Additional informationBackgroundPro

Additional information
Background
Protoplasts are thelivingmaterial ofaplantorbacterial cell,whichincludethe protoplasm and plasma
membrane after the cell wall is removed. Due to removal of the cell wall, plant protoplasts have been
widely used for genetic transformation, cell fusion [5] and somatic mutation for generating unique and
novel plants [3,6–8]. Protoplasts obtained through enzymatic cell wall digestion are highly vacuolated
and fragile and are easy to rupture during the following experimental steps, such as washing, isolation,
and transfection, making it difficult for long-term culture and monitoring of biological processes.
Therefore, it is necessary to protect isolated protoplasts from disruption by immobilization.
Polymers prepared from natural or biocompatible gelling agents, such as agarose [9,10], gellangum
[11], and alginate [2–4,12], are often used as the supporting matrices for cells. Alginate is most
popular because the chelation between Na-alginate and calcium chloride does not require high
temperature and organic solvents. Meanwhile, Ca-alginate can be conveniently de-polymerized by
potassium citrate, releasing encapsulated cells without damage. Although alginate has been widely
used for the entrapment of protoplast in the form of beads [13–20] and
film [2–4,12], it is not
firm
enough to provide a good protection for entrapped cells [10], especially when the experimental
procedure needs repeated washing and cell collecting. Because silica is chemically inert, optically
transparent, biologically resistant to microbial attack, mechanically strong, thermally stable and
versatile in shape and size, silica-based matrices have been successfully used to directly encapsulate
plant cells [21–24] or with a multiple step procedure [25–27] in recent years. For the direct
immobilization of plant cell, the colloidal silica interacts strongly with cell walls [27]. For the two-step
procedure, cells are
first immobilized in Ca-alginate beads that are subsequently trapped in silica
matrix, so that harmful contact between cells and the silica precursors is avoided [25].
However, protoplasts without cell walls are more fragile compared with normal plant cell;
therefore, the immobilization materials and procedures should be more carefully designed. Inspired
by the above studies, we outline a procedure in this work describing the immobilization of tobacco
protoplasts by the formation of a uniform
film instead of beads. Moreover, we demonstrate for the
first
time a combined
film strategy with the cell-friendly Transwell instead of the glass slide as the
substrate, which greatly reduces mechanical damage to the protoplasts, and facilitates easy washing
and transfer of cells as well as easy collection of cell secretion or metabolites.
Specifically, in our two-step procedure, the protoplast is
first immobilized within Ca-alginate gel in
the form of
film on Transwell membrane to make protoplasts evenly distributed, then entrapped by
silica sol–gel. After the silica sol–gel solidifies, the Ca-alginate is liquefied by potassium citrate, leaving
protoplasts entrapped in the cavity of silica network, and the viability of immobilized protoplasts is
checked over several days. This immobilization technique can be used on other plant protoplast by
using the appropriate enzyme solution, protoplast medium, washing, and incubation solutions. To
maintain protoplast viability, the osmolality and pH must be optimized. Keeping an optimized
concentration of mannitol and pH in all of the solutions contacting protoplasts is critical to the
viability of protoplast. We had initially tried to use immobilized protoplasts for transient gene
expression, and despite the low transfection efficiency, this simple approach in immobilization of
protoplasts demonstrates the potential to facilitate easy experimental manipulation in the study of
transient gene expression, metabolite production and migration assay. Because there are many factors
affecting biological processes, all further studies should be systematically examined to determine
optimal conditions in order for a good application.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Additional informationBackgroundProtoplasts are thelivingmaterial ofaplantorbacterial cell,whichincludethe protoplasm and plasmamembrane after the cell wall is removed. Due to removal of the cell wall, plant protoplasts have beenwidely used for genetic transformation, cell fusion [5] and somatic mutation for generating unique andnovel plants [3,6–8]. Protoplasts obtained through enzymatic cell wall digestion are highly vacuolatedand fragile and are easy to rupture during the following experimental steps, such as washing, isolation,and transfection, making it difficult for long-term culture and monitoring of biological processes.Therefore, it is necessary to protect isolated protoplasts from disruption by immobilization.Polymers prepared from natural or biocompatible gelling agents, such as agarose [9,10], gellangum[11], and alginate [2–4,12], are often used as the supporting matrices for cells. Alginate is mostpopular because the chelation between Na-alginate and calcium chloride does not require hightemperature and organic solvents. Meanwhile, Ca-alginate can be conveniently de-polymerized bypotassium citrate, releasing encapsulated cells without damage. Although alginate has been widelyused for the entrapment of protoplast in the form of beads [13–20] andfilm [2–4,12], it is notfirmenough to provide a good protection for entrapped cells [10], especially when the experimentalขั้นตอนต้องซักซ้ำและการเก็บรวบรวมเซลล์ เนื่องจากซิลิกาเป็นสารเคมี inert, opticallyชิ้นทนต่อจุลินทรีย์โจมตี กลไกแข็งแรง มั่นคงแพ โปร่งใส และหลากหลายในรูปร่างและขนาด ซิลิก้าโดยใช้เมทริกซ์สำเร็จใช้การซ่อนโดยตรงพืชเซลล์ [21-24] หรือมีหลายขั้นตอน [25 – 27] ในปี สำหรับตรงตรึงโปของเซลล์พืช ซิลิก้า colloidal โต้ตอบอย่างยิ่งกับเซลล์ผนัง [27] สำหรับสองขั้นตอนขั้นตอน เซลล์อยู่หาในเม็ดแอลจิเนต Ca ที่ติดอยู่ในซิลิก้ามาก่อนเมทริกซ์ ดังนั้นผู้ติดต่อที่เป็นอันตรายระหว่างเซลล์และ precursors นส่วนหลีกเลี่ยง [25]อย่างไรก็ตาม โป โดยผนังเซลล์จะเปราะบางมากขึ้นเมื่อเทียบกับพืชปกติเซลล์ดังนั้น ตรึงโปวัสดุและขั้นตอนควรระมัดระวังมากออกแบบ แรงบันดาลใจโดยการศึกษาข้างต้น เราเค้าร่างขั้นตอนในการทำงานนี้อธิบายตรึงโปยาสูบโดยการก่อตัวของเหมือนโปฟิล์มแทนลูกปัด นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นถึงการครั้งแรกเวลาที่รวมกลยุทธ์กับ Transwell เป็นเซลล์แทนภาพนิ่งแก้วเป็นฟิล์มพื้นผิว มากลดความเสียหายของเครื่องจักรกลโป และอำนวยความสะดวกซักง่ายและถ่ายโอนเซลล์และชุดง่ายของเซลล์หลั่งหรือ metabolitesโดยเฉพาะ ขั้นตอนสองขั้นตอนของเรา protoplast เป็นfirst immobilized within Ca-alginate gel inthe form offilm on Transwell membrane to make protoplasts evenly distributed, then entrapped bysilica sol–gel. After the silica sol–gel solidifies, the Ca-alginate is liquefied by potassium citrate, leavingprotoplasts entrapped in the cavity of silica network, and the viability of immobilized protoplasts ischecked over several days. This immobilization technique can be used on other plant protoplast byusing the appropriate enzyme solution, protoplast medium, washing, and incubation solutions. Tomaintain protoplast viability, the osmolality and pH must be optimized. Keeping an optimizedconcentration of mannitol and pH in all of the solutions contacting protoplasts is critical to theviability of protoplast. We had initially tried to use immobilized protoplasts for transient geneexpression, and despite the low transfection efficiency, this simple approach in immobilization ofprotoplasts demonstrates the potential to facilitate easy experimental manipulation in the study oftransient gene expression, metabolite production and migration assay. Because there are many factorsaffecting biological processes, all further studies should be systematically examined to determineoptimal conditions in order for a good application.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Additional information
ข้อมูลเพิ่มเติมพื้นหลังBackground
protoplasts มี thelivingmaterial เซลล์ ofaplantorbacterial, whichincludethe Protoplasts are thelivingmaterial ofaplantorbacterial cell,whichincludethe protoplasm and plasma
สิ่งมีชีวิตอยู่ในเซลล์ของสัตว์และพืชและพลาสม่าเยื่อหลังจากที่ผนังเซลล์จะถูกลบออก เนื่องจากการกำจัดของผนังเซลล์ protoplasts membrane after the cell wall is removed. Due to removal of the cell wall, plant protoplasts have been
พืชได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมของเซลล์ฟิวชั่น[5] widely used for genetic transformation, cell fusion [5] and somatic mutation for generating unique and
และการกลายพันธุ์ของร่างกายในการสร้างเอกลักษณ์และพืชนวนิยาย[3,6-8] protoplasts novel plants [3,6–8]. Protoplasts obtained through enzymatic cell wall digestion are highly vacuolated
ที่ได้รับผ่านการย่อยผนังเซลล์ของเอนไซม์เป็นอย่างสูงแวคิวโอและเปราะบางและง่ายต่อการแตกร้าวในระหว่างขั้นตอนการทดลองต่อไปนี้เช่นซักผ้าแยกและand fragile and are easy to rupture during the following experimental steps, such as washing, isolation,
transfection ทำให้มันเป็นเรื่องยากสำหรับวัฒนธรรมในระยะยาวและการตรวจสอบของกระบวนการทางชีวภาพ. and transfection, making it difficult for long-term culture and monitoring of biological processes.
ดังนั้นจึงเป็น ที่จำเป็นเพื่อปกป้อง protoplasts แยกออกจากการหยุดชะงักจากการตรึง. Therefore, it is necessary to protect isolated protoplasts from disruption by immobilization.
โพลีเมอที่เตรียมจากสารก่อเจลธรรมชาติหรือชีวภาพเช่น agarose [9,10] gellangum Polymers prepared from natural or biocompatible gelling agents, such as agarose [9,10], gellangum
[11] และอัลจิเนต [2-4,12] มักจะใช้เป็นเมทริกซ์ที่สนับสนุน สำหรับเซลล์ อัลจิเนตเป็นส่วนใหญ่ที่นิยมเพราะขับระหว่างนาอัลจิเนตและแคลเซียมคลอไรด์ไม่จำเป็นต้องสูงอุณหภูมิและตัวทำละลายอินทรีย์ ขณะเดียวกันอัลจิเนต Ca-สามารถสะดวก de-polymerized โดยซิเตรตโพแทสเซียมปล่อยเซลล์ห่อหุ้มโดยไม่มีความเสียหาย แม้ว่าอัลจิเนตที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางที่ใช้ในการกักเก็บของโปรโตพลาในรูปแบบของเม็ด [13-20] และภาพยนตร์[2-4,12] มันไม่ได้เป็นบริษัท ที่เพียงพอที่จะให้การป้องกันที่ดีสำหรับเซลล์กัก[10] โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อ ทดลองขั้นตอนการซักผ้าซ้ำความต้องการและการจัดเก็บภาษีมือถือ เพราะซิลิกาเป็นปฏิกิริยาทางเคมีสายตาโปร่งใสทนต่อการโจมตีทางชีวภาพจุลินทรีย์ที่แข็งแกร่งกลไกความร้อนที่มั่นคงและหลากหลายในรูปทรงและขนาดเมทริกซ์ซิลิกาตามที่ได้รับการใช้ประสบความสำเร็จโดยตรงแค็ปซูลเซลล์พืช[21-24] หรือกับหลายขั้นตอน ขั้นตอน [25-27] ในปีที่ผ่านมา สำหรับตรงตรึงเซลล์พืช, ซิลิกาคอลลอยด์โต้ตอบอย่างมากกับผนังเซลล์ [27] [11], and alginate [2–4,12], are often used as the supporting matrices for cells. Alginate is most
popular because the chelation between Na-alginate and calcium chloride does not require high
temperature and organic solvents. Meanwhile, Ca-alginate can be conveniently de-polymerized by
potassium citrate, releasing encapsulated cells without damage. Although alginate has been widely
used for the entrapment of protoplast in the form of beads [13–20] and
film [2–4,12], it is not
firm
enough to provide a good protection for entrapped cells [10], especially when the experimental
procedure needs repeated washing and cell collecting. Because silica is chemically inert, optically
transparent, biologically resistant to microbial attack, mechanically strong, thermally stable and
versatile in shape and size, silica-based matrices have been successfully used to directly encapsulate
plant cells [21–24] or with a multiple step procedure [25–27] in recent years. For the direct
immobilization of plant cell, the colloidal silica interacts strongly with cell walls [27]. For the two-step
procedure, cells are
first immobilized in Ca-alginate beads that are subsequently trapped in silica
matrix, so that harmful contact between cells and the silica precursors is avoided [25].
However, protoplasts without cell walls are more fragile compared with normal plant cell;
therefore, the immobilization materials and procedures should be more carefully designed. Inspired
by the above studies, we outline a procedure in this work describing the immobilization of tobacco
protoplasts by the formation of a uniform
film instead of beads. Moreover, we demonstrate for the
first
time a combined
film strategy with the cell-friendly Transwell instead of the glass slide as the
substrate, which greatly reduces mechanical damage to the protoplasts, and facilitates easy washing
and transfer of cells as well as easy collection of cell secretion or metabolites.
Specifically, in our two-step procedure, the protoplast is
first immobilized within Ca-alginate gel in
the form of
film on Transwell membrane to make protoplasts evenly distributed, then entrapped by
silica sol–gel. After the silica sol–gel solidifies, the Ca-alginate is liquefied by potassium citrate, leaving
protoplasts entrapped in the cavity of silica network, and the viability of immobilized protoplasts is
checked over several days. This immobilization technique can be used on other plant protoplast by
using the appropriate enzyme solution, protoplast medium, washing, and incubation solutions. To
maintain protoplast viability, the osmolality and pH must be optimized. Keeping an optimized
concentration of mannitol and pH in all of the solutions contacting protoplasts is critical to the
viability of protoplast. We had initially tried to use immobilized protoplasts for transient gene
expression, and despite the low transfection efficiency, this simple approach in immobilization of
protoplasts demonstrates the potential to facilitate easy experimental manipulation in the study of
transient gene expression, metabolite production and migration assay. Because there are many factors
affecting biological processes, all further studies should be systematically examined to determine
optimal conditions in order for a good application.