CYP6G4-SP4/CYP6G4-SP5, Table 1) were used,
based on the 50 coding regions of CYP6A40, CYP6D8 and CYP6G4.
The final products were cloned into pMD19-T vector (Tiagen, China)
and sequenced (Invitrogen, China).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โคลนและลำดับของบ้านใหม่บิน P450sอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจาก abdomens ของผู้ใหญ่หญิงสิบ(3 วัน) จากแต่ละต้องใช้ใช้ TRIzol (Invitrogen, CA, USA)ตามคำแนะนำการผลิต อาร์เอ็นเอที่แยกได้รับการรักษาโดย DNaseI (Takara ญี่ปุ่น) เพื่อกำจัดการปนเปื้อน DNA genomicคุณภาพและความเข้มข้นของแต่ละอย่างอาร์เอ็นเอถูกตรวจสอบโดย agarose เจ electrophoresis spectrophotometryอาร์เอ็นเอที่ละลายในน้ำฟรี RNase และเก็บไว้ที่C 80 จนถึงใช้ CDNA แรกสแตรนด์ถูกสังเคราะห์โดยใช้นายก-™สคริปต์กลับ transcriptase (Takara ญี่ปุ่น) จาก lg รวม 1อาร์เอ็นเอ เตรียม cDNA จากอาร์เอ็นเออย่างอิสระ 3ใช้สำหรับขยายการ Genomic DNA ถูกแยกต่างหากจาก 10บ้านบินผู้ใหญ่ (ชาย 5 และหญิง 5) โดยวิธีการ Rinkevichร้อยเอ็ด al. [4] เหมือนกับชีวภาพสามถูกเตรียมไว้สำหรับแต่ละstrainDifferential transcription กลับแสดงผล PCR (DDRT-PCR) [36]ใช้เพื่อระบุนวนิยาย P450s ที่อาจ overexpressedในพันธุ์ทน pyrethroid (BJD) เปรียบเทียบกับไวต่อต้องใช้(ทีเจเอส) ตามบ้านบิน P450 cDNA ลำดับในGenBank ไพรเมอร์ degenerate แปด (P1-P8) ถูกออกแบบตามในภูมิภาครวม heme นำไพรเมอร์ไปข้างหน้า และAUAP เป็นการทั่วไปกลับพื้น (เทคโนโลยีชีวิต สหรัฐอเมริกา)มีขยาย cDNAs ของแมลงวันบ้าน BJD และทีเจเอสตามลำดับโดย PCR กับคู่แปดของไพรเมอร์ PCR ได้ดำเนินการดังต่อไปนี้PCR วงจร 94 C สำหรับ 3 นาที 5 รอบของ 95 C สำหรับ 30 s2 นาที และ 72 C สำหรับ 30 40 C s, 95 C รอบ 35 สำหรับ 30 sC 48 นาที 2 และ C 72 30 s และสิ้นสุด ด้วยส่วนขยายที่ C 72 สำหรับ 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR กับคู่พื้นเดียวกันBJD และทีเจเอสถูกเทียบ โดยเจ polyacrylamide electrophoresisวง PCR ที่ดาษดื่นมากขึ้นใน BJD เปรียบเทียบกับทีเจเอส มียีนกู้ และตามลำดับสำหรับรหัสการโคลนปราศจากของ cDNAs putative ของยีน P450 ระบุเหนือ 50-แข่งทำใช้ cDNA SMARTTM แข่งขันชุดขยาย (Clontech สหรัฐอเมริกา) CDNAs สาระแรกถูกสังเคราะห์มี transcriptase กลับ AMV ที่ใช้ทีเจเอส mRNA เป็นแม่แบบไพรเมอร์ของยีนเฉพาะ (CYP6A40-GSP, CYP6D8 GSP และตารางที่ 1, CYP6G4-GSP) ได้สังเคราะห์ อ้างอิงในลำดับสุดท้าย 30ของสาม putative P450 cDNAs CDNAs จัดขึ้นดำเนินการตามโพรโทคอลโดยผู้ผลิต(Clontech) ผลิตภัณฑ์แข่งขัน 50 ได้บริสุทธิ์กับ PCR ™ชุด ฟอก และโคลนลงในเวกเตอร์ pMD19 T (Tiagen จีน)และตามลำดับ (Invitrogen จีน) ความยาวเต็มของสาม putativeP450 cDNAs ถูกตรวจสอบ โดย RT-PCR โดยใช้รองพื้นเฉพาะยีนสามคู่ (6A40-F11/6A40-R11, 6D 8-F12 / 6D 8-R12 และ 6G 4-F12 /6 G 4-R12 ตารางที่ 1), และโคลน และลำดับเบสจากทั้งสองทิศทางมีซ้ำน้อยสามครั้งกับอาร์เอ็นเอตัวอย่างที่แตกต่างกันเพื่อยืนยันผลการจัดลำดับใช้ชุด™ GenomeWalker สากล (Clontech สหรัฐอเมริกา)สำหรับโคลนภูมิภาคโปรโมเตอร์ของยีน P450 putative สามโปรโมเตอร์ภูมิภาคสร้างโพรโทคอลอธิบายต่อไปนี้โดยผู้ผลิตกับทีเจเอส genomic DNA เป็นแม่แบบ ใช้ไพรเมอร์ sixspecific (CYP6A40-SP1/CYP6A40-SP2, CYP6D8-SP1/CYP6D8-SP2 และ CYP6G4-SP4/CYP6G4-SP5 ตารางที่ 1)ตามภูมิภาครหัส 50 CYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4ผลิตภัณฑ์สุดท้ายมีโคลนเป็นเวกเตอร์ pMD19 T (Tiagen จีน)และตามลำดับ (Invitrogen จีน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การโคลนและการจัดลำดับของบ้านใหม่บิน P450s
รวมอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากท้องสิบผู้ใหญ่เพศหญิง
(วันที่ 3) จากแต่ละสายพันธุ์โดยใช้ Trizol (Invitrogen, CA, USA)
ตามคำสั่งผลิตของ อาร์เอ็นเอที่แยกออกมาได้รับการรักษาโดย DNaseI (Takara ประเทศญี่ปุ่น) เพื่อกำจัดการปนเปื้อนดีเอ็นเอ. ที่มีคุณภาพและความเข้มข้นของแต่ละตัวอย่างอาร์เอ็นเอได้รับการตรวจสอบโดยข่าวคราว agarose และ spectrophotometry. RNA ถูกละลายในน้ำ RNase ฟรีและเก็บไว้ที่? 80? C จนถึงการใช้งาน cDNA แรกเส้นใยสังเคราะห์โดยใช้ Prime- สคริปต์™กลับ transcriptase (Takara ญี่ปุ่น) ตั้งแต่วันที่ 1 รวมแอลจีอาร์เอ็นเอ เตรียม cDNA จากสามตัวอย่าง RNA อิสระถูกนำมาใช้สำหรับการขยาย ดีเอ็นเอที่แยกได้จาก 10 บ้านทันทีผู้ใหญ่ (5 เพศชายและเพศหญิง 5) โดยวิธีการ Rinkevich et al, [4] สามซ้ำทางชีวภาพได้ถูกเตรียมไว้สำหรับแต่ละการแสดงผล strainDifferential ถอดความกลับ PCR (DDRT-PCR) [36] ถูกใช้ในการระบุ P450s นวนิยายที่ถูก overexpressed ที่อาจเกิดขึ้นในสายพันธุ์ที่ทนไพรีทรอยด์(BJD) เมื่อเทียบกับไวต่อความเครียด(TJS) ขึ้นอยู่กับการบ้านการบินลำดับยีน P450 ในGenBank แปดไพรเมอร์เลว (P1-P8) ได้รับการออกแบบขึ้นในภูมิภาคheme ผูกพันอนุรักษ์เป็นไพรเมอร์ไปข้างหน้าและAUAP เป็นไพรเมอร์กลับทั่วไป (ไลฟ์เทคโนโลยีส์สหรัฐอเมริกา). cDNAs ของ BJD และ TJS แมลงวันบ้านถูกขยายตามลำดับโดยวิธีPCR ที่มีแปดคู่ไพรเมอร์ PCR ได้ดำเนินการดังต่อไปนี้รอบPCR จาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที, 5 รอบ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 35 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 48 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและลงท้ายด้วยนามสกุลที่72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR กับคู่ไพรเมอร์เดียวกันจากBJD และ TJS ถูกนำมาเปรียบเทียบโดย polyacrylamide ข่าวคราว. วงดนตรีที่ PCR ที่มีความอุดมสมบูรณ์มากขึ้นในการ BJD เมื่อเทียบกับTJS ถูกกู้คืนและลำดับขั้นตอนสำหรับการระบุยีน. เพื่อโคลนเต็มความยาวของ P450 สมมุติ cDNAs ยีนระบุข้างต้น50 การแข่งขันได้รับการดำเนินการโดยใช้ SmartTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech สหรัฐอเมริกา) cDNAs สาระครั้งแรกที่ถูกสังเคราะห์ด้วยAMV กลับ transcriptase ใช้ mRNA TJS เป็นแม่แบบ. ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง (CYP6A40-GSP, CYP6D8-GSP และCYP6G4-GSP, ตารางที่ 1) ถูกสังเคราะห์เบสในลำดับที่ 30 ในตอนท้ายของสามcDNAs สมมุติ P450 cDNAs ยาวเต็มรูปแบบได้รับการดำเนินการตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต(Clontech) ผลิตภัณฑ์ที่ 50 การแข่งขันถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR ™บริสุทธิ์ชุดและโคลนเป็นเวกเตอร์pMD19-T (Tiagen, จีน) และติดใจ (Invitrogen, จีน) ความยาวเต็มรูปแบบของสามสมมุติcDNAs P450 ได้รับการตรวจสอบโดย RT-PCR ใช้สามไพรเมอร์ยีนเฉพาะคู่(6A40-F11 / 6A40-R11, 6D8-F12 / 6D8-R12 และ 6G4-F12 / 6G4-R12 ตารางที่ 1) และการโคลนและการเรียงลำดับจากทั้งสองทิศทางซ้ำอย่างน้อยสามครั้งกับตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่แตกต่างกันเพื่อยืนยันผลการลำดับ. สากล GenomeWalker ™ Kit (Clontech สหรัฐอเมริกา) ถูกนำมาใช้สำหรับการโคลนภูมิภาคโปรโมเตอร์ของทั้งสามยีนP450 สมมุติ. ภูมิภาคโปรโมเตอร์ได้ ต่อไปนี้สร้างโปรโตคอลที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิตที่มีดีเอ็นเอTJS เป็นแม่แบบ ไพรเมอร์ sixspecific (CYP6A40-SP1 / CYP6A40-SP2, CYP6D8-SP1 / CYP6D8-SP2 และ CYP6G4-SP4 / CYP6G4-SP5, ตารางที่ 1) ถูกนำมาใช้ขึ้นอยู่กับ50 ภูมิภาคเข้ารหัสของ CYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4. ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย ถูกโคลนเป็นเวกเตอร์ pMD19-T (Tiagen, จีน) และติดใจ (Invitrogen, จีน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การโคลนและลำดับของบ้านใหม่บิน p450s
รวม RNA ถูกแยกจาก abdomens ของสิบผู้ใหญ่หญิง
( วันที่ 3 ) จากแต่ละสายพันธุ์โดยใช้ trizol ( Invitrogen , CA , USA )
ตามคำสั่งของการผลิต แยก RNA ถูกปฏิบัติ
โดย dnasei ( ทาคาระ ญี่ปุ่น ) เพื่อขจัดการปนเปื้อนดีเอ็นเอ .
คุณภาพและความเข้มข้นของแต่ละตัวอย่าง
.ตรวจสอบโดยวิธีเอนไซม์เจล , .
RNA ถูกละลายในน้ำเลสฟรีและเก็บไว้ที่
 80  C จนใช้ แรกที่สังเคราะห์โดยใช้เส้นดีเอ็นเอเฉพาะ -
บท™ reverse transcriptase ( Takara , ญี่ปุ่น ) จาก RNA 1 LG ทั้งหมด

วิธีเตรียมจากสามอิสระอาร์เอ็นเอตัวอย่าง
ถูกใช้เพื่อขยาย . ดีเอ็นเอที่แยกได้จาก 10
บ้านผู้ใหญ่บิน ( ชาย 5 หญิง 5 ) โดยวิธี rinkevich
et al . [ 4 ] สามแบบชีวภาพเตรียมสำหรับแต่ละ
straindifferential แสดงย้อนกลับจากการถอดความของ ) [ 36 ]
เพื่อศึกษานวนิยาย p450s ที่ถูกซ่อนเร้นกับ
ในสายพันธุ์ต้านทานแมลง ( บีเจดี ) เทียบกับไว
ความเครียด ( . ) ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์แมลงวันบ้านพีลำดับใน
ขนาดแปดเสื่อมลงไพรเมอร์ ( p1-p8 ) ถูกออกแบบมาใช้ในการรักษามากกว่า

เอยูเอพีภูมิภาคไปข้างหน้าชนิดเป็นไพรเมอร์แบบทั่วไป ( เทคโนโลยี , USA )
cdnas ของบีเจดี . แมลงวันบ้านและตามลำดับขยาย
โดยวิธี PCR กับแปดคู่ของไพรเมอร์ . ร่วมดำเนินการต่อไปนี้ : PCR รอบ 94  C เป็นเวลา 3 นาที 5 รอบ 95  C 30 S ,
40  C 2 นาที 72  C 30 , 35 รอบ 95  C 30 S ,
 C 2 นาที 48 และ 72  เป็นเวลา 30 วินาที และลงท้ายด้วยนามสกุล
72  C 10 นาที pcr ผลิตภัณฑ์เดียวกันกับไพรเมอร์คู่
และจากบีเจดี TJS เปรียบเทียบโดย polyacrylamide gel electrophoresis .
) วงดนตรีที่มากขึ้นมากในบีเจดี เทียบ
ด้วย . , กู้คืนและลำดับสำหรับการระบุยีน
การโคลนและการแสดงออกของยีนพีแบบเต็มตัว cdnas ระบุ
ข้างบน 50-race ได้ดําเนินการโดยใช้ cDNA amplification (
smarttm แข่งชุด clontech , USA ) กลุ่มแรกที่ cdnas สังเคราะห์
กับอาการย้อนกลับและใช้เป็นแม่แบบของ . .
โดยเฉพาะยีน ( cyp6a40-gsp cyp6d8-gsp
cyp6g4-gsp , และ , ตารางที่ 1 ) ได้พิจารณาจากลำดับ
30 จบ3 cdnas พีซึ่ง . การ cdnas เต็มตัวถูก
ดำเนินการตามขั้นตอนที่ระบุไว้ โดยผู้ผลิต
( clontech ) ผลิตภัณฑ์ 50-race มีความบริสุทธิ์ด้วยชุดฟอก™
PCR และโคลนในเวกเตอร์ pmd19-t ( tiagen , จีน )
และ ลำดับ ( Invitrogen , จีน ) เต็มความยาวสาม cdnas พีซึ่ง
ถูกตรวจสอบความถูกต้องโดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์ 3
เฉพาะยีนคู่ ( 6a40-f11 / 6a40-r11 6d8-f12 / , และ 6d8-r12 6g4-f12 /
6g4-r12 , ตารางที่ 1 ) และการโคลนยีนและลำดับจากทั้งสองทิศทาง
เป็นเวลาอย่างน้อยสามครั้ง ด้วยที่แตกต่างกัน ตัวอย่าง RNA
ยืนยันจัดลำดับผลลัพธ์ .
genomewalker สากล™ Kit ( clontech , USA ) ใช้สำหรับการโคลน
โปรโมเตอร์ภูมิภาคของ สามพี
การแสดงออกยีนโปรโมเตอร์ภูมิภาคถูกสร้างขึ้นตามขั้นตอนที่อธิบาย
โดยผู้ผลิตที่มี TJS genomic DNA เป็นแม่แบบ ไพรเมอร์ sixspecific ( cyp6a40-sp1 / cyp6a40-sp2 cyp6d8-sp1 / , และ / cyp6d8-sp2 cyp6g4-sp4 cyp6g4-sp5 , ตารางที่ 1 ) ใช้
บนพื้นฐานของ cyp6a40 50 รหัสภูมิภาค , และ cyp6d8 cyp6g4 .
ผลิตภัณฑ์สุดท้ายถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ pmd19-t ( tiagen , จีน )
( Invitrogen นี้ , และจีน )