Cell culture was carried out at 378

Cell culture was carried out at 378C and 5% CO2 in a humidified atmosphere. P19 cells, subclone 18 w10x, were cultivated in a-MEM medium ŽGibco BRL. containing 10% fetal bovine serum ŽFBS, Gibco BRL. and passaged every other day using 0.2% trypsin-EDTA ŽGibco BRL.. For neuronal differentiation 4 = 10 5 cells were seeded onto 10 cm Petri dishes of cell culture grade ŽNunc. and grown for 24 h in a-MEM with 10% FBS. Medium was replaced by a-MEM with 2% FBS containing all-trans retinoic acid ŽSigma. in a final concentration of 1 mM; 48 h after induction culture medium was replaced by a-MEM with 2% FBS without retinoic acid. Medium was changed every other day. Cultures were harvested after 1, 5, 10 and 14 days after addition of retinoic acid. Undifferentiated control cultures were grown exclusively in a-MEM with 10% FBS and harvested 48 h after seeding onto Petri
dishes. For non-radioactive in situ hybridization, cells were grown on glass slides coated with poly-D-lysine ŽSigma

2.3. RNA preparation
RNA was extracted from cultivated cells by the method of Chomczynski and Sacchi w7x with slight modifications. Cells were lysed in the Petri dish immediately after remov- ing the culture medium and washing cells with sterile PBS. Typically, the yield of RNA from a 10 cm culture dish was 10–100 mg.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซลล์ได้ดำเนินการที่ 378C และ 5% CO2 ในบรรยากาศณอุณหภูมิ เซลล์ P19, subclone 18 w10x ถูกปลูกใน ŽGibco กลางเป็น MEM BRL ที่ประกอบด้วย 10% ซีรั่มวัวทารก ŽFBS, Gibco BRL และ passaged ทุกวันใช้ 0.2% EDTA ปซิ ŽGibco BRL ... สำหรับความแตกต่างเส้นประสาท 4 = 10 5 เซลล์ที่เตรียมลงบนอาหารเพาะ 10 ซม.ของเซลล์วัฒนธรรมเกรด ŽNunc และเติบโตใน 24 h ในที่ MEM 10% FBS กลางถูกแทนที่ ด้วยที่ MEM กับ 2% FBS ที่มีทั้งหมด-ทรานส์ retinoic กรด ŽSigma ในความเข้มข้นสุดท้าย 1 มม. 48 ชั่วโมงหลังจากที่สารเหนี่ยวนำถูกแทนที่ ด้วยที่ MEM 2% FBS โดย retinoic กรด ปานกลางมีการเปลี่ยนแปลงทุกวัน วัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยวหลัง 1, 5, 10 และ 14 วันหลังจากการเพิ่มของกรด retinoic ควบคุมความแตกต่างวัฒนธรรมที่ปลูกเฉพาะในที่ MEM ด้วย 10% FBS และเก็บเกี่ยว 48 ชั่วโมงหลังจากเพาะไปเพาะอาหาร สำหรับกัมมันตรังสีใน situ hybridization เซลล์ที่ปลูกบนกระจกสไลด์ที่เคลือบ ด้วยโพลี-D-ไล ŽSigma2.3. RNA เตรียมRNA ถูกแยกจากเซลล์ที่ปลูก โดยวิธีการของ w7x Chomczynski และสภาการแก้ไขเล็กน้อย เซลล์ได้นาทีที่ 37uc ในจานเพาะเชื้อทันทีหลังจากได้-ing สื่อวัฒนธรรมและล้างเซลล์ ด้วย PBS เป็นหมัน โดยปกติ ผลผลิตของอาร์เอ็นเอจากจานวัฒนธรรม 10 ซม.ได้ 10 – 100 มิลลิกรัม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเพาะเลี้ยงเซลล์ได้ดำเนินการที่ 378C และ 5% CO2 ในบรรยากาศความชื้น เซลล์ P19, subclone 18 w10x, ได้รับการปลูกฝังใน-Mem กลางŽGibco BRL ที่มี 10% ของทารกในครรภ์ŽFBSวัวซีรั่ม, Gibco BRL และ passaged ทุกวันอื่น ๆ ที่ใช้ 0.2% trypsin-EDTA ŽGibco BRL .. สำหรับความแตกต่างของเส้นประสาท 4 = 10 5 เซลล์เมล็ดบน 10 ซม. จานเลี้ยงเชื้อของเกรดการเพาะเลี้ยงเซลล์ŽNunc และเติบโตขึ้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมงใน-Mem 10% FBS กลางก็ถูกแทนที่ด้วย-Mem กับ 2% FBS มีทั้งหมด-Trans retinoic กรดŽSigma ในความเข้มข้นสุดท้ายของ 1 มิลลิ; 48 ชั่วโมงหลังอาหารเลี้ยงเหนี่ยวนำก็ถูกแทนที่ด้วย-Mem กับ 2% FBS โดยไม่ต้อง retinoic กรด กลางก็เปลี่ยนไปทุกวัน ๆ วัฒนธรรมเก็บเกี่ยวหลังวันที่ 1, 5, 10 และ 14 วันหลังจากการเพิ่มของ retinoic กรด วัฒนธรรมที่แตกต่างการควบคุมมีปลูกเฉพาะใน-Mem 10% FBS และเก็บเกี่ยว 48 ชั่วโมงหลังจากการเพาะเลี้ยงเชื้อบน
จาน สำหรับผู้ที่ไม่กัมมันตรังสีในแหล่งกำเนิดพันธุ์เซลล์ที่ปลูกบนภาพนิ่งแก้วเคลือบด้วยโพลี-D-ไลซีนŽSigma

2.3 การเตรียมอาร์เอ็นเอ
อาร์เอ็นเอเป็นสารสกัดจากเซลล์เพาะปลูกโดยวิธี Chomczynski และ Sacchi w7x ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์ที่ถูก lysed ในจานเลี้ยงเชื้อในทันทีหลังจากที่ไอเอ็นจี remov- กลางและซักผ้าเซลล์วัฒนธรรมที่มีการฆ่าเชื้อพีบีเอส โดยปกติแล้วอัตราผลตอบแทนจาก RNA จานวัฒนธรรม 10 ซม. เป็น 10-100 มิลลิกรัม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกหามออกใน 378c และ CO2 ร้อยละ 5 ใน humidified บรรยากาศ p19 เซลล์ subclone 18 w10x ถูกปลูกใน a-mem ขนาดกลาง Z ̌ gibco BRL . บรรจุ 10 % ของวัว เซรั่มซี̌ FBS gibco BRL . และ passaged ทุกวันอื่น ๆโดยใช้ 0.2% ทริป EDTA Z ̌ gibco บรูเล่ . . . . . . . สำหรับการเปรียบเทียบ 4 = 10 5 เซลล์ถูก seeded ลง 10 ซม. จานเพาะเลี้ยงเซลล์วัฒนธรรมเกรด Z ̌ขณะนี้ . ขนาด 24 ชั่วโมง a-mem 10% FBS ขนาดกลางถูกแทนที่ด้วย a-mem ร้อยละ 2 FBS ที่มีทั้งหมดทรานส์ retinoic acid Z ̌ Sigma ในความเข้มข้นสุดท้าย 1 มม. ; 48 ชั่วโมงหลังจากถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อแบบ a-mem ร้อยละ 2 FBS โดย retinoic กรด อาหารเปลี่ยนไปทุกวันๆ วัฒนธรรมที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 1 , 5 , 10 และ 14 วัน หลังจากเพิ่ม retinoic กรด วัฒนธรรมควบคุมไม่แตกต่างกันมีปลูกเฉพาะใน a-mem กับ FBS 10% และเก็บเกี่ยว 48 ชั่วโมงหลังจากทดลองเพาะบนอาหาร ปลอดสารกัมมันตรังสีใน situ hybridization , เซลล์ที่ปลูกบนสไลด์แก้วเคลือบด้วย poly-d-lysine Z ̌ซิกม่า2.3 การเตรียมการ .ซึ่งสกัดจากเซลล์ที่ปลูกโดยวิธี chomczynski และ sacchi w7x กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์มี lysed ในจานเพาะเชื้อทันทีหลังจากเ - ไอเอ็นจีสื่อวัฒนธรรมและล้างด้วย pbs เซลล์ที่เป็นหมัน โดยทั่วไป ผลผลิตของ RNA จาก 10 เซนติเมตร วัฒนธรรมอาหาร 10 – 100 มิลลิกรัม