Application of PCR
Main article: Applications of PCR
Selective DNA isolation
PCR allows isolation of DNA fragments from genomic DNA by selective amplification of a specific region of DNA. This use of PCR augments many methods, such as generatinghybridization probes for Southern or northern hybridization and DNA cloning, which require larger amounts of DNA, representing a specific DNA region. PCR supplies these techniques with high amounts of pure DNA, enabling analysis of DNA samples even from very small amounts of starting material.
Other applications of PCR include DNA sequencing to determine unknown PCR-amplified sequences in which one of the amplification primers may be used in Sanger sequencing, isolation of a DNA sequence to expedite recombinant DNA technologies involving the insertion of a DNA sequence into a plasmid, phage, or cosmid (depending on size) or the genetic material of another organism. Bacterial colonies (E. coli) can be rapidly screened by PCR for correct DNA vector constructs.[19] PCR may also be used for genetic fingerprinting; a forensic technique used to identify a person or organism by comparing experimental DNAs through different PCR-based methods.
Some PCR 'fingerprints' methods have high discriminative power and can be used to identify genetic relationships between individuals, such as parent-child or between siblings, and are used in paternity testing (Fig. 4). This technique may also be used to determine evolutionary relationships among organisms when certain molecular clocks are used (i.e., the 16S rRNAand recA genes of microorganisms).
Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. (1) Father. (2) Child. (3) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.
Amplification and quantification of DNA
Because PCR amplifies the regions of DNA that it targets, PCR can be used to analyze extremely small amounts of sample. This is often critical forforensic analysis, when only a trace amount of DNA is available as evidence. PCR may also be used in the analysis of ADNA that is tens of thousands of years old. These PCR-based techniques have been successfully used on animals, such as a forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a Russian tsar and the body of English king Richard III.
Quantitative PCR methods allow the estimation of the amount of a given sequence present in a sample—a technique often applied to quantitatively determine levels of gene expression. Quantitative PCR is an established tool for DNA quantification that measures the accumulation of DNA product after each round of PCR amplification.
See also: Use of DNA in forensic entomology
PCR in diagnosis of diseases
PCR permits early diagnosis of malignant diseases such as leukemia and lymphomas, which is currently the highest-developed in cancer research and is already being used routinely. PCR assays can be performed directly on genomic DNA samples to detect translocation-specific malignant cells at a sensitivity that is at least 10,000 fold higher than that of other methods.
PCR allows for rapid and highly specific diagnosis of infectious diseases, including those caused by bacteria or viruses. PCR also permits identification of non-cultivatable or slow-growing microorganisms such as mycobacteria, anaerobic bacteria, or viruses from tissue culture assays and animal models. The basis for PCR diagnostic applications in microbiology is the detection of infectious agents and the discrimination of non-pathogenic from pathogenic strains by virtue of specific genes.
Viral DNA can likewise be detected by PCR. The primers used must be specific to the targeted sequences in the DNA of a virus, and the PCR can be used for diagnostic analyses or DNA sequencing of the viral genome. The high sensitivity of PCR permits virus detection soon after infection and even before the onset of disease. Such early detection may give physicians a significant lead time in treatment. The amount of virus ("viral load") in a patient can also be quantified by PCR-based DNA quantitation techniques (see below).
Limitations
DNA polymerase is prone to error, which in turn causes mutations in the PCR fragments that are made. Additionally, the specificity of the PCR fragments can mutate to the template DNA, due to nonspecific binding of primers. Furthermore prior information on the sequence is necessary in order to generate the primers.
ของ PCRบทความหลัก: งาน PCRใช้แยกดีเอ็นเอPCR ให้แยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอจาก genomic DNA โดยการขยายงานของภูมิภาคที่เฉพาะเจาะจงของดีเอ็นเอ นี้ใช้ PCR augments วิธีหลาย เช่น generatinghybridization probes hybridization เหนือ หรือใต้และดีเอ็นเอโคลน ซึ่งต้องใช้จำนวนดีเอ็นเอ แสดงเฉพาะดีเอ็นเอในภูมิภาคที่มีขนาดใหญ่ PCR อุปกรณ์เทคนิคเหล่านี้ มียอดสูงของดีเอ็นเอบริสุทธิ์ การเปิดใช้งานการวิเคราะห์ตัวอย่างดีเอ็นเอได้จากขนาดเล็กมากจำนวนวัสดุเริ่มต้นโปรแกรมประยุกต์อื่นของ PCR รวมลำดับดีเอ็นเอเพื่อกำหนดรู้จักขยาย PCR ลำดับที่หนึ่งของการขยายไพรเมอร์อาจใช้ใน Sanger ลำดับเบส แยกลำดับดีเอ็นเอเร่งวททชดีเอ็นเอเทคโนโลยีเกี่ยวข้องกับการแทรกลำดับดีเอ็นเอ plasmid, phage หรือ cosmid (ขึ้นอยู่กับขนาดหรือวัสดุทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตอื่น แบคทีเรียอาณานิคม (E. coli) สามารถมีอย่างรวดเร็วฉาย โดย PCR สำหรับโครงสร้างเวกเตอร์ดีเอ็นเอถูกต้อง [19] นอกจากนี้ยังสามารถใช้ PCR สำหรับลายพิมพ์พันธุกรรม เทคนิคทางกฎหมายใช้ในการระบุบุคคลหรือสิ่งมีชีวิต โดยเปรียบเทียบ DNAs ทดลองโดยวิธี PCR ที่ใช้แตกต่างกันบางวิธี 'ลายนิ้วมือ' PCR มีพลังงานสูง discriminative สามารถใช้เพื่อระบุความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม ระหว่าง บุคคล เช่นแม่ลูก หรือ ระหว่างพี่น้อง และใช้ในทดสอบ paternity (Fig. 4) ยังสามารถใช้เทคนิคนี้ในการกำหนดความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการระหว่างสิ่งมีชีวิตเมื่อมีใช้นาฬิกาบางโมเลกุล (เช่น 16S rRNAand recA ยีนของจุลินทรีย์) รูปที่ 4: Electrophoresis ขยาย PCR ดีเอ็นเอชิ้นส่วน (1) บิดา (2) เด็ก (3) แม่ เด็กได้รับมาบาง แต่ไม่ทั้งหมดของลายนิ้วมือของพ่อแม่ ให้มันใหม่ เฉพาะลายนิ้วมือแต่ละขยายและนับของดีเอ็นเอเนื่องจาก PCR กำลังโคจรอยู่ซึ่งภูมิภาคเอ็นที่ชี้ PCR สามารถใช้เพื่อวิเคราะห์จำนวนตัวอย่างขนาดเล็ก นี้มักจะเป็น forforensic ที่สำคัญวิเคราะห์ เมื่อเพียงติดตามจำนวนของดีเอ็นเอเป็นหลักฐาน PCR อาจใช้ในการวิเคราะห์ของแอดนาที่หมื่นปี เทคนิคเหล่านี้ผลสำเร็จใช้ ใน สัตว์ เช่นแมมมอพันสี่สิบปี และ ในดีเอ็น เอมนุษย์ ในการใช้งานตั้งแต่การวิเคราะห์ของมัมมี่อียิปต์รหัสของซาร์รัสเซียและร่างกายของพระมหากษัตริย์อังกฤษริชาร์ด III เชิงปริมาณวิธี PCR สามารถประเมินจำนวนของลำดับที่กำหนดในตัวอย่างซึ่งมักจะใช้เพื่อกำหนดระดับของยีน quantitatively เทคนิค PCR เชิงปริมาณเป็นเครื่องมือสร้างขึ้นสำหรับนับดีเอ็นเอที่วัดสะสมของดีเอ็นเอหลังจากแต่ละรอบของ PCR ขยายSee also: Use of DNA in forensic entomologyPCR in diagnosis of diseasesPCR permits early diagnosis of malignant diseases such as leukemia and lymphomas, which is currently the highest-developed in cancer research and is already being used routinely. PCR assays can be performed directly on genomic DNA samples to detect translocation-specific malignant cells at a sensitivity that is at least 10,000 fold higher than that of other methods. PCR allows for rapid and highly specific diagnosis of infectious diseases, including those caused by bacteria or viruses. PCR also permits identification of non-cultivatable or slow-growing microorganisms such as mycobacteria, anaerobic bacteria, or viruses from tissue culture assays and animal models. The basis for PCR diagnostic applications in microbiology is the detection of infectious agents and the discrimination of non-pathogenic from pathogenic strains by virtue of specific genes. Viral DNA can likewise be detected by PCR. The primers used must be specific to the targeted sequences in the DNA of a virus, and the PCR can be used for diagnostic analyses or DNA sequencing of the viral genome. The high sensitivity of PCR permits virus detection soon after infection and even before the onset of disease. Such early detection may give physicians a significant lead time in treatment. The amount of virus ("viral load") in a patient can also be quantified by PCR-based DNA quantitation techniques (see below).LimitationsDNA polymerase is prone to error, which in turn causes mutations in the PCR fragments that are made. Additionally, the specificity of the PCR fragments can mutate to the template DNA, due to nonspecific binding of primers. Furthermore prior information on the sequence is necessary in order to generate the primers.
การแปล กรุณารอสักครู่..