performed with a monoclonal mouse a

performed with a monoclonal mouse antibody against BDV p40 (38/17C1) in a 1:200 dilution overnight at 4°C. After extensive washing, bound antibody was detected by using the peroxidase-based Vectastain-elite ABC kit (Vector Laboratories) according to the manufacturer’s instructions and counterstained with hematoxylin.
In Vitro Cytotoxicity Assay of Brain Lymphocytes.

Brain lymphocytes were isolated as described (21,25), and their cytolytic activity was determined by a standard 51Cr release assay. Target cells were prepared as follows: 5 × 106 L929 (H-2k) or MC57G (H-2b) cells in 0.5 ml of DMEM/10% FCS were labeled in suspension with 250 μCi of 51Cr (Amersham Pharmacia) for 2 h at 37°C. After three washings, the cells were infected with the indicated recombinant vaccinia virus at a multiplicity of infection of 5 for 2–4 h. Target cells were incubated with effector cells for 6 h at 37°C, and the percentage of specific 51Cr release was calculated.
Previous SectionNext Section
RESULTS
Temporary Depletion of CD8+ and CD4+T Cell Subsets in Vivo Delays Onset of BDV-Induced Neurological Disorder.
We demonstrated recently that β2-microglobulin knockout mice (β2m−) lacking functional CD8+ T cells do not develop CNS inflammation and neurological disorder after infection with BDV as newborns (22). Because β2m− mice have additional impairments of the immune system (26), we wanted to confirm the relevance of CD8+ T cells in the pathogenesis of BDV-induced disease by in vivo depletion experiments. Newborn-infected MRL mice were treated at 15 or 18 days of age with a mAb against CD8 followed by a second antibody administration 3–4 days later. Flow cytometry indicated that the percentage of CD8+ T cells had dropped below 1% of total peripheral blood lymphocytes by 5 days postadministration of the first dose of anti-CD8 antibody and remained below 1% for at least 16 days (data not shown). At later time points, levels of CD8+ T cells increased again but did not reach their normal level within 35 days. Of the nine anti-CD8-treated mice from three independent experiments, seven (78%) did not show detectable signs of neurological disease until 7 weeks of age, whereas all nine control animals developed severe neurological disorder within this period of time and had to be sacrificed (Table 1). Disease onset in the two antibody-treated animals that developed disease was delayed by about 12 days. These two cases occurred in experiment 2 in which treatment with anti-CD8 antibody was started at day 18 instead of day 15 as in the other two experiments, raising the possibility that correct timing of antibody treatment is of critical importance for disease prevention.
• In this window
• In a new window
Table 1
In vivo T cell depletion delays Borna disease in mice
We also determined the contribution of CD4+ T cells to BDV-induced disease by in vivo depletion of this T cell subset. Interestingly, eight of nine mice depleted of CD4+ T cells did not develop disease within the normal time range of 4 to 7 weeks postinfection (Table 1), indicating an important role of CD4+ T cells in the immunopathological process. Again, start of depletion at day 18 resulted in incomplete protection. Thus, transient depletion of CD8+ or CD4+ T cells conferred temporary protection against fatal BDV-induceddisease, indicating that both major T cell subsets are necessary for the development of Borna disease in MRL mice.
Lymphocytic Brain Infiltrates Contain a High Proportion of Activated CD8+T Cells.

About 3 × 106 viable lymphocytes could be recovered from brains of MRL mice at the peak of disease. The CD8+ T cells in these preparations outnumbered CD4+ T cells by a factor of 2.3, whereas in peripheral blood and in spleen this ratio was about 0.5. Analysis of activation markers of CD8+ T cells from brains of diseased animals revealed up-regulation of CD25 (IL-2 receptor) and CD69 (very early activation marker) expression (Fig. 1 A and C) and down-regulation of CD62L (L-selectin) (Fig. 1B). Expression of CD49d (integrin α4) on brain-derived CD8+ T cells was only slightly higher than on CD8+ T cells from spleen (data not shown). This pattern of surface marker expression indicated an activated state of the recovered CD8+ T cells. Brain-derived CD4+ T cells also were activated as judged by significantly increased expression of CD69 (Fig. 1C), and decreased expression of CD62L (Fig. 1B).
Figure 1
Expression of activation markers on brain-derived CD8+ T cells. Neonatally infected MRL mice were sacrificed at the peak of neurological disease, and brain lymphocytes were isolated. Uninfected age-matched MRL mice served as donors for spleen lymphocytes. Lymphocytes were stained with anti-CD8-FITC or anti-CD4-FITC and biotinylated mAb specific for CD25 (IL-2 receptor) (A), CD62L (L-selectin) (B), or CD69 (very early activation antigen) (C) followed by streptavidin-R-PE detection. Three independent experiments were performed and dot plots are shown from one representative experiment. (Left) Analysis of spleen lymphocytes from a naive mouse. (Right) Brain-derived lymphocytes. Percentages of CD4+ and CD8+ T cells positive for the indicated marker are given in the upper quadrants.
Brain Lymphocytes Show CD8+ T Cell-Dependent and MHC I-Restricted Cytotoxic Activity Mainly Against Target Cells Expressing the Viral Nucleoprotein p40.
To determine the potential cytolytic activity of brain-derived CD8+ T cells, we performed in vitro cell-mediated cytotoxicity assays on haplotype-matched target cells expressing BDV antigens. Because BDV does not multiply readily in mouse cells, we employed recombinant vaccinia viruses that code for the BDV protein p40, p24, or gp94 (p57) to infect mouse L929 (H-2k) cells that then were used as cytotoxic T lymphocyte (CTL) targets. The phenotype of the various recombinant vaccinia viruses was confirmed by immunoprecipitation experiments using monospecific antisera to the various BDV proteins and lysates of infected CV-1 cells (data not shown). When freshly isolated brain lymphocyte preparations from heavilydiseased MRL mice were used as effectors without prior in vitro restimulation, strong cytotoxic activity against p40-expressing L929 cells was observed (Fig. 2A). In contrast, L929 cells expressing gp94 (p57) were not lysed to significantly higher levels than L929 cells infected with a vaccinia virus expressing an irrelevant protein, whereas lysis of p24-expressing cells reached intermediate levels (Fig. 2A). Target cell preparations infected with the various recombinant vaccinia viruses were lysed to a similar extent by vaccinia virus-specific CTLs, whereas mock-infected L929 cells were not killed (Fig. 2B), indicating that the observed differences in target cell lysis by BDV-specific CTLs were not due to different degrees of vacciniavirus infection (Fig. 2B). Brain lymphocyte preparations from diseased CBA/J mice, another mouse strain with H-2k haplotype that develops neurological disorder after BDV infection with intermediate frequency (22), also showed high cytolytic activity against p40-expressing L929 cells (Fig. 2C). Brain lymphocyte preparations from naive MRL mice contained only very low numbers of lymphocytes. Mock preparations recovered from these brains showed no lytic effect on target cells (Fig. 2D). Unlike brain lymphocyte preparations from diseased animals that showed specific lysis of p40-expressing L929 cells, effector cells prepared from their spleens showed no such activity (Fig. 2D).
Figure 2
Ex vivo CTL activity of brain lymphocytes from BDV-infected mice is directed mainly against the viral nucleoprotein p40. Brain lymphocytes from severely diseased MRL mice (A) or VV-specific CTLs (B) were used as effectors on VV-infected L929 target cells expressing the indicated recombinant BDV proteins or irrelevant control proteins. (C) CTL assay with lymphocytes from the brain of a severelydiseased CBA/J (H-2k) mouse. (D) Spleen lymphocytes of MRL mice lack BDV-specific CTLs. Effector cells from brains or spleens of either severely diseased BDV-infected or healthy mock-infected MRL mice were incubated with L929 target cells expressing BDV p40. Brain lymphocyte preparations from uninfected MRL mice usually contained less than 105 lymphocytes. They were resuspended in the same volume of medium as lymphocytes from brains of diseased animals, and identical volumes of both cell preparations were used in the CTL assays. (E) MHC restriction of CTL activity. Target cells were either MC57G cells (H-2b) or L929 cells (H-2k) infected with the indicated vaccinia viruses. Effector cells were from brains of MRL (H-2k) mice with severe Borna disease. (F) Specific depletion of CD8+ T cells from brain lymphocyte preparations abolishes CTL activity. Brain lymphocyte preparations containing 2 × 106 lymphocytes/ml were incubated for 30 min at 4°C with 107 magnetic beads coated with anti-CD4 or anti-CD8 antibodies (Dynal, Great Neck, NY) to deplete the respective T cell subset. Lymphocytes complexed to magnetic beads were removed, and the remaining cells were used as effectors in standard cytotoxicity assays. Spontaneous lysis of target cells usually was less than 20% except in F, where it was 40%. Specific lysis is plotted against the indicated effector-to-target-cell ratios.
MC57G cells (H-2b) infected with VV-p40 were not lysed specifically by brain lymphocytes from diseased MRL mice, although the same preparation was able to lyse p40-expressing L929 cells (Fig. 2E). By contrast, MC57G target cells infected with a vaccinia virus expressing the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) glycoprotein were killed efficiently by spleen cells prepared 8 days after infection of a C57BL/6 mouse (H-2b) with LCMV (data not shown). Thus, the observed in vitro cytolytic activity of mouse brain lymphocytes toward BDV p40-expressing target cells was MHC I-restricted. Consistent with this observation, in vitro depletion of CD8+ T cells from brain lymphocyte

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดำเนินการกับแอนติบอดีโมโนเมาส์กับ BDV p40 (38/17C 1) ในการเจือจาง 1: 200 ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียด ผูกแอนติบอดีถูกตรวจพบโดยการตาม peroxidase ABC Vectastain อีชุด (ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และ counterstained กับ hematoxylinในทดสอบ Cytotoxicity หลอดของ Lymphocytes สมอง สมอง lymphocytes ถูกแยกเป็นอธิบาย (21,25), และกิจกรรมของ cytolytic ถูกกำหนด โดยการทดสอบปล่อย 51Cr มาตรฐาน เซลล์เป้าหมายได้เตรียมดัง: 5 × 106 L929 (H - 2k) หรือ MC57G (H-2b) เซลล์ใน 0.5 ml ของ DMEM/10% FCS มีชื่อในระบบกันสะเทือนกับ μCi 250 ของ 51Cr (Amersham Pharmacia) สำหรับ h 2 ที่ 37 องศาเซลเซียส หลังสาม washings เซลล์ติดเชื้อไวรัส recombinant vaccinia ระบุที่มากมายหลายหลากของเชื้อ 5 h. 2-4 เซลล์เป้าหมายได้ incubated กับเซลล์ effector h 6 ที่ 37° C และมีคำนวณเปอร์เซ็นต์ของ 51Cr เฉพาะรุ่นส่วน SectionNext ก่อนหน้านี้ผลลัพธ์การลดลงของชั่วคราวของ CD8 + และ CD4 + T เซลล์ย่อยใน Vivo เริ่มมีอาการของความล่าช้าของ BDV เกิดจากโรคระบบประสาทเราแสดงเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่า β2 microglobulin น่าพิศวงหนู (β2m−) ขาดเซลล์ CD8 + T ทำงานไม่พัฒนา CNS อักเสบและโรคระบบประสาทหลังจากติดเชื้อกับ BDV เป็น newborns (22) เนื่องจาก β2m− หนูมีไหวสามารถเพิ่มเติมของระบบภูมิคุ้มกัน (26), เราต้องการยืนยันความสำคัญของเซลล์ CD8 + T ในพยาธิกำเนิดของโรคเกิดจาก BDV โดยทดลองในสัตว์ทดลองลดลงของ หนู MRL ทารกติดเชื้อได้รับการรักษาที่ 15 หรือ 18 วันอายุกับมาบกับ CD8 ตามบริหารแอนติบอดีสอง 3-4 วันต่อมา เซลล์ไหลแสดงว่า เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD8 + T หลุดต่ำกว่า 1% ของ lymphocytes เลือดรวมอุปกรณ์ต่อพ่วง ด้วย postadministration 5 วันของยาแรกของแอนติบอดีต่อต้าน CD8 และยังคงต่ำกว่า 1% น้อย 16 วัน (ข้อมูลไม่แสดง) จุดต่อมาเวลา ระดับของเซลล์ CD8 + T เพิ่มขึ้นอีก แต่ไม่ถึงระดับปกติภายใน 35 วัน ของหนูต่อต้าน-CD8-รักษาที่เก้าจากทดลองอิสระสาม เจ็ด (78%) ไม่ได้แสดงสัญญาณตรวจโรคระบบประสาทจนถึงสัปดาห์ที่ 7 อายุ ในขณะที่ทั้งหมด 9 ควบคุมสัตว์พัฒนาโรคระบบประสาทอย่างรุนแรงระยะเวลา และต้องมีการเสียสละ (ตาราง 1) เริ่มมีอาการของโรคในสองแอนติบอดีรักษาสัตว์ที่พัฒนาโรคล่าช้า โดยประมาณ 12 วัน สองกรณีนี้เกิดขึ้นในการทดลองเริ่มต้นในการรักษาที่มี CD8 ต้านแอนติบอดีวัน 18 แทนวัน 15 ในอื่น ๆ ทดลอง เพิ่มความเป็นไปได้ที่ช่วงเวลาที่ถูกต้องของแอนติบอดีรักษาสำคัญสำคัญสำหรับป้องกันโรค 2•ในหน้าต่างนี้•ในหน้าต่างใหม่ตารางที่ 1T เซลล์ในสัตว์ทดลองลดลงของความล่าช้า Borna โรคในหนูเรายังกำหนดสัดส่วนของเซลล์ CD4 + T BDV เกิดโรค โดยการลดลงของในสัตว์ทดลองของย่อย T เซลล์นี้ เป็นเรื่องน่าสนใจ แปดเก้าหนูพร่องของเซลล์ CD4 + T ไม่ได้พัฒนาโรคภายในช่วงเวลาปกติของสัปดาห์ที่ 4 ถึง 7 postinfection (ตาราง 1), การแสดงบทบาทสำคัญของเซลล์ CD4 + T ในการ immunopathological ขึ้น อีก จุดเริ่มต้นของการลดลงของวันที่ 18 ที่เป็นผลในการป้องกันที่สมบูรณ์ ดังนั้น การลดลงของชั่วคราวของเซลล์ CD8 + หรือ CD4 + T ปรึกษาป้องกันชั่วร้าย BDV-induceddisease ระบุว่า ทั้งย่อยเซลล์ทีสำคัญจำเป็นสำหรับการพัฒนาของโรค Borna ในหนู MRLInfiltrates สมอง lymphocytic ประกอบด้วยสัดส่วนที่สูงของเซลล์เปิด CD8 + T ประมาณ 3 × 106 lymphocytes ทำงานอาจมีการกู้คืนจากสมองของหนู MRL ที่จุดสูงสุดของการเกิดโรค เซลล์ CD8 + T ในเหล่านี้เตรียมปล้นสะดมเซลล์ CD4 + T โดยตัวของ 2.3 ในขณะที่เลือดอุปกรณ์ต่อพ่วง และม้ามอัตราส่วนนี้ไม่เกี่ยวกับ 0.5 วิเคราะห์เครื่องหมายเปิดใช้งานของเซลล์ CD8 + T จากสมองของสัตว์ป่วยเปิดเผยขึ้นระเบียบของ CD25 (ตัวรับ IL-2) และ CD69 (เครื่องหมายเปิดใช้งานเนิ่น ๆ) นิพจน์ (Fig. 1 A และ C) และควบคุมการลงของ CD62L (L-selectin) (Fig. 1B) ของ CD49d (integrin α4) ในสมองมา CD8 + T เซลล์อยู่เพียงเล็กน้อยสูงกว่าเซลล์ CD8 + T จากม้าม (ข้อมูลไม่แสดง) นี้รูปแบบของพื้นผิวเครื่องหมายนิพจน์ระบุสถานะเปิดใช้งานของเซลล์ CD8 + T กู้คืน เซลล์ CD4 + T มาสมองยังถูกใช้งานเป็นตัดสินค่าเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ CD69 (Fig. 1C), และการลดลงของ CD62L (Fig. 1B)รูปที่ 1ค่าของเครื่องหมายการเปิดใช้งานบนสมองมาเซลล์ CD8 + T ติดไวรัส neonatally MRL หนูได้เสียสละที่สูงสุดของโรคระบบประสาท และสมอง lymphocytes ถูกแยก เชื้อตรงอายุ MRL เมาส์ทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคสำหรับม้าม lymphocytes Lymphocytes ถูกสี ด้วยมาบ FITC ป้องกัน CD8 หรือ FITC ป้องกัน CD4 และ biotinylated เฉพาะสำหรับ CD25 (ตัวรับ IL-2) (A) CD62L (L selectin) (B) หรือ CD69 (เนิ่น ๆ เรียกใช้ตรวจหา) (C) ตาม ด้วย streptavidin-R -PE ตรวจสอบ ดำเนินการทดลองอิสระสาม และแสดงจุดผืนจากพนักงานทดลองหนึ่ง (ซ้าย) วิเคราะห์ของ lymphocytes ม้ามจากเมาส์ขำน่า (ขวา) Lymphocytes ที่สมองได้รับ เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD4 + และ CD8 + T ค่าบวกสำหรับการทำเครื่องหมายระบุได้ใน quadrants บนสมอง Lymphocytes แสดง CD8 + T เซลล์ขึ้นอยู่กับและเอ็มเอชซีฉันจำกัด Cytotoxic ส่วนใหญ่กับเซลล์เป้าหมายแสดง p40 Nucleoprotein ไวรัสเพื่อกำหนดกิจกรรม cytolytic ศักยภาพของสมองมาเซลล์ CD8 + T เราทำ assays cytotoxicity mediated เซลล์เพาะเลี้ยงบนเซลล์เป้าหมายตรง haplotype แสดง BDV antigens เนื่องจาก BDV ไม่คูณพร้อมในเซลล์เมาส์ เราทำงานไวรัส recombinant vaccinia ที่รหัส BDV p40 โปรตีน p24 หรือ gp94 (p57) จะเมาส์ L929 เซลล์ (H - 2k) ที่แล้ว ใช้เป็น cytotoxic T lymphocyte (CTL) เป้าหมาย Phenotype ของไวรัส recombinant vaccinia ต่าง ๆ ได้รับการยืนยัน โดย immunoprecipitation ทดลองใช้ monospecific antisera BDV โปรตีนต่าง ๆ และ lysates ติดไวรัส CV-1 เซลล์ (ข้อมูลไม่แสดง) เมื่อเตรียม lymphocyte สมองสดแยกจาก heavilydiseased MRL หนูใช้เป็นเบสไม่ทราบใน restimulation กิจกรรม cytotoxic แข็งแรงกับเซลล์ L929 p40 กำลังถูกสังเกต (Fig. 2A) ในทางตรงกันข้าม L929 เซลล์แสดง gp94 (p57) ไม่ได้ lysed ระดับสูงอย่างมีนัยสำคัญกว่า L929 เซลล์ติดเชื้อไวรัส vaccinia แสดงโปรตีนเกี่ยวข้องกับ ในขณะที่การ lysis ของ p24 แสดงเซลล์ถึงระดับกลาง (Fig. 2A) เป้าหมายการเตรียมเซลล์ติดเชื้อไวรัส recombinant vaccinia ต่าง ๆ ถูก lysed ในกรณีคล้ายกัน โดยเฉพาะไวรัส vaccinia CTLs ในขณะที่เซลล์ติดเชื้อ mock L929 ไม่ฆ่า (Fig. 2B) , ระบุว่า เป้าหมายต่างสังเกตเซลล์ lysis โดยเฉพาะ BDV CTLs ไม่เนื่องจากองศาที่แตกต่างกันของเชื้อ vacciniavirus (Fig. 2B) เตรียม lymphocyte สมองจากเส้น CBA/J หนู ต้องใช้เมาส์อีก ด้วย H - 2k haplotype ที่พัฒนากิจกรรม cytolytic สูงโรคระบบประสาทหลังจากติดเชื้อ BDV ด้วยความถี่กลาง (22), นอกจากนี้ยัง พบกับแสดง p40 L929 เซลล์ (Fig. 2C) เตรียมสมอง lymphocyte จากหนู MRL ขำน่าอยู่จำนวน lymphocytes ต่ำมากเท่านั้น จำลองเตรียมกู้จากสมองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าไม่มีผลต่อ lytic เซลล์เป้าหมาย (Fig. 2D) ต่างจากเตรียม lymphocyte สมองจากสัตว์ป่วยที่พบ lysis เฉพาะแสดง p40 L929 เซลล์ เซลล์ effector เตรียมจาก spleens ของพวกเขาแสดงให้เห็นว่าไม่มีกิจกรรมดังกล่าว (Fig. 2D)รูปที่ 2Ex vivo CTL กิจกรรมของ lymphocytes สมองจากหนูที่ติดเชื้อ BDV จะตรงกับ p40 nucleoprotein ไวรัสส่วนใหญ่ Lymphocytes สมองหนู MRL ป่วยรุนแรง (A) หรือเฉพาะเหล่า CTLs (B) ถูกใช้เป็นเบสบนเซลล์เป้าหมายติดเหล่า L929 แสดงระบุ recombinant BDV โปรตีนหรือโปรตีนควบคุมความเกี่ยวข้อง วิเคราะห์ (C) CTL กับ lymphocytes จากสมองของเมาส์ severelydiseased J CBA (H - 2k) (D) lymphocytes ม้ามของหนู MRL ขาดเฉพาะ BDV CTLs. Effector เซลล์จากสมอง หรือ spleens ใดรุนแรงป่วย ติด BDV หรือสุขภาพติด mock MRL หนูได้ incubated กับเซลล์เป้าหมาย L929 แสดง BDV p40 เตรียม lymphocyte สมองจากเชื้อ MRL หนูมักจะประกอบด้วยน้อยกว่า 105 lymphocytes พวกเขาถูก resuspended ในไดรฟ์ข้อมูลเดียวกันของตัวกลางเป็น lymphocytes จากสมองของสัตว์ป่วย และใช้ใน CTL assays ทั้งเตรียมเซลล์จำนวนมากเหมือนกัน (E) จำกัดเอ็มเอชซีของ CTL กิจกรรม เซลล์เป้าหมายมีเซลล์ MC57G (H-2b) หรือเซลล์ L929 (H - 2k) ติดเชื้อไวรัส vaccinia ระบุ Effector เซลล์จากสมองของหนู MRL (H - 2k) กับโรค Borna อย่างรุนแรงได้ (F) การลดลงของเฉพาะของ CD8 + T เซลล์จากสมอง lymphocyte เตรียม abolishes กิจกรรม CTL เตรียม lymphocyte สมองประกอบด้วย 2 × 106 lymphocytes/ml ถูก incubated ใน 30 นาทีที่ 4° C มี 107 เม็ดแม่เหล็กเคลือบ ด้วยแอนตี้ต่อต้าน CD4 หรือ CD8 ป้องกัน (Dynal ดีคอ NY) เพื่อทำการย่อยเซลล์ทีเกี่ยวข้อง ออก lymphocytes complexed กับเม็ดแม่เหล็ก และเซลล์ที่เหลือใช้เป็นเบสใน assays cytotoxicity มาตรฐาน ขาด lysis ของเซลล์เป้าหมายมักจะมีน้อยกว่า 20% ยกเว้นใน F ที่เป็น 40% ลงจุด lysis เฉพาะกับอัตราส่วน effector--เป้าหมายเซลล์ที่ระบุไม่มี lysed เซลล์ MC57G (H-2b) ติด p40 เหล่าโดยเฉพาะ โดย lymphocytes ในสมองจากเส้นหนู MRL แม้ว่าเตรียมกันได้ lyse แสดง p40 L929 เซลล์ (Fig. 2E) โดยคมชัด MC57G เป้าหมายเซลล์ติดเชื้อไวรัส vaccinia แสดงไกลโคโปรตีนไวรัส (LCMV) lymphocytic choriomeningitis ถูกฆ่าตายได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยเซลล์ม้ามที่เตรียมไว้ 8 วันหลังจากการติดเชื้อของเมาส์ C57BL/6 (H-2b) กับ LCMV (ไม่ได้แสดงข้อมูล) จึง พบใน cytolytic กิจกรรมของ lymphocytes สมองเมาส์ไปทาง BDV p40-แสดงเซลล์เป้าหมายเอ็มเอชซีฉันจำกัด สอดคล้องกับการสังเกตนี้ ในหลอดลดลงของเซลล์ CD8 + T lymphocyte สมองจาก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดำเนินการกับเมาส์โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน BDV P40 (38 / 17C1) ใน 1: 200 เจือจางค้างคืนที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางซักผ้า, แอนติบอดีผูกพันที่ตรวจพบโดยใช้ peroxidase ตาม Vectastain-ยอดชุดเอบีซี (ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตและ counterstained กับ hematoxylin.
ในหลอดทดลองพิษ Assay ของสมองเซลล์เม็ดเลือดขาว. lymphocytes สมองที่แยกได้ตามที่อธิบายไว้ (21 25) และกิจกรรม cytolytic ของพวกเขาถูกกำหนดโดยมาตรฐานการทดสอบปล่อย 51Cr เซลล์เป้าหมายได้จัดทำดังต่อไปนี้: 5 × 106 L929 (H-2k) หรือ MC57G (H-2b) เซลล์ใน 0.5 มิลลิลิตร DMEM / 10% FCS ถูกระบุในการระงับ 250? Ci ของ 51Cr (Amersham Pharmacia) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียส หลังจากสามซักเซลล์มีการติดเชื้อไวรัสที่ระบุวัคซีนไข้ทรพิษที่หลายหลากของการติดเชื้อจาก 5 2-4 ชั่วโมง เซลล์เป้าหมายถูกบ่มกับเซลล์ Effector 6 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและร้อยละของการเปิดตัวเฉพาะ 51Cr ที่คำนวณได้. ก่อนหน้ามาตรามาตราผลพร่องชั่วคราว CD8 + และ CD4 + T เซลล์ในร่างกายซัล่าช้าของการเริ่ม BDV-ชักนำให้เกิดความผิดปกติของระบบประสาทเราแสดงให้เห็นเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่าหนูที่น่าพิศวงβ2-microglobulin (β2m-) ขาดการทำงานเซลล์ CD8 + T ไม่พัฒนาระบบประสาทส่วนกลางอักเสบและความผิดปกติทางระบบประสาทหลังจากการติดเชื้อ BDV เป็นทารกแรกเกิด (22) เพราะหนูβ2m-มีความบกพร่องที่เพิ่มขึ้นของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกาย (26) เราต้องการที่จะยืนยันความเกี่ยวข้องของเซลล์ CD8 + T ในการเกิดโรคของโรค BDV-ที่เกิดจากการทดลองในร่างกายพร่อง ทารกแรกเกิดที่ติดเชื้อหนู MRL ได้รับการรักษาอยู่ที่ 15 หรือ 18 วันนับจากวันที่มีอายุ mAb กับ CD8 ตามด้วยการบริหารแอนติบอดีที่สอง 3-4 วันต่อมา ระบุโฟว่าร้อยละของเซลล์ CD8 + T ได้ลดลงต่ำกว่า 1% ของเซลล์เม็ดเลือดขาวในเลือดโดยรวม 5 วัน postadministration ของเข็มแรกของแอนติบอดีต่อต้าน CD8 และยังคงอยู่ต่ำกว่า 1% เป็นเวลาอย่างน้อย 16 วัน (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ที่จุดเวลาต่อมาระดับของเซลล์ CD8 + T เพิ่มขึ้นอีกครั้ง แต่ยังไม่ถึงระดับปกติของพวกเขาภายใน 35 วัน เก้าหนูต่อต้าน CD8 รับการรักษาจากการทดลองสามอิสระเจ็ด (78%) ไม่ได้แสดงอาการของโรคที่ตรวจพบทางระบบประสาทจนถึงวันที่ 7 สัปดาห์ของอายุในขณะที่ทั้งเก้าสัตว์ควบคุมการพัฒนาโรคทางระบบประสาทอย่างรุนแรงภายในระยะเวลานี้และมีการ ต้องเสียสละ (ตารางที่ 1) เริ่มมีอาการของโรคในสัตว์ทั้งสองแอนติบอดีรับการรักษาที่พัฒนาโรคถูกเลื่อนออกไปประมาณ 12 วัน ทั้งสองกรณีที่เกิดขึ้นในการทดลองที่ 2 ซึ่งการรักษาด้วยแอนติบอดีต่อต้าน CD8 เริ่มต้นในวันที่ 18 แทน 15 วันในขณะที่อีกสองการทดลองเพิ่มความเป็นไปได้ว่าเวลาที่ถูกต้องของการรักษาแอนติบอดีเป็นสิ่งที่สำคัญในการป้องกันโรค. •ใน หน้าต่างนี้•ในหน้าต่างใหม่ตารางที่ 1 ในร่างกายพร่อง T เซลล์ล่าช้าโรค Borna ในหนูนอกจากนี้เรายังมุ่งมั่นที่มีส่วนร่วมของเซลล์ CD4 + T เพื่อโรค BDV-ที่เกิดจากการสูญเสียในร่างกายของเซตนี้ทีเซลล์ ที่น่าสนใจแปดเก้าหนูหมดลงของเซลล์ CD4 + T ไม่ได้ก่อให้เกิดโรคในช่วงเวลาปกติของ 4-7 สัปดาห์ postinfection (ตารางที่ 1) แสดงให้เห็นบทบาทที่สำคัญของเซลล์ CD4 + T ในกระบวนการ immunopathological อีกครั้งที่จุดเริ่มต้นของการสูญเสียในวันที่ 18 มีผลในการป้องกันไม่สมบูรณ์ ดังนั้นการสูญเสียชั่วคราวของ CD8 + หรือเซลล์ CD4 + T หารือคุ้มครองชั่วคราวกับร้ายแรง BDV-induceddisease แสดงให้เห็นว่าทั้งสองส่วนย่อยทีเซลล์ที่สำคัญเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาของโรค Borna ในหนู MRL. Lymphocytic สมองแทรกตัวเข้าไปในบรรจุสัดส่วนที่สูงของ Activated CD8 + T เซลล์. เกี่ยวกับ 3 × 106 เซลล์เม็ดเลือดขาวทำงานได้สามารถกู้คืนจากสมองของหนู MRL ที่จุดสูงสุดของการเกิดโรค เซลล์ CD8 + T ในการเตรียมการเหล่านี้มากกว่าเซลล์ CD4 + T โดยปัจจัยที่ 2.3 ขณะที่ในเลือดและในม้ามอัตราส่วนนี้เป็นประมาณ 0.5 การวิเคราะห์ของตัวบ่งชี้กระตุ้นการทำงานของเซลล์ CD8 + T จากสมองของสัตว์ที่เป็นโรคเปิดเผยขึ้นระเบียบของ CD25 (IL-2 รับ) และ Cd69 (เครื่องหมายยืนยันการใช้งานในช่วงต้นมาก) การแสดงออก (รูป. 1 และ C) และลงระเบียบของ CD62L (L -selectin) (รูปที่ 1B.) การแสดงออกของ CD49d (integrin α4) ในสมองที่ได้จากเซลล์ CD8 + T เป็นเพียงเล็กน้อยสูงกว่าเซลล์ CD8 + T จากม้าม (ไม่ได้แสดงข้อมูล) การทำแบบนี้ในการแสดงออกเครื่องหมายพื้นผิวที่ระบุรัฐเปิดใช้งานของการกู้คืนเซลล์ CD8 + T สมองที่ได้จากเซลล์ CD4 + T นอกจากนี้ยังได้เปิดใช้งานในขณะที่การตัดสินโดยการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ Cd69 (รูป. 1C) และการแสดงออกของ CD62L ลดลง (รูปที่ 1B.). รูปที่ 1 การแสดงออกของเครื่องหมายยืนยันการใช้งานในสมองที่ได้จากเซลล์ CD8 + T Neonatally หนู MRL ที่ติดเชื้อถูกเสียสละที่จุดสูงสุดของการเกิดโรคทางระบบประสาทและเซลล์เม็ดเลือดขาวในสมองถูกแยก ที่ไม่ติดเชื้ออายุที่จับคู่หนู MRL ทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคเซลล์เม็ดเลือดขาวม้าม เซลล์เม็ดเลือดขาวที่ถูกย้อมด้วยการต่อต้าน CD8-FITC หรือต่อต้าน CD4-FITC และ biotinylated mAb ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ CD25 (IL-2 รับ) (A) CD62L (L-selectin) (ข) หรือ Cd69 (แอนติเจนยืนยันการใช้งานเร็วมาก) ( C) ตามด้วย streptavidin-R-PE การตรวจสอบ สามทดลองที่เป็นอิสระและได้ดำเนินการแปลงจุดจะปรากฏขึ้นจากการทดลองที่เป็นตัวแทนหนึ่ง (ซ้าย) การวิเคราะห์ของเซลล์เม็ดเลือดขาวม้ามจากเมาส์ไร้เดียงสา (ขวา) lymphocytes สมองมา ร้อยละของ CD4 + และเซลล์ CD8 + T บวกสำหรับเครื่องหมายที่ระบุจะได้รับใน quadrants บน. สมองเซลล์เม็ดเลือดขาวแสดง CD8 + T เซลล์ขึ้นอยู่กับและ MHC I-ถูก จำกัด Cytotoxic กิจกรรมส่วนใหญ่ต่อต้านเซลล์เป้าหมายแสดง p40 นิวคลีโอไวรัส. การตรวจสอบที่มีศักยภาพกิจกรรม cytolytic ของสมองที่ได้จากเซลล์ CD8 + T เราดำเนินการตรวจในหลอดทดลองพิษ cell-mediated ใน haplotype ที่จับคู่เซลล์เป้าหมายแสดงแอนติเจน BDV เพราะ BDV ไม่คูณพร้อมในเซลล์เมาส์เราจ้างไวรัสวัคซีนไข้ทรพิษว่ารหัสสำหรับโปรตีน p40 BDV, p24 หรือ gp94 (P57) ที่จะติดเชื้อเมาส์ L929 (H-2k) เซลล์ที่ถูกนำมาใช้นั้นเป็นพิษต่อเซลล์เม็ดเลือดขาว T (CTL ) เป้าหมาย ฟีโนไทป์ของไวรัสวัคซีนไข้ทรพิษต่างๆได้รับการยืนยันโดยการทดลองใช้ immunoprecipitation antisera monospecific กับโปรตีน BDV ต่างๆและ lysates ของที่ติดเชื้อ CV-1 เซลล์ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เมื่อเตรียมสดใหม่แยกเม็ดเลือดขาวในสมองจากหนู MRL heavilydiseased ถูกนำมาใช้เป็นเอฟเฟคได้โดยไม่ต้องก่อนในหลอดทดลอง restimulation กิจกรรมพิษที่แข็งแกร่งกับ P40-แสดง L929 เซลล์ก็สังเกตเห็น (รูป. 2A) ในทางตรงกันข้าม L929 เซลล์แสดง gp94 (P57) ไม่ได้ถูก lysed อย่างมีนัยสำคัญในระดับที่สูงกว่า L929 เซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสวัคซีนแสดงโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้องในขณะสลายของเซลล์ p24-แสดงถึงระดับกลาง (รูป. 2A) การเตรียมเซลล์เป้าหมายติดเชื้อไวรัสวัคซีนไข้ทรพิษต่าง ๆ lysed ในระดับที่คล้ายกันโดยเฉพาะ CTLs วัคซีนไวรัสในขณะที่จำลองการติดเชื้อ L929 เซลล์ไม่ได้ถูกฆ่าตาย (รูป. 2B) แสดงให้เห็นว่าแตกต่างตั้งข้อสังเกตในการสลายเซลล์เป้าหมายโดย BDV- CTLs เฉพาะเจาะจงไม่ได้เนื่องจากองศาที่แตกต่างของการติดเชื้อ vacciniavirus (รูป. 2B) เตรียมสมองเม็ดเลือดขาวจากหนูที่เป็นโรค CBA / J สายพันธุ์อื่นที่มีเมาส์ haplotype H-2k ที่พัฒนาความผิดปกติทางระบบประสาทหลังจากการติดเชื้อ BDV กับความถี่กลาง (22) นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่ากิจกรรม cytolytic สูงกับ P40-L929 แสดงเซลล์ (รูป. 2C) เตรียมสมองเม็ดเลือดขาวจากหนู MRL ไร้เดียงสามีเพียงตัวเลขที่ต่ำมากของเซลล์เม็ดเลือดขาว การเตรียมการจำลองการกู้คืนจากสมองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าไม่มีผลกระทบ lytic ในเซลล์เป้าหมาย (รูป. 2D) ซึ่งแตกต่างจากการเตรียมเม็ดเลือดขาวในสมองจากสัตว์ที่เป็นโรคที่แสดงให้เห็นสลายเฉพาะของ P40-แสดง L929 เซลล์เซลล์ Effector เตรียมจากม้ามของพวกเขาแสดงให้เห็นว่าไม่มีกิจกรรมดังกล่าว (รูป. 2D). รูปที่ 2 ex vivo กิจกรรม CTL ของเซลล์เม็ดเลือดขาวในสมองจากหนู BDV-ติดเชื้อเป็นผู้กำกับ ส่วนใหญ่ต่อต้านไวรัสนิวคลีโอ p40 lymphocytes สมองจากหนูที่เป็นโรครุนแรง MRL (A) หรือ CTLs VV เฉพาะ (B) ถูกนำมาใช้เป็นเอฟเฟคใน VV-L929 ติดเชื้อเซลล์เป้าหมายแสดงที่ระบุโปรตีนหรือโปรตีน BDV การควบคุมที่ไม่เกี่ยวข้อง (C) ในการตรวจ CTL กับเซลล์เม็ดเลือดขาวจากสมองของ severelydiseased CBA / J (H-2k) เมาส์ (D) เซลล์เม็ดเลือดขาวม้ามของหนู MRL ขาด CTLs BDV-ที่เฉพาะเจาะจง เซลล์ Effector จากสมองหรือม้ามอย่างใดอย่างหนึ่งที่เป็นโรครุนแรง BDV-ติดเชื้อหรือมีสุขภาพดีหนู MRL จำลองที่ติดเชื้อถูกบ่มกับ L929 เซลล์เป้าหมายแสดง BDV p40 เตรียมสมองเม็ดเลือดขาวจากหนู MRL ที่ไม่ติดเชื้อมักจะมีน้อยกว่า 105 เซลล์เม็ดเลือดขาว พวกเขาถูก resuspended ในปริมาณเดียวกันของกลางเป็นเซลล์เม็ดเลือดขาวจากสมองของสัตว์ที่เป็นโรคและปริมาณที่เหมือนกันของทั้งสองเตรียมเซลล์ถูกนำมาใช้ในการตรวจ CTL (E) ข้อ จำกัด MHC ของกิจกรรม CTL เซลล์เป้าหมายมีทั้งเซลล์ MC57G (H-2b) หรือ L929 เซลล์ (H-2k) ที่ติดเชื้อไวรัสวัคซีนระบุ เซลล์ Effector มาจากสมองของ MRL (H-2k) หนูที่เป็นโรค Borna รุนแรง (F) พร่องจำเพาะของเซลล์ CD8 + T จากการเตรียมเม็ดเลือดขาวในสมองยุบกิจกรรม CTL เตรียมสมองเม็ดเลือดขาวที่มี 2 × 106 เซลล์เม็ดเลือดขาว / ml ถูกบ่มนาน 30 นาทีที่ 4 ° C ที่มี 107 เม็ดแม่เหล็กเคลือบด้วยการต่อต้านการตรวจ CD4 หรือแอนติบอดีต่อต้าน CD8 (Dynal คอใหญ่นิวยอร์ก) ที่จะหมดสิ้นลงตามลำดับเซลล์ย่อย T เซลล์เม็ดเลือดขาว complexed เพื่อลูกปัดแม่เหล็กถูกถอดออกและเซลล์ที่เหลือถูกนำมาใช้เป็นเอฟเฟคในการตรวจพิษมาตรฐาน สลายโดยธรรมชาติของเซลล์เป้าหมายมักจะเป็นน้อยกว่า 20% ยกเว้นใน F ที่มันเป็น 40% สลายเฉพาะกับพล็อตที่ระบุ Effector เพื่อเป้าหมายเซลล์อัตราส่วน. เซลล์ MC57G (H-2b) ติดเชื้อ VV-P40 ไม่ได้ lysed โดยเฉพาะ lymphocytes สมองจากหนู MRL โรคแม้ว่าการเตรียมเดียวกันก็สามารถที่จะ Lyse p40- แสดง L929 เซลล์ (รูป. 2E) ตรงกันข้าม MC57G เซลล์เป้าหมายติดเชื้อไวรัสวัคซีนแสดงไวรัส choriomeningitis lymphocytic (LCMV) ไกลโคโปรตีนที่ถูกฆ่าตายอย่างมีประสิทธิภาพโดยเซลล์ม้ามเตรียม 8 วันหลังจากการติดเชื้อของ C57BL / 6 เมาส์ (H-2b) กับ LCMV (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ดังนั้นการปฏิบัติในกิจกรรม cytolytic การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของเซลล์เม็ดเลือดขาวที่มีต่อสมองเมาส์ BDV-P40 แสดงเซลล์เป้าหมายเป็น MHC I-จำกัด สอดคล้องกับข้อสังเกตนี้ในการสูญเสียการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของเซลล์ CD8 + T จากสมองเม็ดเลือดขาว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดำเนินการกับโมโนโคลนอลแอนติบอดีเมาส์ bdv ดำ ( 38 / 17c1 ) ใน 1:200 เจือจางค้างคืนที่ 4 องศา หลังจากล้างอย่างละเอียด พบผูกพันแอนติบอดีโดยใช้ชุด ABC มียอด vectastain ตาม ( ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์ ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และ counterstained กับย้อม .
ในหลอดทดลองเซลล์ของเม็ดเลือดขาวโดยสมอง .

สมองถูกแยกไว้ ( 21,25 ) และกิจกรรม cytolytic ของพวกเขาถูกกำหนดโดยมาตรฐาน 51cr ปล่อยตามลำดับ เซลล์เป้าหมายเตรียมดังนี้ 5 × 106 l929 ( h-2k ) หรือ mc57g ( h-2b ) เซลล์ใน 0.5 มิลลิลิตร / dmem 10% FCS ได้ติดป้ายแขวนกับ 250 μ CI ของ 51cr ( ที่มุ่งมั่น ) 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศา หลังจาก washings สาม ,เซลล์ติดเชื้อ ( ไวรัส recombinant vaccinia ที่หลายหลากของการติดเชื้อ 5 2 – 4 ชั่วโมงและบ่มเซลล์กับเซลล์เป้าหมาย ( 6 H ที่ 37 ° C และเปอร์เซ็นต์ของการปล่อย 51cr เฉพาะเป็นค่า


sectionnext ก่อนหน้าส่วนผลชั่วคราวและการพร่องของ CD8 CD4 ทีเซลล์ย่อยใน โดยการโจมตีของโรคทางระบบประสาทและความล่าช้า bdv
.เราพบเมื่อเร็ว ๆนี้ว่า บีตา 2-microglobulin น็อกหนู ( บีตา 2 − ) ขาดหน้าที่ CD8 T เซลล์ไม่พัฒนา หรือ การอักเสบ และโรคทางระบบประสาทหลังการติดเชื้อกับ bdv เป็นทารกแรกเกิด ( 22 ) เพราะหนูมีความบกพร่องบีตา 2 −เพิ่มเติมของระบบภูมิคุ้มกัน ( 26 )เราต้องการยืนยันความเกี่ยวข้องของ CD8 T เซลล์ในพยาธิกำเนิดของโรค โดยฤทธิ์ในการกระตุ้น bdv การทดลอง ทารกแรกเกิดติดเชื้อ เอ็มอาร์ไอ หนูได้รับการรักษาที่ 15 หรือ 18 วันของอายุกับแอนติบอดีต่อ CD8 ตามการบริหาร ( ที่สอง 3 – 4 วันต่อมาเครื่องนับเซลล์ พบว่า ร้อยละ CD8 T cells ได้ลดลงต่ำกว่า 1 % ของเม็ดเลือดขาวลิมโฟไซต์โดยรวม 5 วัน postadministration ของปริมาณแรกของ anti-cd8 แอนติบอดี และยังคงต่ำกว่า 1 % เป็นเวลาอย่างน้อย 16 วัน ( ข้อมูลไม่แสดง ) ที่จุดภายหลัง , ระดับของ CD8 T เซลล์เพิ่มอีก แต่ไม่ได้ถึงระดับปกติของพวกเขาภายใน 35 วันของเก้า anti-cd8-treated หนูจากสามการทดลองที่เป็นอิสระ , เจ็ด ( 78% ) ไม่แสดงอาการของโรคทางระบบประสาทได้ถึง 7 สัปดาห์ของอายุ มีทั้งหมดเก้าควบคุมสัตว์ที่พัฒนารุนแรงผิดปกติทางสมอง ในช่วงเวลานี้ และต้องเสียสละ ( ตารางที่ 1 ) โรคที่เกิดในการรักษาสัตว์ที่เป็นโรคสองล่าช้า ประมาณ 12 วันทั้ง 2 กรณีเกิดขึ้นในการทดลองที่ 2 ซึ่งในการรักษาด้วย anti-cd8 แอนติบอดีที่เริ่มต้นในวันที่ 18 แทน 15 วันในอีกสองการทดลองเพิ่มความเป็นไปได้ที่เวลาที่ถูกต้อง การรักษามีความสําคัญสําคัญสําหรับป้องกันโรค ในหน้าต่างนี้
-
- ในโต๊ะต่าง
1
t ชนิดใหม่ เซลล์ของความล่าช้าบอร์นาโรคในหนู
เราพบผลงานของ CD4 T เซลล์และฤทธิ์ในการรักษาโรค โดย bdv ของทีเซลล์ย่อย . น่าสนใจ แปด เก้า หนูหมด CD4 ทีเซลล์ไม่ได้พัฒนาโรคในเวลาปกติในช่วง 4 ถึง 7 สัปดาห์ postinfection ( ตารางที่ 1 ) ซึ่งเป็นบทบาทที่สำคัญของ CD4 ทีเซลล์ในกระบวนการ immunopathological . อีกครั้งเริ่มในวันที่ 18 ของการมีผลในการป้องกันที่ไม่สมบูรณ์ ดังนั้น การชั่วคราวของ CD8 หรือ CD4 เซลล์ T ) คุ้มครองชั่วคราวกับร้ายแรง bdv induceddisease ระบุว่า ทั้งสาขาทีเซลล์ย่อยเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาของโรค บอร์นาใน เอ็มอาร์ไอสมองหนู
วิถีแทรกซึมประกอบด้วยสัดส่วนสูงกระตุ้นเซลล์ CD8 T .

3 × 106 ได้เม็ดเลือดขาวอาจจะหายจากสมองของหนู เอ็มอาร์ไอ ที่จุดสูงสุดของโรค เซลล์ที CD4 CD8 ในการเตรียมเหล่านี้มากกว่าเซลล์ T โดยปัจจัยที่ 2.3 ในขณะที่ในกระแสเลือด และม้าม อัตราส่วนนี้คือประมาณ 0.5การวิเคราะห์การเปิดใช้งานเครื่องหมายเซลล์ CD8 T จากสมองของสัตว์เป็นโรคเปิดเผยขึ้นกฎระเบียบของ cd25 ( IL-2 receptor ) และมี ( เช้ามาก การเปิดใช้งานเครื่องหมาย ) แสดง ( รูปที่ 1 A และ C ) และ down-regulation ของ cd62l ( l-selectin ) ( รูปที่ 1A ) การแสดงออกของ cd49d ( อินทีกรินα 4 ) brain-derived CD8 T เซลล์เพียงเล็กน้อยสูงกว่าเซลล์ CD8 T จากม้าม ( ข้อมูลไม่แสดง )รูปแบบของการแสดงออกของพื้นผิวแสดงเครื่องหมายถูกเปิดใช้งานสถานะของการกู้คืน CD8 T เซลล์ สมองและเซลล์ที CD4 ยังไม่เปิดใช้งานเป็นตัดสินโดยมีการเพิ่มการแสดงออกของมี ( ภาพที่ 1c ) และลดลงการแสดงออกของ cd62l ( รูปที่ 1A ) .
รูปที่ 1
การแสดงออกของการเปิดใช้งานเครื่องหมายบน brain-derived เซลล์ CD8 T .neonatally ติดเชื้อ เอ็มอาร์ไอ หนูเสียสละที่จุดสูงสุดของโรคทางระบบประสาท , สมองถูกทำลายและถูกแยก มาก่อน age-matched เอ็มอาร์ไอ หนูทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคให้ม้ามเม็ดเลือดขาว . ลิมโฟไซต์ถูกย้อมด้วยสีและ anti-cd8-fitc หรือ anti-cd4-fitc ไลมาบเฉพาะ cd25 ( IL-2 receptor ) ( ) , cd62l ( l-selectin ) ( B )หรือมีมาก ( ก่อนเปิดใช้แอนติเจน ) ( C ) ตามด้วยการตรวจหา streptavidin-r-pe . สามการทดลองที่เป็นอิสระได้ และเป็นจุดแปลงแสดงจากตัวแทนกลุ่ม ( ซ้าย ) การวิเคราะห์ม้ามเม็ดเลือดขาวจากเมาส์ที่ไร้เดียงสา ( ขวา ) สมองได้ถูกทำลาย . ค่า CD4 CD8 T เซลล์และเป็นเครื่องหมายที่ระบุจะได้รับในเขต Upper .
สมองถูกทำลายและเซลล์ CD8 T แสดงขึ้นอยู่กับ MHC i-restricted พิษต่อเซลล์มะเร็งส่วนใหญ่กับเซลล์เป้าหมายแสดงดำนิ วคลีโอโปรตีนไวรัส .
หากิจกรรม cytolytic ศักยภาพของ brain-derived เซลล์ CD8 T เราในหลอดทดลองชนิดอาศัยเซลล์เซลล์ที่พบวิธีการจับคู่เซลล์เป้าหมายแสดง bdv แอนติเจน เพราะ bdv ไม่คูณพร้อมในเซลล์เมาส์เราใช้คอม vaccinia ไวรัสรหัสสำหรับโปรตีนพี p24 bdv , หรือ gp94 ( P57 ) ติด l929 เมาส์ ( h-2k ) เซลล์ที่ถูกใช้เป็นพิษต่อเซลล์ T lymphocyte ( ซีทีแอล ) เป้าหมายทางฟีโนไทป์ของยีนต่าง ๆ vaccinia ไวรัสได้รับการยืนยันโดยการทดลองใช้ immunoprecipitation monospecific แอนติกับโปรตีนต่างๆ และ cv-1 bdv lysates ติดเชื้อเซลล์ ( ข้อมูลไม่แสดง ) เมื่อสมองแยกสด ๆโดยการเตรียมจาก heavilydiseased เอ็มอาร์ไอ หนูใช้เป็นอีกครั้งหนึ่งก่อน restimulation ในหลอดแก้ว ,พิษต่อเซลล์มะเร็งที่แข็งแกร่งกับดำที่แสดง l929 เซลล์ ) ( รูปที่ 2A ) ในทางตรงกันข้าม l929 เซลล์แสดง gp94 ( P57 ) ไม่ได้ lysed ระดับสูงกว่า l929 เซลล์ที่ติดเชื้อด้วยไวรัส vaccinia แสดงออกโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้อง ส่วนการสลายของ p24 แสดงเซลล์ถึงระดับกลาง ( รูปที่ 2A )การเตรียมเซลล์เป้าหมายติดเชื้อต่าง ๆ vaccinia พาหะไวรัส lysed ในขอบเขตที่คล้ายกันโดยเฉพาะ ctls vaccinia ติดเชื้อไวรัส ในขณะที่ล้อ l929 เซลล์ไม่ได้ถูกฆ่า ( รูปที่ 2B ) แสดงให้เห็นว่า ความแตกต่างที่สังเกตในการสลายเซลล์เป้าหมาย โดยเฉพาะ ctls bdv ไม่ได้เนื่องจาก องศาที่แตกต่างกันของการติดเชื้อวัคซิเนีย ไวรัส ( รูปที่ 2B )สมองโดยการเตรียมจากป่วย CBA / J เมาส์ เมาส์สายพันธุ์อื่นด้วย h-2k พบความผิดปกติทางระบบประสาทที่พัฒนาหลังจาก bdv การติดเชื้อกับความถี่กลาง ( 22 ) , นอกจากนี้ยังพบกิจกรรม cytolytic สูงกับดำที่แสดง l929 เซลล์ ( รูปที่ 2 ) สมองโดยการเตรียมจากไร้เดียงสา เอ็มอาร์ไอ หนูมีเพียงตัวเลขเม็ดเลือดขาวต่ำมาก .เยาะเย้ยการเตรียมหายจากสมองเหล่านี้พบว่าเอนไซม์มีผลต่อเซลล์เป้าหมาย ( รูปที่ 2 ) ซึ่งแตกต่างจากสมองโดยการเตรียมจากสัตว์ที่เป็นโรคมีการสลายเฉพาะของดำที่แสดง l929 เซลล์ ( เซลล์ที่เตรียมจากม้ามของเขาพบไม่มีกิจกรรม ( รูปที่ 2 )

รูปที่ 2ex vivo ctl กิจกรรมของสมองถูกทำลาย bdv หนูทดลองที่ติดเชื้อเป็นกำกับส่วนใหญ่กับดำนิ วคลีโอโปรตีนไวรัส สมองถูกทำลายอย่างรุนแรง เอ็มอาร์ไอ หนูป่วย ( ก ) หรือ ( ข ) ข้อที่เฉพาะเจาะจง ctls ใช้อีกครั้งหนึ่งในข้อติดเชื้อ l929 เซลล์เป้าหมายแสดงแสดงโปรตีนหรือโปรตีน recombinant bdv ควบคุมไม่ได้( c ) ctl ตรวจสอบด้วยถูกทำลายสมองของ severelydiseased CBA / J ( h-2k ) เมาส์ ( D ) ม้ามของหนูขาดเม็ดเลือดขาวสามารถ bdv เฉพาะ ctls . ( จากสมองหรือเซลล์ม้ามของเป็นโรคติดเชื้ออย่างรุนแรงหรือสุขภาพเยาะเย้ย bdv หนูที่ติดเชื้อสามารถแยกเซลล์เป้าหมาย l929 แสดง bdv ดำ .โดยการเตรียมจากเอ็มอาร์ไอสมองมาก่อน หนูมักจะมีเม็ดเลือดขาวน้อยกว่า 105 . พวกเขา resuspended ในปริมาณเดียวกัน ) เป็นเม็ดเลือดขาวจากสมองของสัตว์ป่วย และเหมือนเล่มของทั้งสองเซลล์ การเตรียมใช้ใน ctl ) . ( จ ) การ จำกัด กิจกรรมของ MHC ctl .เซลล์เป้าหมายทั้ง mc57g เซลล์ ( h-2b ) หรือ l929 เซลล์ ( h-2k ) ติดเชื้อ พบ vaccinia ไวรัส ( เซลล์จากสมอง MRI ( h-2k ) หนูเป็นโรคบอร์นาอย่างรุนแรง ( f ) ค่าเฉพาะของเซลล์ CD8 T lymphocyte สมองจากการเตรียมยกเลิกกิจกรรม ctl .