Sample preparation: Thirty-two samp

Sample preparation: Thirty-two samples of chicken meat were used. From each sample, 25 grams were weighted in sterile bags (Seward Medical Stomacher® 400 sterile bags) and inoculated with 1 mL of a dilution (10-7,10-8 or 10-9) of S. Enteritidis or S. Typhimurium and 1 mL of the other 18 bacteria pool diluted 10-2 . In two of the samples, only the pool was inoculated. Finally, 225 mL of PBW 1% were added and homogenized in a Stomacher (Laboratory Blender Stomacher 400, Seward Medical, England) for 30 seconds. Aliquots intended to be used in the PCR were collected immediately after homogenization, and after 6, 8 and 24 hours of pre-enrichment in PBW 1% at 37 oC, in which case they were frozen until PCR assays were performed.

Microbiology method: Following 24 hours of preenrichment in PBW 1%, 0.1 mL was transferred to 9.9 mL of Rappaport-Vassiliadis (Merck) broth and 1 mL to tetrathionate broth (Merck) for selective enrichment at 42 oC and 37 oC for 24 h, respectively. One loopful of broth cultures were streaked onto brilliant green agar (Merck) and Rambach agar (Merck). The plates were incubated at 37 oC for 24 h. Presumptively positive colonies were inoculated into TSI, LI, SIM, urea and nutrient agar (Merck). After incubation at 37 oC for 18-24 h, confirmations were done serologically, using Salmonella polyvalent O and H agglutinating sera (Difco).

DNA extraction using phenol-chloroform, adapted from WILSON et al.8: A 1 mL aliquot of each sample was centrifuged (Centrifuge 5415C, Germany) at 5000 rpm for 4 min and the supernatant was discarded. The pellet was suspended in 1 mL of 10 mM Tris - 1 mM EDTA (TE pH 8), vortexed for 10 s (Pachane tube shaker, Brazil) and the resulting mixture was centrifuged twice, as described above. The supernatant was discarded and the pellet was suspended in 350 mL of TE and vortexed for 10 s. Thirty microlitre of lysozyme (50 mg/mL, Pharmacia Biotech,) was added to the suspension, and the mixture was vortexed for 10 s and placed on ice for 30 min to lyse the cells. After lysis, 40 mL of 10% sodium dodecyl sulphate (SDS, VETEC, Brazil) solution in distilled H2O was added and mixed for 1 min or until it reached an homogeneous, milky suspension. Forty microlitre of proteinase K solution (20 mg/mL, GibcoBRL) was then added; the suspension was mixed by inversion, and the resulting mixture was incubated at 37 °C for one hour in a water bath (Precision, USA). DNA was extracted by adding 800 mL of phenol pH 7 (Merck) to a microcentrifuge tube containing the above-described mixture. The tube was shaked vigorously until a white, milky emulsion was formed and then centrifuged at 13000 rpm for 1 min. After centrifugation, the aqueous phase was transferred to a clean microcentrifuge tube containing 150 mL of TE buffer. A 700 mL volume of a 1:1 mixture of phenol (pH 7) and chloroform-isoamyl alcohol (25:1 vol/vol) was added. The tube was again shaked vigorously until a white emulsion was formed and then centrifuged at 13000 rpm for 1 min. Six hundred microlitre of the aqueous phase were transferred to a clean tube. Approximately 800 mL of chloroform-isoamyl alcohol (25:1) were added, and the tube was inverted several times before centrifugation as before. Following centrifugation, 325 mL of the aqueous phase were transferred to a tube containing 75 mL of 3M sodium acetate pH 7.2 (ACS). The mixture was mixed briefly with a micropipette. Approximately 1 mL of ethanol was added and the tube was inverted five or six times prior to being placed on ice for 10 min. The precipitated DNA was pelleted by centrifugation for 15 min at 13000 rpm; the supernatant was decanted and discarded. The open tube of pelleted DNA was inverted on absorbent paper for 30 min. The pellet was suspended in 50 mL of TE and stored at –20 oC.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เตรียมตัวอย่าง: สามสิบสองตัวอย่างเนื้อไก่ก็ จากตัวอย่างแต่ละ 25 กรัมถูกถ่วงน้ำหนักในกอซถุง (400 แผงประดับหน้าอกแพทย์เวิร์ด®กอซถุง) และ inoculated มี 1 mL ของการเจือจาง (10-7,10-8 หรือ 10-9) Enteritidis s ได้ หรือ s ได้ Typhimurium และ mL 1 ของ 18 แบคทีเรียอื่นๆ สระว่ายน้ำทำให้เจือจาง 10-2 ในตัวอย่างสอง มี inoculated เฉพาะสระว่ายน้ำ สุดท้าย 225 mL ของ PBW 1% เพิ่ม และ homogenized เป็นกลุ่มในแผงประดับหน้าอก (ปฏิบัติ Blender แผงประดับหน้าอก 400 แพทย์เวิร์ด อังกฤษ) เวลา 30 วินาที Aliquots ตั้งใจจะใช้ใน PCR ถูกเก็บทันทีหลัง จาก homogenization และ 6, 8 และ 24 ชั่วโมงก่อนโดดเด่นใน PBW 1% ที่ 37 องศาเซลเซียส ซึ่ง พวกเขาถูกแช่แข็งจนกระทั่งดำเนิน PCR assaysจุลชีววิทยาวิธี: ตามชั่วโมงของ preenrichment ใน PBW 1%, 0.1 mL ถูกถ่ายโอนไป 9.9 มล. Rappaport-Vassiliadis (เมอร์ค) ซุปของและ 1 mL ให้ซุป tetrathionate (เมอร์ค) สำหรับใช้ในบ่อที่ 42 องศาเซลเซียสและ 37 องศาเซลเซียสใน 24 ชม ตามลำดับ Loopful หนึ่งของวัฒนธรรมซุปมีลายสีเขียวสดใส agar (เมอร์ค) และ Rambach agar (เมอร์ค) แผ่นก็ incubated ที่ 37 องศาเซลเซียสสำหรับ 24 h. Presumptively บวกอาณานิคมถูก inoculated TSI, LI, SIM, urea และธาตุอาหาร agar (เมอร์ค) หลังจากบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสสำหรับ h 18-24 ยืนยันทำ serologically ซัล polyvalent O และ H agglutinating (Difco) จะสกัดดีเอ็นเอที่ใช้ผลิตสารฟีนอคลอโรฟอร์ม การดัดแปลงจาก WILSON et al.8: A 1 มล.ส่วนลงตัวของแต่ละอย่างถูก centrifuged (เครื่องหมุนเหวี่ยง 5415 C เยอรมนี) ที่ 5000 รอบต่อนาทีในนาทีที่ 4 และ supernatant ถูกยกเลิก เม็ดที่ถูกระงับใน 1 mL 10 มม.ตรี - 1 mM EDTA (TE pH 8), vortexed 10 s (Pachane หลอดเชคเกอร์ บราซิล) และมี centrifuged ผสมผลลัพธ์สอง ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น Supernatant ถูกละทิ้ง และเม็ดที่ถูกระงับใน 350 มล.ของ TE vortexed สำหรับ 10 เอสสามสิบ microlitre ของ lysozyme (50 mg/mL เทคโนโลยีชีวภาพ Pharmacia,) เพิ่มเพื่อการระงับ และส่วนผสมคือ vortexed สำหรับ 10 s และ 30 นาทีวางไว้บนน้ำแข็งเพื่อ lyse เซลล์ หลังจาก lysis, 40 mL 10% โซเดียม dodecyl ซัลเฟต (SDS, VETEC บราซิล) โซลูชันใน H2O กลั่นถูกเพิ่ม และผสม 1 นาที หรือจน กระทั่งมาถึงระบบกันสะเทือนเหมือน น้ำนม สี่สิบ microlitre โซลูชัน proteinase K (20 mg/mL, GibcoBRL) แล้วเพิ่ม ระบบกันสะเทือนถูกผสม โดยกลับ และส่วนผสมได้ถูก incubated ที่ 37 ° C เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงในห้องน้ำ (ความแม่นยำ สหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอที่แยก โดยเพิ่ม 800 mL ของวาง 7 (เมอร์ค) ไปหลอด microcentrifuge ที่ประกอบด้วยส่วนผสมที่กล่าวข้างต้น หลอดมีขนาดเลโยคะจนเป็นสีขาว อิมัลชันน้ำนมเกิดขึ้นแล้ว centrifuged ที่ 13000 รอบต่อนาทีใน 1 นาที หลังจาก centrifugation ระยะอควีถูกถ่ายโอนไปประกอบด้วยบัฟเฟอร์ TE 150 mL หลอด microcentrifuge สะอาด มีเพิ่มปริมาตร 700 mL ผสมกัน 1:1 วาง (pH 7) และ isoamyl คลอโรฟอร์มแอลกอฮอล์ (ศิรา vol/vol) หลอดได้อีกขนาดเลโยคะจนกว่าอิมัลชันสีขาวเกิดขึ้นแล้ว centrifuged ที่ 13000 rpm สำหรับ microlitre หกร้อย 1 นาทีของระยะอควีถูกโอนย้ายให้ท่อสะอาด เพิ่มประมาณ 800 mL แอลกอฮอล์คลอโรฟอร์ม isoamyl (ศิรา) และท่อถูกกลับหลายครั้งก่อน centrifugation เป็นก่อน ต่อ centrifugation, 325 mL ของเฟสอควีถูกโอนย้ายไปที่หลอดประกอบด้วย 75 mL ของ 3M โซเดียม acetate pH 7.2 (ACS) ส่วนผสมที่ผสมสั้น ๆ ด้วย micropipette การ เข้ามาประมาณ 1 mL ของเอทานอล และท่อถูกกลับห้า หรือหกครั้งก่อนที่จะถูกวางไว้บนน้ำแข็งสำหรับ 10 นาที ดีเอ็นเอ precipitated ได้ pelleted โดย centrifugation สำหรับ 15 นาทีที่ 13000 รอบต่อนาที การ supernatant decanted และละทิ้ง ท่อเปิดของดีเอ็นเอ pelleted ถูกกลับบนกระดาษดูดซับสำหรับ 30 นาที เม็ดถูกหยุดชั่วคราวใน 50 mL ของ TE และเก็บไว้ที่ –20 oC.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเตรียมความพร้อมตัวอย่าง: สามสิบสองตัวอย่างเนื้อไก่ถูกนำมาใช้ จากกลุ่มตัวอย่างแต่ละ 25 กรัมถูกถ่วงน้ำหนักในถุงปลอดเชื้อ (เอิร์ดแพทย์Stomacher® 400 ถุงหมัน) และเชื้อด้วย 1 มิลลิลิตรเจือจาง (10-7,10-8 หรือ 10-9) ของเอสเอสหรือ Enteritidis Typhimurium และ 1 มิลลิลิตรของสระว่ายน้ำอื่น ๆ 18 ปรับลดแบคทีเรียที่ 10-2 ในสองของกลุ่มตัวอย่างเพียงสระว่ายน้ำได้รับเชื้อ สุดท้าย 225 มิลลิลิตร PBW 1% มีการเพิ่มและปั่นใน Stomacher (ห้องปฏิบัติการปั่น Stomacher 400, เอิร์ดแพทย์อังกฤษ) เป็นเวลา 30 วินาที aliquots วัตถุประสงค์ที่จะใช้ใน PCR ถูกเก็บทันทีหลังจากที่เป็นเนื้อเดียวกันและหลังจากที่ 6, 8 และ 24 ชั่วโมงของการเพิ่มปริมาณก่อนใน PBW 1% ที่ 37 องศาเซลเซียสซึ่งในกรณีที่พวกเขาถูกแช่แข็งจนการตรวจ PCR ได้ดำเนินการ. วิธีวิทยา: ต่อไปนี้ 24 ชั่วโมงของการ preenrichment ใน PBW 1%, 0.1 มิลลิลิตรถูกย้ายไป 9.9 มิลลิลิตร-Rappaport Vassiliadis (เมอร์ค) และน้ำซุป 1 มิลลิลิตรเพื่อ tetrathionate น้ำซุป (เมอร์) สำหรับการตกแต่งเลือกที่ 42 องศาและ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงตามลำดับ loopful หนึ่งของวัฒนธรรมที่ถูกน้ำซุปลายลงบนวุ้นสีเขียวสดใส (เมอร์ค) และ Rambach วุ้น (เมอร์ค) แผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง presumptively อาณานิคมบวกถูกเชื้อเข้า TSI, LI, ซิม, ยูเรียและสารอาหารวุ้น (เมอร์ค) หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสสำหรับ 18-24 ชั่วโมงยืนยันได้ทำทางน้ำเหลืองโดยใช้เชื้อ Salmonella polyvalent O และ H agglutinating ซีรั่ม (Difco). การสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ฟีนอลคลอโรฟอร์มที่ดัดแปลงมาจาก WILSON et al.8: การหารมิลลิลิตร 1 ของแต่ละตัวอย่าง ได้รับการหมุนเหวี่ยง (Centrifuge 5415C, เยอรมนี) ที่ 5,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 4 นาทีและสารละลายที่ถูกทิ้ง เม็ดที่ถูกระงับใน 1 มิลลิลิตร 10 มิลลิทริส - EDTA 1 มิลลิ (pH TE 8), การ vortex เวลา 10 วินาที (เครื่องปั่นหลอด Pachane, บราซิล) และมีส่วนผสมที่เกิดขึ้นได้รับการปั่นสองครั้งที่อธิบายข้างต้น สารละลายทิ้งและเม็ดที่ถูกระงับใน 350 มิลลิลิตร TE และการ vortex เวลา 10 วินาที สามสิบไมโครลิตรของไลโซไซม์ (50 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร Pharmacia ไบโอเทค) ถูกบันทึกอยู่ในการระงับและส่วนผสมที่ได้รับการ vortex เวลา 10 วินาทีและวางไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อ lyse เซลล์ หลังจากที่สลาย 40 มิลลิลิตรของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 10% (SDS, VETEC, บราซิล) วิธีการแก้ปัญหาในการกลั่น H2O ถูกบันทึกและผสมเป็นเวลา 1 นาทีหรือจนกว่าจะถึงเนื้อเดียวกันระงับน้ำนม สี่สิบไมโครลิตรของการแก้ปัญหาโปร K (20 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร GibcoBRL) จากนั้นก็เพิ่ม; ระงับถูกผสมโดยผกผันและส่วนผสมที่เกิดขึ้นได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงในอ่างน้ำ (พรีซิชั่สหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยการเพิ่ม 800 มลค่า pH ฟีนอล 7 (เมอร์ค) ไปยังหลอดไมโครที่มีส่วนผสมข้างต้นอธิบาย หลอดถูกเขย่าอย่างแรงจนสีขาว, อิมัลชั่นมที่ถูกสร้างขึ้นและหมุนเหวี่ยงแล้วที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาที หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่เฟสน้ำถูกย้ายไปเป็นหลอดไมโครทำความสะอาดที่มี 150 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ TE ปริมาณ 700 มิลลิลิตร 1: 1 ส่วนผสมของฟีนอล (pH 7) และเครื่องดื่มแอลกอฮอล์คลอโรฟอร์ม isoamyl (25: 1 ปริมาตร / ปริมาตร) ถูกเพิ่มเข้ามา หลอดถูกเขย่าอีกครั้งอย่างจริงจังจนอิมัลชันสีขาวที่ถูกสร้างขึ้นแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาที หกร้อยไมโครลิตรของเฟสน้ำถูกโอนไปยังหลอดสะอาด ประมาณ 800 มิลลิลิตรของเครื่องดื่มแอลกอฮอล์คลอโรฟอร์ม isoamyl (25: 1) มีการเพิ่มและหลอดถูกคว่ำหลายครั้งก่อนที่จะปั่นเป็นมาก่อน ต่อไปนี้การหมุนเหวี่ยง 325 มิลลิลิตรของเฟสน้ำถูกย้ายไปเป็นหลอดที่มี 75 มิลลิลิตร 3M โซเดียมอะซิเตทพีเอช 7.2 (ACS) ส่วนผสมที่ผสมเป็นเวลาสั้น ๆ กับไมโคร ประมาณ 1 มิลลิลิตรของเอทานอลได้รับการเพิ่มและหลอดถูกคว่ำห้าหรือหกครั้งก่อนที่จะถูกวางบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที ดีเอ็นเอตกตะกอนได้โดยการหมุนเหวี่ยงเม็ดเป็นเวลา 15 นาทีที่ 13,000 รอบต่อนาที; ใสถูก decanted และทิ้ง หลอดเปิดดีเอ็นเอเม็ดถูกคว่ำลงบนกระดาษดูดซับเป็นเวลา 30 นาที เม็ดถูกระงับใน 50 มลของ TE และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่างการเตรียม : สามสิบสองตัวอย่างของไก่เนื้อมาใช้ จากแต่ละตัวอย่าง 25 กรัม มีน้ำหนักในถุงปลอดเชื้อ ( ซีเวิร์ดแผงประดับหน้าอกทางการแพทย์®เป็นหมัน 400 ถุง ) และ หัวเชื้อ 1 มล. เจือจาง ( 10-7,10-8 หรือ 10-9 ) ของสหรัฐอเมริกา enteritidis หรือ S . typhimurium 1 มิลลิลิตร และอีก 18 แบคทีเรียพูลเจือจาง 10-2 . 2 ในตัวอย่างเพียงสระเป็นเชื้อ . ในที่สุด225 มิลลิลิตร pbw 1% เพิ่มโฮโมในแผงประดับหน้าอก ( ห้องปฏิบัติการเครื่องปั่นแผงประดับหน้าอก 400 ซีเวิร์ดทางการแพทย์ , อังกฤษ ) 30 วินาที เฉยๆไว้เพื่อใช้ในการตรวจครั้งนี้ทันทีหลังจากการ และหลังจาก 6 , 8 และ 24 ชั่วโมงก่อนการเสริมใน pbw 1 % ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ซึ่งในกรณีนี้พวกเขาถูกแช่แข็งจนสามารถตรวจได้

จุลชีววิทยาวิธีการ :ต่อ 24 ชั่วโมง preenrichment ใน pbw 1% , 0.1 ml ไปเป็น 9.9 กรัมแร็ปเปอพอร์ต vassiliadis ( Merck ) น้ำซุป 1 มิลลิลิตรกับเตตราไทโอเนต broth ( Merck ) การเสริม 42 องศาเซลเซียสและ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตามลำดับ หนึ่ง loopful broth วัฒนธรรมลายบนวุ้นสีเขียวสดใส ( Merck ) และลดขนาด ( Merck ) จานถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงpresumptively บวกอาณานิคมเป็นเชื้อ 2 , li , ซิม , ยูเรียและ nutrient agar ( Merck ) หลังจากบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง คอนเฟิร์มจำนวนคนที่ใช้ Salmonella ต่อ O และ H สิงสถิตย์เซรา ( difco )

สกัดดีเอ็นเอโดยใช้ฟีนอล ( ดัดแปลงจากวิลสัน et al . 8 : 1 ml ส่วนลงตัวของแต่ละตัวอย่างที่ระดับ 5415c ( centrifuge ,เยอรมนี ) ที่ 5 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 4 นาที และนำมันทิ้ง เม็ดถูกระงับใน 1 มิลลิลิตรต่อ - 10 มม. 1 mM EDTA ( Te pH 8 ) , 10 ( vortexed pachane หลอด shaker , บราซิล ) และส่งผลให้ไฟฟ้าผสมสองครั้งตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และน่านถูกทิ้งและเม็ดถูกระงับใน 350 มิลลิลิตร และ เต้ vortexed 10 . 30 ไมโครลิตรของไลโซไซม์ ( 50 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรที่มุ่งมั่นของเรา ) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในการระงับ และส่วนผสม vortexed 10 และวางไว้บนน้ำแข็ง 30 นาที จะทำให้เซลล์ หลังจากการสลาย 40 ml 10% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS , vetec , บราซิล ) วิธีการกลั่น H2O คือเพิ่มและผสมสำหรับ 1 นาที หรือจนกว่าจะถึงระงับน้ำนมเป็นเนื้อเดียวกัน . ไมโครลิตรสี่สิบของสารละลาย K โปรตีน ( 20 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร gibcobrl ) คือเพิ่มแล้ว ;ถูกระงับโดยการผสมและผลผสมบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงในการอาบน้ำ ( Precision , USA ) ดีเอ็นเอ โดยเพิ่ม 800 ml ของฟีนอลที่ pH 7 ( Merck ) เป็นหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ที่มีข้างต้นอธิบายส่วนผสม หลอดมันสั่นแรงจนเป็นสีขาวนมอิมัลชันถูกสร้างขึ้นแล้วในระดับ 10 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาที หลังการปั่นเหวี่ยง ,ระยะที่น้ำถูกส่งไปทำความสะอาดหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ที่มี 150 มิลลิลิตร TE buffer 700 มล. ปริมาตรของ 1 : 1 ผสมฟีนอล ( pH 7 ) และคลอโรฟอร์มในปริมาณแอลกอฮอล์ ( 25 : 1 Vol / Vol ) ถูกเพิ่มเข้ามา หลอดมันสั่นแรงจนอีกเป็นอิมัลชันสีขาวถูกสร้างขึ้นแล้วในระดับ 10 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาที 6 100 ไมโครลิตรของเฟสน้ำ คือ ความสะอาดท่อประมาณ 800 มล. ของแอลกอฮอล์ในปริมาณคลอโรฟอร์ม ( 25 : 1 ) มีการเพิ่ม และหลอดมันคว่ำหลายครั้งมาก่อนปั่นก่อน ต่อไปนี้ 3 , 325 มิลลิลิตรของสารละลาย คือ ระยะหลอด 75 ml ของ 3M ที่มี pH 7.2 โซเดียมอะซิเตต ( ACS ) ผสมผสมสั้นกับไมโครปิเปตต์ .ประมาณ 1 ml เติมเอทานอลและท่อกลับ ห้า หรือ หกครั้ง ก่อนที่จะถูกวางไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที โดยการปั่นเหวี่ยงตกตะกอนดีเอ็นเอเม็ด 15 นาทีที่ 13 , 000 รอบต่อนาที ; น่านคือรินและละทิ้ง ท่อเปิดของดีเอ็นเอถูกคว่ำบนกระดาษดูดซับเม็ดสำหรับ 30 นาที เม็ดถูกระงับใน 50 มิลลิลิตร เต้ และเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียส