Wound closure assayConfluent HUVEC

Wound closure assay
Confluent HUVEC monolayers were mechanically wounded
with a pipette tip and washed with phosphate-buffered saline
(PBS) to remove the debris. The wounded monolayers were
cultured in the complete EC medium (M199 supplemented
with 20 % FBS, 20 mmol/L HEPES (pH 7.4), 1 ng/mL
recombinant human fibroblast growth factor, 90 mg/mL
heparin and antibiotics). Wound closure was observed under
inverted microscopy, and the images were taken at different
time points. Wound closure was measured using softwares
and presented as relative distance in pixel (ImageJ) or distance
in lM (Leica microscopy imaging software) [17].
Tube formation
After transfection with miR-494 mimic or inhibitor,
HUVECs (3 9 104 cells/well) were seeded onto Matrigel
(BD Biosciences). Cells were microscopically recorded for
the formation of tube-like structures 16 h later. Data were
expressed as the mean ± SEM of the tube numbers per
field [18].
Microvesicle isolation
Tumor cells were cultured in serum-free DMEM for 48 h.
Conditioned medium was collected and centrifuged at
1200g for 3 min to remove living cells and subsequently
centrifuged at 14,000g for 10 min to remove cell debris.
Supernatants were filtered through a 0.22-lm membrane and
centrifuged for 30 min at 16,500g. Microvesicles (MVs)
were pelleted by ultracentrifugation for 2 h at 110,000g,
resuspended in PBS and stored at -80 C until use [18].
Mouse model
All procedures involving mouse experiments were approved by
the Peking University Animal Care and Use Committee and in
conformity with NIH guidelines. Five-week-old male BALB/c
nude mice were injected subcutaneously (s.c.) with A549 cells
(5 9 106
) in serum-free RPMI 1640 and Matrigel (v/v 1:1).
AntagomiR (GenePharma), which has optimized phosphorothioate
modifications to make it more stable than inhibitor,
was used in silencing miR-494 in vivo [3]. Control (NC)
antagomiR or miR-494 antagomiR (0.2 lg) was intratumorally
injected twice on the 8th and 15th day. Tumor volume was
calculated every 3 days according to width2 9 length 9 0.5.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปิดแผลทดสอบ
monolayers HUVEC
ไหลมารวมกันได้รับบาดเจ็บโดยอัตโนมัติด้วยปลายปิเปตและล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์
(พีบีเอส) เพื่อเอาเศษ monolayers
ได้รับบาดเจ็บถูกเลี้ยงในสื่อEC ฉบับสมบูรณ์ (M199 เสริม
20% FBS 20 มิลลิโมล / ลิตร HEPES (pH 7.4) 1 ng /
recombinant ปัจจัยการเจริญเติบโต fibroblast มนุษย์ 90 มิลลิกรัม /
มิลลิลิตรเฮและยาปฏิชีวนะ) ปิดแผลพบว่าภายใต้กล้องจุลทรรศน์คว่ำและภาพที่ถูกนำมาที่แตกต่างกันจุดเวลา ปิดแผลถูกวัดโดยใช้โปรแกรมและนำเสนอเป็นระยะทางญาติในพิกเซล (ImageJ) หรือระยะทางในLM (Leica กล้องจุลทรรศน์ซอฟต์แวร์ภาพ) [17]. ก่อหลอดหลังจาก transfection กับ miR-494 เลียนแบบหรือยับยั้ง, HUVECs (3 9 104 เซลล์ / ดี ) เป็นเมล็ดบน Matrigel (BD ชีววิทยาศาสตร์) เซลล์ที่ถูกบันทึกไว้กล้องจุลทรรศน์สำหรับการก่อตัวของโครงสร้างหลอดเช่น 16 ชั่วโมงต่อมา ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ของตัวเลขหลอดต่อที่สนาม[18]. Microvesicle แยกเซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยงในDMEM ซีรั่มฟรีเป็นเวลา 48 ชม. กลางปรับอากาศที่ถูกเก็บรวบรวมและหมุนเหวี่ยงที่1200G เป็นเวลา 3 นาทีเพื่อขจัดเซลล์ที่มีชีวิตและต่อมาหมุนเหวี่ยงที่ 14,000g เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อเอาเศษเซลล์. supernatants ถูกกรองผ่านเยื่อ-0.22 ไมครอนและปั่นเป็นเวลา30 นาทีที่ 16,500g Microvesicles (เอ็มวี) ได้รับเม็ดโดย ultracentrifugation เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 110,000g, resuspended ในพีบีเอสและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนถึงการใช้งาน [18]. รูปแบบเมาส์ขั้นตอนทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการทดลองเมาส์ได้รับอนุมัติจากปักกิ่งมหาวิทยาลัยดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการและในสอดคล้องกับแนวทาง NIH ห้าสัปดาห์ชายอายุ Balb / C หนูเปลือยถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนัง (SC) กับเซลล์ A549 (5 9 106) ในซีรั่มฟรี RPMI 1640 และ Matrigel (ปริมาตร / ปริมาตร 1: 1). antagomir (GenePharma) ซึ่งมีการเพิ่มประสิทธิภาพ phosphorothioate การปรับเปลี่ยนที่จะทำให้มันมีเสถียรภาพมากขึ้นกว่ายับยั้ง, ที่ใช้ในการห้ามไม่ให้พูด miR-494 ในร่างกาย [3] การควบคุม (NC) antagomir หรือ miR-494 antagomir (0.2 จี) ถูก intratumorally ฉีดครั้งที่สองในวันที่ 8 และ 15 ปริมาณเนื้องอกได้รับการคำนวณทุก 3 วันตามระยะเวลา width2 9 9 0.5

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีปิดบาดแผลบาดเจ็บเป็นกลไก monolayers กระจู๋กระจี๋เพิ่

กับปิเปต ทิป และล้างด้วยเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์
( PBS ) เพื่อเอาเศษ บาดเจ็บ monolayers ถูก
เพาะในสื่อสมบูรณ์ ( EC เปรียบเทียบเสริมด้วย FBS 20%
20 ฮีเปส mmol / L ( pH 7.4 ) 1 ng / ml
recombinant มนุษย์เจริญเติบโต fibroblast ปัจจัย 90 มก. / มล.
heparin กับยาปฏิชีวนะ )การปิดแผลพบว่าภายใต้กล้องจุลทรรศน์
กลับหัวและภาพถ่ายที่จุด
เวลาแตกต่างกัน การปิดแผลที่ถูกวัดโดยใช้โปรแกรม
แสดงเป็นญาติทางไกลในพิกเซล ( ImageJ ) หรือระยะทาง
ใน LM ( ซอฟต์แวร์ไลการ์ภาพ ) [ 17 ] .

หลังจากการสร้างหลอดขนาดกลาง mir-494 เลียนแบบหรือสาร
กลุ่ม ( 3 9 104 เซลล์ / ดี ) มีเมล็ดลงบน matrigel
( BD BIOSCIENCES ) เซลล์มีการบันทึกไว้สำหรับการก่อตัวของจุล
หลอดโครงสร้าง 16 H ในภายหลัง ข้อมูล
แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM ของหลอดเบอร์ต่อ
สนาม [ 18 ] .

microvesicle แยกเซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยงใน serum-free dmem 48 h .
ปรับอากาศขนาดกลางที่ถูกเก็บรวบรวมและระดับที่ 1200g
3 นาทีเพื่อเอาเซลล์ที่มีชีวิต และในภายหลัง
ระดับตอน 14000g 10 นาทีเอาเศษเซลล์ .
supernatants ถูกกรองผ่านเมมเบรนและ
0.22-lm ไฟฟ้าสำหรับ 30 นาทีที่ 16500g . microvesicles ( MVS )
1 เม็ด โดย ultracentrifugation 2 H ที่ 110000g
, resuspended ใน PBS และเก็บไว้ที่ - 80 องศาเซลเซียส จนใช้  [ 18 ] .

เมาส์แบบทุกขั้นตอน ที่เกี่ยวข้องกับการทดลองเมาส์ได้รับอนุมัติจากมหาวิทยาลัยปักกิ่งและดูแลสัตว์

ใช้คณะกรรมการและสอดคล้องกับแนวทาง NIH . ห้าสัปดาห์เก่าชาย balb / C
หนูนู้ดฉีด subcutaneously ( ซี ) ด้วย
a549 ( 5 9 106 เซลล์ RPMI 1640 serum-free
) และ matrigel ( ปริมาตร / ปริมาตร 1 : 1 ) .
antagomir ( genepharma ) ซึ่งมีการปรับเปลี่ยน phosphorothioate
เพื่อให้มีเสถียรภาพมากขึ้นกว่าสาร
ถูกใช้ในความเงียบ mir-494 ชนิด [ 3 ] การควบคุม ( NC )
antagomir หรือ mir-494 antagomir ( 02 ( ) คือ intratumorally
ฉีดสองครั้งในวันที่ 8 และ 15 วัน ปริมาณก้อนคือ
คำนวณทุก 3 วัน ตาม width2 9 ความยาว 9 0.5