Results and discussionIsolation and

Results and discussion
Isolation and characterization of endophytic fungus
The endophytic fungus FC-46 (KC989106) in nature was found
associated with C. annum. Colonies of FC-46 showed growth of
6–7 cm on a PDA plate after 7 days. The color of the strain on
obverse view was white to light brown and the reverse was dark
brown (see Supporting info, Fig. 1a and b). The morphological characteristics
of FC-46 supported the genus Alternaria. For molecular
characterization of strain FC-46, ITS1-5.8S rDNA-ITS2 region was
amplified, sequenced and submitted at NCBI nucleotide database
using BLAST program. Sequences of identity greater than 90% were
retrieved, aligned with the sequence of strain FC-46 using clustal
W program and subjected to neighbor-joining (NJ) analysis to
obtain the phenogram (Fig. 1). In the NJ-tree Pyrenophora leucospermi
(JN712479) was used as out group. The ITS sequence of strain
FC-46 had the highest nucleotide similarities with A. alternata
(AF455506) and formed a clade with 99% bootstrap value.
Fermentation and isolation of secondary metabolites
The fungus was cultured in potato dextrose broth (PDB), pH 5.5
at 28 C for 7 days with constant shaking at 200 rpm. The fermentation
broth was then extracted with dichloromethane following
the National Cancer Institute’s protocol (McCloud, 2010). The extract
was concentrated in vacuo and subjected to column chromatography
on silica gel using hexane-ethyl acetate with increasing
polarity leading to the isolation of two compounds, identified as
2,4-di-tert-butyl phenol (2) (Sang and Kim, 2012) and alternariol-
10-methyl ether (3), which is new to the literature (Fig. 2).
Structure elucidation
The molecular formula of 3 was established as C15H12O5 by
high-resolution positive-ion-mode electrospray ionization mass
spectrometry [HR-ESI(+)-MS] at m/z 273.0756 [M+H]+ (calcd. for
C15H24O, 272.0685). The IR spectrum displayed absorbances at
1658.39 and 3400.86 cm1 indicating the presence of carbonyl
and hydroxyl groups respectively. 13C NMR displayed 15 carbon
resonances, which were classified by distortionless enhancement
by polarization transfer (DEPT) and heteronuclear single-quantum
coherence (HSQC) NMR experiments as 2 methyls including one
methoxy, 4 methines and 9 non-protonated carbons (Table 1). 1H
NMR pattern showed close relation with alternariol’s chemical
skeleton having difference in splitting of aromatic peaks. Two
doublets with J = 2.5 Hz showed the presence of meta coupling at
C-2 and C-4, while two doublets with J = 5.7 Hz indicated the presence
of ortho coupled protons at C-8 and C-9. The characteristic
peak of hydroxyl group involved in strong hydrogen bonding
Fig.appears at dH 11.67 attached to C-7, confirmed by HSQC. A sharp
singlet at dH 2.57 revealed the presence of methyl group attached
to aromatic ring positioned as C-1 from HMBC correlation with
C-60 and C-2. Singlet at dH 3.91 indicated the presence of methoxy
group positioned as C-10 from strong HMBC correlation with C-11.
13C NMR spectra also corroborated the presence of alternariol skeleton
revealing the connectivity of rings A and B with characteristic
peaks at d 99.2 and 138.1, corresponding to C-7’ and C-100 . Similar
connectivity of rings B and C was located at d 109.8 and 153.1 assigned
as C-60 and C-50 . Moreover, the ortho coupling between
8?9 was also confirmed by 1H-1H COSY co-relations between
H-8 (dH 6.51) and H-9 (dH 7.23), which further reinforces the direct
attachment of methoxy group to C-10. Thus, the structure of 3 was
elucidated as 3,7-dihydroxy-10-methoxy-1-methyl-6H-benzochromene-
6-one.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลและการสนทนาการแยกและคุณสมบัติของเชื้อ endophytic ราพบเห็ดรา endophytic FC-46 (KC989106) ในธรรมชาติเกี่ยวข้องกับ C. annum อาณานิคมของ FC-46 พบว่าการเจริญเติบโตของ6 – 7 ซม.บนจาน PDA หลังจาก 7 วัน สีของสายพันธุ์ในobverse มีสีขาวสีน้ำตาลอ่อน และจะกลับเป็นสีเข้มสีน้ำตาล (ดูสนับสนุนข้อมูล Fig. 1a และ b) ลักษณะสัณฐานของ FC-46 สนับสนุนสกุล Alternaria ในระดับโมเลกุลคุณสมบัติของต้องใช้ FC-46, ITS1-5.8S rDNA ITS2 ภูมิภาคได้ขยาย ตามลำดับ และส่งที่ฐานข้อมูล NCBI นิวคลีโอไทด์ใช้โปรแกรมระเบิด ลำดับรหัสประจำตัวมากกว่า 90% ได้ดึงข้อมูล จัดลำดับของต้องใช้ FC-46 ใช้ clustalโปรแกรม W และต้องการวิเคราะห์ (NJ) ใกล้เคียงเข้าร่วมการรับ phenogram (Fig. 1) ใน leucospermi Pyrenophora NJ-ทรี(JN712479) ถูกใช้เป็นกลุ่มออก ลำดับของที่ต้องใช้FC-46 มีความคล้ายคลึงของการนิวคลีโอไทด์สูงกับอ. alternata(AF455506) และ clade 99% ค่าเริ่มต้นระบบหมักและการแยกของ metabolites รองเชื้อรามีอ่างในซุปมันฝรั่งขึ้น (PDB), ค่า pH 5.5ที่ 28 C 7 วันด้วยคงเขย่าที่ 200 รอบต่อนาที หมักซุปแล้วถูกสกัด ด้วย dichloromethane ดังต่อไปนี้สถาบันมะเร็งแห่งชาติของโพรโทคอ (McCloud, 2010) การดึงข้อมูลเข้มข้นใน vacuo และภายใต้คอลัมน์ chromatographyบนด้วยเฮกเซนเอทิล acetate เพิ่มซิลิก้าเจลขั้วนำไปแยกสาร 2 เป็นวาง 2, 4 ดี-tert-ด... (2) (สังข์และคิม 2012) และ alternariol -10-methyl อีเทอร์ (3), ซึ่งเป็นวรรณกรรม (Fig. 2) ใหม่Elucidation โครงสร้างสูตรโมเลกุล 3 ก่อตั้งขึ้นเป็น C15H12O5 โดยionization วิธีพ่นละอองไฟฟ้าบวกไอออนโหมดความละเอียดสูงขนาดใหญ่spectrometry [HR-ESI (+) -MS] ที่ m/z 273.0756 [M + H] + (ปี. สำหรับC15H24O, 272.0685) Absorbances ที่แสดงคลื่น IR1658.39 และ 3400.86 ซม. 1 บ่งชี้สถานะของ carbonylและกลุ่มไฮดรอกซิลตามลำดับ 13C NMR แสดงคาร์บอน 15resonances ซึ่งถูกจัดประเภท โดยเพิ่มประสิทธิภาพของ distortionlessถ่ายโอนโพลาไรซ์ (อร่อย ๆ) และ heteronuclear เดียวควอนตัมการทดลอง NMR โปรเจค (HSQC) เป็น methyls 2 รวมถึงmethoxy, 4 methines และ 9 ไม่ใช่ protonated carbons (ตาราง 1) 1Hรูปแบบ NMR ที่แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับเคมีของ alternariolโครงกระดูกที่มีความแตกต่างในการแบ่งยอดหอม สองdoublets กับ J = Hz 2.5 ที่แสดงสถานะของ meta coupling ที่C 2 และ C-4 ขณะ doublets สองกับ J = 5.7 Hz ระบุสถานะของ ortho ควบคู่โปรตอน C 8 และ C-9 ลักษณะสูงสุดของกลุ่มไฮดรอกซิลที่เกี่ยวข้องในงานไฮโดรเจนที่แข็งแรงFig.appears ที่ dH 11.67 กับ C-7 ได้รับการยืนยัน โดย HSQC คมชัดเสื้อกล้ามที่ dH 2.57 เปิดเผยสถานะของกลุ่ม methyl แนบการแหวนหอมตำแหน่ง C-1 จากความสัมพันธ์ของ HMBC ด้วยC 60 และ C-2 เสื้อกล้ามที่ dH 3.91 ระบุสถานะของ methoxyกลุ่มตำแหน่ง C 10 จาก HMBC ความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งกับ C-1113C NMR แรมสเป็คตรายัง corroborated ของโครงกระดูก alternariolการเชื่อมต่อของวงแหวน A และ B มีลักษณะเปิดเผยยอดเขาที่ d 99.2 และ 138.1 ที่สอดคล้องกับ C 7' และ C-100 คล้ายคลึงกันเชื่อมต่อวงแหวน B และ C เป็น d 109.8 และ 153.1 กำหนดอยู่C 60 และ C-50 นอกจากนี้ คลัป ortho ระหว่าง8 ? 9 ยังยืนยันการรับ 1H - 1H อบอุ่นความสัมพันธ์ร่วมระหว่างH-8 (dH 6.51) และ H-9 (dH 7.23), ที่ reinforces ตรงเพิ่มเติมแนบกลุ่ม methoxy C 10 ดังนั้น มีโครงสร้าง 3elucidated เป็น 3,7-dihydroxy-10-methoxy-1-methyl-6H-benzochromene-6-หนึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลลัพธ์และการแยกและศึกษาลักษณะของเชื้อราเอนโดไฟท์อภิปราย

fc-46 เชื้อราเอนโดไฟท์ ( kc989106 ) ในธรรมชาติพบ
ที่เกี่ยวข้องกับ C . ปี อาณานิคมของ fc-46 แสดงการเจริญเติบโตของ
6 – 7 ซม. บน PDA แผ่นหลัง 7 วัน สีเมื่อย
ด้านตรงข้ามวิว ขาว น้ำตาลอ่อน และน้ำตาลเข้ม
( เห็นขึ้นมา สนับสนุนข้อมูล รูปที่ 1A และ B )ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของพืชสกุล =
fc-46 สนับสนุน . สำหรับคุณสมบัติของโมเลกุล
fc-46 เมื่อย its1-5.8s rdna-its2 ภูมิภาค
ขยายยีนและการแสดงความคิดเห็นที่เบส ncbi
ฐานข้อมูลโดยใช้โปรแกรมระเบิด ลำดับของตนมากกว่า 90% มี
ดึงให้สอดคล้องกับลำดับของ fc-46 สายพันธุ์โดยใช้ clustal
W โปรแกรม และต้องเพื่อนบ้านร่วม ( NJ ) การวิเคราะห์

ขอรับ phenogram ( รูปที่ 1 ) ในนิวเจอร์ซีย์ต้นไม้ pyrenophora leucospermi
( jn712479 ) ถูกใช้เป็นกลุ่ม ของลำดับของ fc-46 เมื่อย
สูงมีความคล้ายคลึงกันกับ เบส alternata
( af455506 ) และรูปแบบที่ clade ที่มีค่าเท่ากับ 99% .
การหมักและการแยกสาร secondary metabolites
เชื้อราที่เลี้ยงใน broth potato dextrose ( PDB ) , pH 5.5
ที่ 28  C เป็นเวลา 7 วัน มีค่าคงที่เขย่า 200 รอบต่อนาที การหมักน้ำสกัดด้วย dichloromethane แล้ว

ต่อไปนี้โปรโตคอลสถาบันมะเร็งแห่งชาติ ( McCloud , 2010 ) สารสกัดจาก vacuo
ในและภายใต้คอลัมน์โครมาโทกราฟีบนซิลิกาเจล
ใช้เฮกเซน เอทิลอะซิเตทกับเพิ่ม
ขั้วที่นำไปสู่การแยกสารประกอบสองชนิดที่ระบุเป็น
2,4-di-tert-butyl ฟีนอล ( 2 ) ( แซง และ คิม , 2012 ) และ alternariol -
10 เมทิลอีเทอร์ ( 3 ) ซึ่งเป็นใหม่ในวรรณคดี ( รูปที่ 2 )

สูตรสูตรโครงสร้างโมเลกุลของ 3 ก่อตั้งขึ้นเป็น c15h12o5
ความละเอียดสูงบวกไอออนโดย โหมดวิธีพ่นละอองไฟฟ้ามีประจุมวล spectrometry ( ) - hr-esi
[ MS ] M / Z 273.0756 [ M ] ( Calcd .สำหรับ c15h24o 272.0685
, ) อินฟราเรดสเปกตรัมแสดง absorbances ที่
1658.39 3400.86 ซม.  1 และบ่งชี้สถานะของคาร์บอนิล
และกลุ่มไฮดรอกซิล ตามลำดับ 13C NMR แสดง resonances คาร์บอน
15 ซึ่งจำแนกตามการโอน
distortionless โพลาไรเซชัน ( ทีมเดี่ยว ) และ heteronuclear ควอนตัม
การเชื่อมโยง ( hsqc ) โดยทำการ 2 methyls รวมทั้ง
เมท็อกซี่เดียว ,4 methines และ 9 ไม่ protonated คาร์บอน ( ตารางที่ 1 ) 1H NMR พบความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับรูปแบบ

alternariol ทางเคมีของโครงกระดูกมีความแตกต่างในการแยกยอดหอม 2
คู่กับ J = 2.5 Hz พบการปรากฏตัวของเมตา coupling ที่
C-2 และซีโฟร์ ในขณะที่สองคู่กับ J = 120 Hz แสดงตน
ของ ortho คู่โปรตอนและ c-8 c-9 . ลักษณะ
จุดสูงสุดของหมู่ไฮดรอกซิลที่เกี่ยวข้องในพันธะไฮโดรเจนที่แข็งแรง
fig.appears DH 11.67 แนบเป็น C-7 ยืนยันโดย hsqc . เป็นเสื้อกล้ามคม
ที่ DH ใช้แล้วพบว่ามีกลุ่มเมทิลแนบ
จะหอมแหวนตําแหน่งเป็น c-1 จากฤทธิ์และความสัมพันธ์กับ
c-60 C-2 . เสื้อกล้ามที่ DH 3.91 พบการปรากฏตัวของเมท็อกซี่
กลุ่มตําแหน่งเป็น c-10 จากความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งกับ c-11
ฤทธิ์ .13C NMR spectra ยืนยันการแสดงตนของ alternariol โครงกระดูก
เปิดเผยระหว่างวงแหวน A และ B มียอดคง 138.1
D และในลักษณะที่เป็น C-7 ' และ c-100 . การเชื่อมต่อที่คล้ายกัน
แหวน B และ C อยู่ที่ D และ 109.8 153.1 มอบหมายและเป็น c-60
c-50 . นอกจากนี้ ตรงข้อต่อระหว่าง
8 ? 9 ยังได้รับการยืนยันโดย 1h-1h อบอุ่น Co ความสัมพันธ์ระหว่าง
h-8 ( DH 6.51 ) และ h-9 ( DH 7.23 ) ซึ่งต่อไปจะส่งเสริมความผูกพันโดยตรง
ของเมท็อกซี่ กรุ๊ป c-10 . ดังนั้น โครงสร้างของผลิตภัณฑ์ที่เป็น 3,7-dihydroxy-10-methoxy-1-methyl-6h-benzochromene 3
-
6-one .