2. Materials and methods2.1. Bacter

2. Materials and methods
2.1. Bacterial isolates
A total of 108 V. parahaemolyticus isolates recovered from 2007 to
2011 were included in this study. Among these isolates, 96 were
recovered from clinical cases and 12 from seafood products. Samples
were pre-enriched in the Alkaline Peptone Water medium (APW)
containing 3.5% NaCL at 37 °C overnight before inoculating to the
thiosulfate citrate bile-salts sucrose (TCBS) agar. Those green shiny
colonies from TCBS were selected for next identification using the
oxidize test, triple sugar iron agar (TSI) reaction and serotyped by
slide agglutination with a V. parahaemolyticus antiserum (Denka Seiken,
Tokyo, Japan).
2.2. Ethics statement
All these 96 clinical samples were stool samples and collected by the
nurse in the sentinel hospitals assigned by the foodborne disease
surveillance project of Guangdong Province. All samples used in this
study were anonymized and received the approval from the Institution-
al Review Board of Centre for Disease Control and Prevention of Guang-
dong Province.
2.3. Chromosomal DNA preparation
DNA was extracted from bacterial isolates using the QIAamp DNA
Mini kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Inc.,
Shanghai, China). DNA extracts were dissolved in Tris–EDTA (10 mM
Tris–HCl, 0.10 mM EDTA [pH 8.0]) buffer and stored at 4 °C. Dilutions
of template DNA were made with sterile distilled water to obtain a
final concentration of approximately 100 ng/mL.
2.4. Detection of toxin genes
A multiplex PCR assay was performed to determine the presence of
tdh and trh. PCR was performed using a thermal cycler (Biometra, Inc.,
Biometra TGradient, Göttingen, Germany.) with the previously
published primers (Bej et al., 1999). Target sequences were amplified
after an initial denaturation at 94 °C for 3 min, with 25 cycles consisting
of 94 °C for 40 s, 60 °C for 40 s, and 72 °C for 40 s and a final extension
step of 72 °C for 4 min. Amplified products were separated on a 1% aga-
rose gel, stained with 1% ethidium bromide, and imaged using a Gel Doc
EQ system (Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA).
2.5. MLST
A seven-locus MLST system described previously (Gonzalez-Escalona
et al., 2008) was used to genotype the isolates. The dnaE (DNA polymer-
ase III, α subunit), gyrB (DNA gyrase, subunit B), recA (recombinase A),
dtdS (threonine 3-dehydrogenase), pntA (transhydrogenase, α subunit),
pryC (dihydro-orotase) and tnaA (tryptophanase) genes were analyzed
as previously described. Primer sequences and conditions for PCR
amplification are available at http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/
info/protocol.html. PCR products were purified using a QIAquick PCR
Purification kit as described by the manufacturer (Qiagen). Cycle
sequencing was carried for both DNA strands of the amplified targets
using M13 universal primers and BigDye chemistry (Perkin Elmer Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA), with an initial denaturation of 96 °C for
1 min, followed by 25 cycles of denaturation at 96 °C for 10 s, primer
annealing at 50 °C for 5 s, and extension at 72 °C for 4 min. Sequence
data were analyzed using ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin
Elmer Applied Biosystems). Alignment of sequences was performed
using DNAStar (version V7.10). Numbers for alleles and sequence types
(STs) were assigned according to the PubMLST V. parahaemolyticus
database.
2.6. Assignment to clonal complexes
The program eBURST v3.0 was used to identify the different clonal
complexes (http://eburst.mlst.net). The most restrictive group definition
was used to define the clonal complexes, i.e., at least six of the seven
alleles had to be identical to be included in the same group or clonal
complex (Feil et al., 2004). The statistical confidences for the ancestral
types were assessed using 1000 bootstrap resamplings. Two different
STs are considered single-locus variant (SLV) when they differ from
each other at a single locus. Double-locus variants (DLVs) refer to two
STs differing in only two of the seven loci.
2.7. Test for recombination
The START (version 2.0) software package was used to calculate
the “standardized” index of association (IAS) (Haubold and Hudson,
2000). This statistical method tests for the null hypothesis of
linkage equilibrium; i.e., if IAS = 0, then alleles are independently
distributed at all loci analyzed (alleles are in linkage equilibrium)
and recombination has occurred frequently. The ratio between
the numbers of synonymous (dS) and nonsynonymous (dN) substi-
tutions was calculated by the method of Nei–Gojobori implemented
in START. This measures the type of selection occurring at each
locus. The hypothesis tested was for neutrality (dN = dS); if dN/
dS b 1, then nonsynonymous, sites are under selective constraint
or purifying pressure (negative selection); dN/dS N 1 indicates
positive selection, and dN/dS = 1 indicates neutrality.
3. Results
Fifteen serotypes were identified among the 108 isolates, domi-
nated by O3:K6 (n = 52; 48%), O4:K8 (n = 20; 18%) and O1:KUT
(n = 12; 11%). Only four isolates (two O4:K8 and two O1:KUT)
from seafood products expressed one of these serotypes. Ninety-
three of the clinical but only two of the seafood product isolates
were tdh positive. However, none of the isolates carried the trh
gene (Table 1).
The numbers of alleles observed for each MLST locus were distributed
as follows: 16 (dnaE), 19 (gyrB), 20 (recA), 17 (dtdS), 14 (pntA), 19 (pyrC)
and 18 (tnaA). The number of polymorphic sites observed varied per locus
from 17 (pntA) to 50 (recA). The nucleotide diversity ranged from 0.010 to
0.025, with the highest degree of diversity and percentage of polymorphic
sites observed for dtdS (0.025, 6.77%) and recA (0.022, 6.86%). The ratio of
nonsynonymous to synonymous substitutions (dN/dS) was lower than 1
for each locus analyzed using a selection test for neutrality (Table 2).
Thirty-one different STs were identified and 17 STs were novel
to this study. ST-3 was the most abundant type (53 out of 108 isolates);
isolates with this ST were found in three different serotypes (O3:K6,
n = 47, O1:KUT, n = 5 and O4:K68, n = 1). Eight additional STs were
represented by more than one isolate including ST-189 (n = 8; all
O4:K8), ST-265 (n = 6; all O4:K8), ST-345 (n = 6; all O4:K8), ST-199
(n = 4; all O1:KUT), ST-337 (n = 3; all O4:K34), ST-8 (n = 2; O1:KUT
and O1:K56), ST-492 (n = 2; both O3:K6) and ST-787 (n = 2; both
O4:K68).
eBURST analysis revealed four clonal complexes (CC3, CC345, CC120
and CC8), and 20 singletons (Fig. 1). CC3 consisted of 58 isolates from
five STs [ST-3, founder; ST-431, SLV (gyrB); ST-435, SLV (recA); ST-
661, SLV (pntA); and ST-787, SLV (pyrC)] and three serovars (O3:K6,
O1: KUT and O4:K68). The ST-3 O3:K6 pandemic clone is located within
CC3. CC8 consists of two STs (ST-8 and ST-783) differing at the pyrC

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. แบคทีเรียที่แยกได้จำนวน 108 V. parahaemolyticus แยกกู้จาก 2007 ไป2011 ได้ถูกรวมในการศึกษานี้ ในหมู่เหล่านี้แยก 96 ถูกกู้คืนจากกรณีคลินิกและ 12 จากผลิตภัณฑ์อาหารทะเล ตัวอย่างได้เตรียมอุดมไปในกลางน้ำ Peptone ด่าง (APW)ประกอบด้วย 3.5% NaCL ที่ 37 ° C นอนก่อน inoculating เพื่อthiosulfate ซิเตรตเกลือน้ำดี agar ซูโครส (TCBS) ผู้เขียวเงาเลือกอาณานิคมจาก TCBS สำหรับใช้รหัสต่อไปนี้ทดสอบการออกซิไดซ์ น้ำตาลสามเตาปฏิกิริยา agar (TSI) และ serotyped โดยภาพนิ่ง agglutination กับเป็น V. parahaemolyticus antiserum (Seiken สายไฟฟ้าโตเกียว ญี่ปุ่น)2.2. จริยธรรมงบทั้งหมด 96 คลินิกตัวอย่างเหล่านี้มีตัวอย่างอุจจาระ และรวบรวมโดยการพยาบาลในโรงพยาบาลองครักษ์ที่กำหนดโรค foodborneโครงการเฝ้าระวังของมณฑลกวางตุ้งจังหวัด ตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ในการนี้ศึกษาได้ลับ และได้รับการอนุมัติจากสถาบัน-ทบทวนคณะกรรมการของศูนย์ควบคุมและป้องกันโรคและการป้องกันของกวง - อัลดง จังหวัด2.3. ของโครโมโซมดีเอ็นเอเตรียมดีเอ็นเอที่สกัดจากแบคทีเรียที่แยกได้โดยใช้ดีเอ็นเอ QIAampชุดมินิตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Qiagen, Inc.เซี่ยงไฮ้ จีน) สารสกัดจาก DNA ถูกละลายในตรี – EDTA (10 มม.Tris–HCl, 0.10 mM EDTA [pH 8.0]) บัฟเฟอร์ และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส Dilutionsแม่แบบดีเอ็นเอที่ทำกับกอซกลั่นน้ำจะได้รับการความเข้มข้นสุดท้ายของประมาณ 100 ng/mL2.4 การตรวจยีนสารพิษทำการตรวจสอบสถานะของการ multiplex PCR assaytdh และ trh ทำ PCR ใช้ cycler ความร้อน (Biometra, Inc.Biometra TGradient, Göttingen เยอรมนี) กับก่อนหน้านี้เผยแพร่ไพรเมอร์ (Bej et al., 1999) มีขยายเป้าหมายลำดับหลังจากการ denaturation เริ่มต้นที่ 94 ° C สำหรับ 3 นาที กับรอบที่ 25 ประกอบด้วยของ 94 ° C สำหรับ 40 s, 60 ° C สำหรับ 40 s และ 72 ° C สำหรับ 40 s และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายขั้นตอนของ 72 ° C ต่ำสุด 4 Amplified ผลิตภัณฑ์ถูกแยกจากกันในตู้ 1% เป็น-กุหลาบ สีกับโบรไมด์ ethidium 1% และใช้เอกสารที่เจ imagedระบบ EQ (Bio Rad Inc. เฮอร์คิวลิส CA, USA)2.5. MLSTโลกัสโพลเจ็ด MLST ระบบอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Gonzalez Escalonaร้อยเอ็ด al., 2008) ได้ใช้ลักษณะทางพันธุกรรมแยก DnaE (ดีเอ็นเอพอลิเมอร์-ase III ย่อยด้วยกองทัพ), gyrB (DNA gyrase ย่อย B), recA (recombinase A),dtdS (ทรีโอนีน 3-dehydrogenase) pntA (transhydrogenase ด้วยกองทัพย่อย),วิเคราะห์ยีน tnaA (tryptophanase) และ pryC (dihydro-orotase)อธิบายว่า ก่อนหน้านี้ ลำดับรองพื้นและเงื่อนไขสำหรับ PCRขยายได้ที่ http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/info/protocol.html ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์โดยใช้ QIAquick PCRชุดฟอกตามที่อธิบายไว้ โดยผู้ผลิต (Qiagen) วงจรลำดับถูกดำเนินการสำหรับทั้งสอง strands ดีเอ็นเอของเป้าหมายเอาต์ใช้ไพรเมอร์สากล M13 และเคมี BigDye (เพอร์เอลเมอใช้Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี้ CA, USA), กับการ denaturation เริ่มต้นของ 96 ° C สำหรับ1 นาที ตาม ด้วยรอบ 25 ของ denaturation ที่ 96 ° C 10 s รองพื้นการอบเหนียวที่ 50 ° C สำหรับ 5 s, 72 ° C สำหรับ 4 นาทีลำดับมีวิเคราะห์ข้อมูลใช้ ABI ปริซึม 3100 พันธุกรรมวิเคราะห์ (เพอร์เอลเมอใช้ Biosystems) ทำการจัดลำดับใช้ DNAStar (รุ่น V7.10) หมายเลขสำหรับชนิดลำดับและ alleles(STs) ถูกกำหนดตามการ PubMLST V. parahaemolyticusฐานข้อมูล2.6 กำหนดให้ clonal คอมเพล็กซ์ใช้ v3.0 eBURST โปรแกรมระบุต่าง ๆ clonalสิ่งอำนวยความสะดวก (ส่วน http://eburst.mlst.net) คำนิยามกลุ่มจำกัดมากที่สุดใช้กำหนดคอมเพล็กซ์ clonal เช่น ที่หกเจ็ดalleles มีเหมือนกันที่จะรวมในกลุ่มเดียวกัน หรือ clonalคอมเพล็กซ์ (Feil et al., 2004) Confidences สถิติสำหรับแบบโบราณชนิดถูกประเมินโดยใช้ 1000 resamplings เริ่มต้นระบบ สองแตกต่างกันSTs จะพิจารณาตัวแปรเดียวโลกัสโพล (เอสแอลวี) เมื่อพวกเขาแตกต่างจากกันที่โลกัสโพลเดียว โลกัสโพลคู่ตัวแปร (DLVs) ถึงสองSTs ที่แตกต่างกันเฉพาะ 2 loci เจ็ด2.7 การทดสอบ recombinationแพคเกจเริ่มต้น (รุ่น 2.0) ซอฟต์แวร์ที่ใช้ในการคำนวณดัชนี "มาตรฐาน" ของสมาคม (IAS) (Haubold และฮัดสัน2000) ด้วยวิธีการทางสถิตินี้ทดสอบในสมมติฐานว่างของที่สมดุลเชื่อมโยง เช่น หาก IAS = 0 แล้ว alleles อิสระกระจายที่ loci ที่วิเคราะห์ทั้งหมด (alleles อยู่ในสมดุลเชื่อมโยง)และเกิด recombination บ่อย อัตราส่วนระหว่างจำนวนพ้อง (dS) และ nonsynonymous (dN) substi-คำนวณ โดยวิธีของ Nei – Gojobori ใช้ tutionsในการเริ่มต้น นี้มาตรการเลือกที่เกิดขึ้นในแต่ละชนิดโลกัสโพล สมมติฐานที่ทดสอบมีความเป็นกลาง (dN = dS); ถ้า dN /dS b 1 แล้ว nonsynonymous เว็บไซต์อยู่ภายใต้ข้อจำกัดมาตรการหรือบริสุทธิ์ความดัน (ลบตัวเลือก), dN/dS N 1 ระบุเลือกค่าบวก และ dN/dS = 1 บ่งชี้ว่า ความเป็นกลาง3. ผลลัพธ์Serotypes 15 ได้ระบุแบบ 108 ล domi-nated โดย O3:K6 (n = 52, 48), O4:K8 (n = 20; 18%) และ O1:KUT(n = 12; 11%) เพียงสี่แยก (O4:K8 สองและ O1:KUT สอง)จากทะเล ผลิตภัณฑ์แสดง serotypes เหล่านี้อย่างใดอย่างหนึ่ง 90-สามทางคลินิกแต่เพียงสองแยกผลิตภัณฑ์อาหารทะเลมี tdh บวก อย่างไรก็ตาม ไม่มีการแยกดำเนินการ trhยีน (ตาราง 1)มีกระจายจำนวน alleles ที่สังเกตในแต่ละโลกัสโพล MLSTดังนี้: 16 (dnaE), 19 (gyrB), 20 (recA), 17 (dtdS), 14 (pntA) 19 (pyrC)และ 18 (tnaA) จำนวนไซต์ polymorphic สังเกตแตกต่างกันสำหรับแต่ละโลกัสโพลจาก 17 (pntA) กับ 50 (recA) ความหลากหลายของนิวคลีโอไทด์มา 0.010 เพื่อ0.025 ระดับสูงสุดของความหลากหลายและเปอร์เซ็นต์ของ polymorphicอเมริกาสังเกตสำหรับ dtdS (0.025, 6.77%) และ recA (0.022, 6.86%) อัตราส่วนของnonsynonymous ไปพ้องแทน (dN/dS) ไม่ต่ำกว่า 1ในแต่ละโลกัสโพลวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบตัวเลือกสำหรับความเป็นกลาง (ตารางที่ 2)สามสิบหนึ่งระบุอื่น STs และ 17 STs มีนวนิยายการศึกษานี้ เซนต์-3 ถูกชนิดอุดมสมบูรณ์ที่สุด (53 ของ 108 แยกได้);แยกกับเซนต์นี้พบใน serotypes ต่าง ๆ สาม (O3:K6n = 47, O1:KUT, n = 5 และ O4:K68, n = 1) STs แปดเพิ่มเติมได้แสดง โดยแยกหนึ่งรวมถึงเซนต์-189 (n = 8 ทั้งหมดO4:K8), เซนต์-265 (n = O4:K8 6 ทั้งหมด), เซนต์-345 (n = 6 ทั้งหมด O4:K8), เซนต์-199(n = 4 ทั้งหมด O1:KUT), เซนต์-337 (n = 3 ทั้งหมด O4:K34), เซนต์-8 (n = 2 O1:KUTและ O1:K56), เซนต์-492 (n = 2 ทั้งสอง O3:K6) และ 787 ดรีมเซนต์ (n = 2 ทั้งสองO4:K68)eBURST วิเคราะห์เปิดเผย 4 clonal คอมเพล็กซ์ (CC3, CC345, CC120และ CC8), และ 20 singletons (Fig. 1) CC3 ประกอบด้วย 58 แยกจากSTs ห้า [เซนต์-3 ผู้ก่อตั้ง เซนต์-431 เอสแอลวี (gyrB); เซนต์-435 เอสแอลวี (recA); เซนต์-661 เอสแอลวี (pntA); และ ST-787 ดรีม เอสแอลวี (pyrC)] และสาม serovars (O3:K6O1: กุดและ O4:K68) โคลนระบาด 3 เซนต์ O3:K6 อยู่ภายในCC3 CC8 ประกอบด้วยสอง STs (8 เซนต์และเซนต์ 783) แตกต่างกันที่การ pyrC

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 แบคทีเรียที่แยกได้รวม 108 V. parahaemolyticus แยกฟื้นปี 2007 ที่จะจากปี2011 รวมอยู่ในการศึกษาครั้งนี้ ในบรรดาสายพันธุ์เหล่านี้ 96 ได้รับการกู้คืนจากกรณีที่ทางคลินิกและ12 จากผลิตภัณฑ์อาหารทะเล ตัวอย่างถูก pre-อุดมไปในกลางน้ำอัลคาไลน์เปปโตน (APW) ที่มีโซเดียมคลอไรด์ 3.5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืนก่อนที่จะฉีดวัคซีนให้กับซิเตรตไทโอซัลเฟตน้ำดีเกลือน้ำตาลซูโครส(TCBS) วุ้น ผู้เงาสีเขียวอาณานิคมจาก TCBS ได้รับการคัดเลือกเพื่อระบุตัวตนต่อไปโดยใช้การทดสอบออกซิไดซ์สามวุ้นเหล็กน้ำตาล(TSI) ปฏิกิริยาและ serotyped โดยสไลด์เกาะติดกันกับโวลต์ antiserum parahaemolyticus (Denka Seiken, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น). 2.2 คำสั่งจริยธรรมเหล่านี้ทั้งหมด 96 ตัวอย่างทางคลินิกเป็นตัวอย่างอุจจาระและเก็บรวบรวมโดยพยาบาลในโรงพยาบาลที่ได้รับมอบหมายแมวมองจากโรคที่เกิดจากอาหารโครงการเฝ้าระวังของมณฑลกวางตุ้ง ตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ในการนี้การศึกษาได้รับการระบุชื่อและได้รับการอนุมัติจาก Institution- อัคณะกรรมการตรวจสอบของศูนย์ควบคุมและป้องกันโรคของ Guang- ดงจังหวัด. 2.3 เตรียมโครโมโซมดีเอ็นเอดีเอ็นเอที่สกัดจากแบคทีเรียโดยใช้ดีเอ็นเอ QIAamp ชุดมินิตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Qiagen, Inc, เซี่ยงไฮ้, จีน) สารสกัดดีเอ็นเอถูกกลืนหายไปในทริส-EDTA (10 มิลลิTris-HCl 0.10 มิลลิ EDTA [พีเอช 8.0]) บัฟเฟอร์และเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส เจือจางดีเอ็นเอแม่แบบที่ถูกสร้างขึ้นมาด้วยน้ำกลั่นปลอดเชื้อเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายประมาณ100 นาโนกรัม / มล. 2.4 การตรวจหายีนพิษทดสอบ PCR multiplex ได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบสถานะของ TDH และ TRH PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ความร้อน Cycler (Biometra, Inc Biometra TGradient, Göttingenเยอรมนี.) ที่ก่อนหน้านี้ไพรเมอร์ที่ตีพิมพ์(Bej et al., 1999) ลำดับเป้าหมายถูกขยายหลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีกับ 25 รอบซึ่งประกอบด้วย 94 ° C เป็นเวลา 40 วินาที, 60 ° C เป็นเวลา 40 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 และส่วนขยายสุดท้ายขั้นตอนของ72 ° C เป็นเวลา 4 นาที ผลิตภัณฑ์ขยายถูกแยกบน aga- 1% เพิ่มขึ้นเจลโบรไมด์ย้อมด้วย ethidium 1% และถ่ายภาพโดยใช้เจลหมอระบบEQ (Bio-Rad อิงค์ Hercules, CA, USA). 2.5 MLST เจ็ดสถานที่ระบบ MLST อธิบายไว้ก่อนหน้า (กอนซาเล-Escalona et al., 2008) ถูกใช้ในการตรวจหาสายพันธุ์เชื้อ dnaE (DNA polymer- ASE III, subunit α) gyrB (gyrase ดีเอ็นเอ subunit B), recA (recombinase A) DTDs (ธ รีโอนี 3 dehydrogenase) pntA (transhydrogenase, subunit α) pryC (dihydro-orotase) และ tnaA (tryptophanase) ยีนวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ลำดับรองพื้นและเงื่อนไขในการ PCR ขยายได้ที่ http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/ ข้อมูล / protocol.html ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธี PCR QIAquick ชุดบริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต (Qiagen) วงจรลำดับได้ดำเนินการทั้งดีเอ็นเอของเป้าหมายการขยายการใช้M13 ไพรเมอร์สากลและเคมี BigDye (Perkin Elmer ประยุกต์Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) มี denaturation เริ่มต้นของ 96 ° C เป็นเวลา1 นาทีตามด้วย 25 รอบของ denaturation ที่ 96 ° C เป็นเวลา 10 วินาที, ไพรเมอร์หลอมที่50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาทีและการขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาที ลำดับวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ปริซึม ABI 3100 วิเคราะห์ทางพันธุกรรม (Perkin Elmer Applied Biosystems) การจัดลำดับได้ดำเนินการโดยใช้ DNAStar (เวอร์ชั่น V7.10) เบอร์อัลลีลและประเภทลำดับ(STS) ได้รับมอบหมายให้เป็นไปตาม PubMLST V. parahaemolyticus ฐานข้อมูล. 2.6 มอบหมายให้คอมเพล็กซ์ clonal โปรแกรม eBURST v3.0 ถูกใช้ในการระบุ clonal ที่แตกต่างกันคอมเพล็กซ์(http://eburst.mlst.net) ความหมายที่เข้มงวดมากที่สุดในกลุ่มที่ถูกใช้ในการกำหนดคอมเพล็กซ์ clonal คืออย่างน้อยหกเจ็ดอัลลีลจะต้องมีเหมือนกันที่จะรวมอยู่ในกลุ่มเดียวกันหรือclonal ที่ซับซ้อน (Feil et al., 2004) ความเชื่อมั่นทางสถิติสำหรับบรรพบุรุษชนิดได้รับการประเมินโดยใช้ 1000 บูต resamplings ที่แตกต่างกันสองSTs ได้รับการพิจารณาที่แตกต่างสถานที่เดียว (SLV) เมื่อพวกเขาแตกต่างจากคนอื่นๆ ในสถานที่เดียว สายพันธุ์ดับเบิลสถานที่ (DLVs) หมายถึงสองSTs แตกต่างกันในเพียงสองในเจ็ดตำแหน่ง. 2.7 ทดสอบการรวมตัวกันอีกเริ่มต้น (รุ่น 2.0) แพคเกจซอฟต์แวร์ที่ใช้ในการคำนวณดัชนี"มาตรฐาน" ของสมาคม (IAS) (Haubold ฮัดสัน, 2000) การทดสอบนี้วิธีการทางสถิติสำหรับสมมติฐานของความสมดุลการเชื่อมโยง; เช่นถ้า IAS = 0 แล้วอัลลีลจะเป็นอิสระกระจายในทุกตำแหน่งวิเคราะห์(อัลลีลอยู่ในภาวะสมดุลการเชื่อมโยง) และรวมตัวกันอีกได้เกิดขึ้นบ่อยครั้ง อัตราส่วนระหว่างตัวเลขของความหมายเหมือนกัน (DS) และ nonsynonymous (DN) การแทนที่ tutions ที่คำนวณได้จากวิธีการของ Nei-Gojobori ดำเนินการในการเริ่มต้น มาตรการนี้ประเภทของการเลือกที่เกิดขึ้นในแต่ละสถานที่ การทดสอบสมมติฐานคือความเป็นกลาง (dN dS =); ถ้า DN / dS ข 1, nonsynonymous แล้วเว็บไซต์อยู่ภายใต้ข้อ จำกัด การคัดเลือกหรือบริสุทธิ์ความดัน(การเลือกลบ); DN / DS N 1 แสดงให้เห็นการเลือกบวกและDN / DS = 1 แสดงให้เห็นความเป็นกลาง. 3 ผลสิบห้าสายพันธุ์ที่ถูกระบุในหมู่ 108 ไอโซเลท, เผด็จการจากเศษโดยO3: K6 (n = 52; 48%) O4: K8 (n = 20; 18%) และ O1: กุด(n = 12; 11%) เพียงสี่สายพันธุ์ (สอง O4: K8 และสอง O1: กุด) จากผลิตภัณฑ์อาหารทะเลแสดงความเป็นหนึ่งในสายพันธุ์เหล่านี้ เก้าสิบสามในทางคลินิกแต่มีเพียงสองของเชื้อผลิตภัณฑ์อาหารทะเลเป็นบวกTDH แต่ไม่มีเชื้อถือ TRH ยีน (ตารางที่ 1). ตัวเลขของอัลลีลตั้งข้อสังเกตสำหรับแต่ละสถานที่ MLST ถูกกระจายดังต่อไปนี้: 16 (dnaE), 19 (gyrB), 20 (recA), 17 (DTDs) 14 (pntA), 19 (pyrC) และ 18 (tnaA) จำนวนเว็บไซต์ polymorphic สังเกตที่แตกต่างกันต่อสถานที่ตั้งแต่วันที่17 (pntA) ถึง 50 (recA) ความหลากหลายเบื่อหน่ายอยู่ในช่วงที่จะแบบแผนที่ 0.010 จาก0.025 กับระดับสูงสุดของความหลากหลายและร้อยละของ polymorphic เว็บไซต์สังเกต DTDs (0.025, 6.77%) และมี recA (0.022, 6.86%) อัตราส่วนของnonsynonymous เพื่อแทนความหมายเหมือนกัน (DN / DS) ต่ำกว่า 1 สำหรับสถานที่แต่ละวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบเลือกสำหรับความเป็นกลาง (ตารางที่ 2). สามสิบหนึ่ง STs ที่แตกต่างกันมีการระบุและ 17 STs เป็นนวนิยายเพื่อการศึกษาครั้งนี้ ST-3 เป็นชนิดที่มีมากที่สุด (53 จาก 108 แยก); แยกกับ ST นี้ถูกพบอยู่ในสามสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน (O3: K6, n = 47, O1: กุด, n = 5 และ O4: K68, n = 1 ) แปด STs เพิ่มเติมแสดงโดยมากกว่าหนึ่งแยกรวมทั้ง ST-189 (n = 8; ทุก O4: K8), ST-265 (n = 6 ทั้งหมด O4: K8), ST-345 (n = 6 ทั้งหมด O4: K8), ST-199 (n = 4 ทั้งหมด O1: กุด), ST-337 (n = 3 ทั้งหมด O4: K34), ST-8 (n = 2; O1: กุดและO1: K56) ST- 492 (n = 2 ทั้งสอง O3: K6) และ ST-787 (n = 2 ทั้งสองO4: K68). การวิเคราะห์ eBURST เปิดเผยสี่คอมเพล็กซ์ clonal (CC3, CC345 CC120, (. รูปที่ 1) และ CC8) และ 20 singletons . CC3 ประกอบด้วย 58 สายพันธุ์จากห้าSTs [ST-3, ผู้ก่อตั้ง; ST-431, SLV (gyrB); ST-435, SLV (recA); ST- 661, SLV (pntA); และ ST-787 SLV (pyrC)] และสาม serovars (O3: K6, O1: กุดและ O4: K68) ST-3 O3: K6 โคลนโรคระบาดตั้งอยู่ในCC3 CC8 ประกอบด้วยสอง STs (ST-8 และ ST-783) ที่แตกต่างกันที่ pyrC

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . แบคทีเรียไอโซเลท
รวม 108 tdh สามารถหายจาก 2007
2011 ได้ถูกรวมไว้ในการศึกษานี้ ในหมู่เหล่านี้คือสายพันธุ์ 96
หายจากอาการทางคลินิก และ 12 จากผลิตภัณฑ์อาหารทะเล ตัวอย่าง
เป็น pre อุดมในด่างเปปโตนกลางน้ำ ( APW )
ที่มีโซเดียมคลอไรด์ที่อุณหภูมิ 37 องศา C 3.5 ข้ามคืนก่อนณจะ
ไธโอซัลเฟตซิเตรตน้ำดีเกลือน้ำตาลทราย ( มาตรฐาน ) วุ้น พวกเงาสีเขียว
อาณานิคมจากมาตรฐานคัดเลือกตัวถัดไปใช้
ออกซิเดชันทดสอบ , สามตาลเหล็ก ( 2 ) ปฏิกิริยาและ serotyped โดย
การจับกลุ่มสไลด์กับ tdh แอนติซีรัม ( เดนก้าเซย์เค็น
, โตเกียว , ญี่ปุ่น ) .
2.2 . จริยธรรมงบ
เหล่านี้ทั้งหมด 96 คลินิกจำนวนตัวอย่างอุจจาระและเก็บรวบรวมโดย
พยาบาลในโรงพยาบาลที่ได้รับมอบหมายจากผู้
โครงการเฝ้าระวังโรคอาหารเป็นพิษของมณฑลกวางตุ้ง ทั้งหมด กลุ่มตัวอย่างที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้คือ ไม่ระบุชื่อ
และได้รับการอนุมัติจากสถาบัน -
ล คณะกรรมการของศูนย์ควบคุมและป้องกันโรค จังหวัดดองกวง -
.
2.3 การเตรียมโครโมโซมดีเอ็นเอดีเอ็นเอจากแบคทีเรียไอโซเลท

qiaamp ดีเอ็นเอโดยใช้ชุดมินิ ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ( QIAGEN (
เซี่ยงไฮ้ , จีน ) สารสกัดดีเอ็นเอที่ถูกละลายในบริษัท– EDTA ( 10 mm
ทริส– HCl , 0.10 mM EDTA [ pH 8.0 ) บัฟเฟอร์ และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา เจือจาง
ดีเอ็นเอแม่แบบถูกทำหมันน้ำกลั่นขอรับ
ความเข้มข้นสุดท้ายประมาณ 100 ng / ml
2.4 . การตรวจหายีน
พิษการวิเคราะห์เทคนิค multoplex PCR ทำการตรวจสอบสถานะของ
tdh และเจ้าชาย . โดยการใช้วงจรความร้อน ( biometra , Inc . ,
biometra tgradient G ö ttingen , เยอรมนี ) กับก่อนหน้านี้
ตีพิมพ์ PCR ( bej et al . , 1999 ) ยีนเป้าหมายคือ ขยาย
หลังจากที่เริ่มต้นที่ 94 ° C ( นาน 3 นาที กับ 25 รอบประกอบด้วย 94 ° C
40 , 60 องศา C นาน 40 วินาทีและ 72 ° C 40 และสุดท้ายขั้นตอน 72 ° C )
4 นาที ขยายผลิตภัณฑ์แยกบน 1% อย่างไรก็ตาม -
โรสเจล เปื้อน 1 % คู่โบรไมด์ และภาพลักษณ์ของการใช้เจลหมอ
EQ ระบบชีวภาพราดอิงค์ , Hercules , CA , USA ) .
2.5 . mlst
7 ความเชื่อ mlst ระบบที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( กอนซาเลซ escalona
et al . , 2008 ) ใช้กับส่วนของเชื้อ การ dnae ( ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ -
ASE III , α subunit )gyrb ( gyrase , ดีเอ็นเอ , 1 B ) รีก้า ( recombinase )
dtds ( ถ่ายทอดวิชา 3-dehydrogenase ) pnta ( transhydrogenase α , 1 ) ,
pryc ( dihydro orotase ) และ tnaa ( tryptophanase ) ยีนวิเคราะห์
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ลำดับ ไพรเมอร์ และเงื่อนไข เพื่อการขยาย PCR
มีอยู่ใน http : / / pubmlst . org / vparahaemolyticus /
ข้อมูล / protocol.html . ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกใช้ qiaquick PCR
?ชุดบำบัดน้ำเสียตามที่อธิบายไว้โดยผู้ผลิต ( เพิ่ม ) ลำดับวงจร
ดำเนินการทั้งดีเอ็นเอเส้นเอ็นเอเป้าหมาย
โดยใช้ไพรเมอร์ bigdye M13 สากลและเคมี ( เพอร์กินเอลเมอร์ประยุกต์
Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) , เริ่มต้น ( 96 ° C
1 นาที ตามด้วย 25 รอบ 96 ° C ( 10 , ไพรเมอร์ อบอ่อนที่อุณหภูมิ 50 องศา C
5 S ,และส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 4 นาที ลำดับ
ข้อมูลใช้ abi ปริซึม 3100 พันธุกรรมวิเคราะห์ ( เพอร์กินเอลเมอร์
Applied Biosystems ) การเรียงตัวของลำดับการใช้ dnastar
( v7.10 รุ่น ) ตัวเลขสำหรับอัลลีลและประเภทลำดับ
( STS ) ได้รับมอบหมายให้ตาม pubmlst V . parahaemolyticus ฐานข้อมูล
.
2.6 มอบหมายให้งานเชิงซ้อน
eburst โปรแกรม V3 .0 ถูกใช้เพื่อระบุที่แตกต่างกันรูปแบบ
เชิงซ้อน ( http : / / eburst . mlst . สุทธิ ) จำกัดส่วนใหญ่กลุ่มความหมาย
ถูกใช้เพื่อกำหนดรูปแบบเชิงซ้อน เช่น อย่างน้อยก็หกเจ็ด
อัลลีลมีเหมือนกันที่จะถูกรวมอยู่ในกลุ่มเดียวกัน หรืองานที่ซับซ้อน (
feil et al . , 2004 ) มีความเชื่อมั่นทางสถิติสำหรับชนิดของบรรพบุรุษ
ทดลองใช้ 1 , 000 resamplings บูสแตรปสองระบบที่แตกต่างกัน
ถือว่าตัวแปรความเชื่อเดียว ( SLV ) เมื่อพวกเขาแตกต่างจากแต่ละอื่น ๆในสถานที่เดียว
. สอง - พันธุ์ ( dlvs ) อ้างถึงสอง
STS ที่มีเพียงสองในเจ็ดของ .
2.7 . ทดสอบการ
เริ่มต้น ( Version 2.0 ) แพคเกจซอฟต์แวร์ที่ใช้ในการคำนวณ
" ดัชนีมาตรฐาน " ของสมาคม ( IAS ) ( haubold และฮัดสัน
2000 )วิธีทางสถิติสำหรับการทดสอบสมมติฐานนี้ว่างของ
สมดุลการเชื่อมโยง เช่น ถ้า IAS = 0 แล้วอัลลีลเป็นอิสระกระจายเลย
ตามลำดับ การวิเคราะห์ ( อัลลีลอยู่ในสมดุลและเชื่อมโยง )
การเกิดขึ้นบ่อย อัตราส่วนระหว่าง
ตัวเลขตรงกัน ( DS ) และ nonsynonymous ( DN ) substi -
tutions ถูกคำนวณโดยวิธีการของเนย– gojobori
ในการเริ่มต้นมาตรการนี้เลือกประเภทที่เกิดขึ้นในแต่ละ
- . การทดสอบสมมติฐานสำหรับความเป็นกลาง ( DN = DS ) ; ถ้า DN /
d B 1 แล้ว nonsynonymous เว็บไซต์ที่อยู่ภายใต้การบังคับหรือกดดัน
ชำระ ( เลือกลบ ) ; DN / DS / 1 ระบุ
เลือกบวกและ DN / DS = 1 แสดงความเป็นกลาง
3 ผลลัพธ์
สิบห้า ( ระบุใน 108 สายพันธุ์ Domi -
nated O3 : โดยK6 ( n = 52 ; 48 % ) o4 : กานต์แอร์ ( n = 20 ; 18 % ) และ 01 : กุด
( n = 12 ; 11 % ) เพียงสี่สายพันธุ์ ( 2 o4 : กานต์แอร์ และสอง 01 : กุด )
จากผลิตภัณฑ์อาหารทะเล ( แสดงหนึ่งของเหล่านี้ เก้าสิบ -
3 ของคลินิก แต่เพียงสองของผลิตภัณฑ์อาหารทะเลจาก tdh
เป็นบวก อย่างไรก็ตาม ไม่มีการแยกอุ้ม trh ยีน ( ตารางที่ 1 )
.
จำนวนอัลลีลที่พบในแต่ละ mlst ความเชื่อ
ถูกแจกจ่าย1 : 16 ( dnae ) 19 ( gyrb ) 20 ( รีก้า ) , 17 ( dtds ) , 14 ( pnta ) 19 ( pyrc )
3 ( tnaa ) จำนวนของเว็บไซต์ที่แตกต่างกันที่มีต่อตนสังเกต
17 ( pnta ) 50 ( รีก้า ) i ที่มีความหลากหลายระหว่าง 0.010

0.025 ที่มีระดับสูงสุดของความหลากหลายและร้อยละของจำนวนเว็บไซต์
) dtds ( 0.025 , 6.77 % ) และรีก้า ( 0.022 , 6.86 % ) อัตราส่วนของ
nonsynonymous เพื่อพ้องแทน ( DN / DS ) ต่ำกว่า 1
แต่ละโลกัส โดยใช้การทดสอบความเป็นกลาง ( ตารางที่ 2 ) .
สามสิบหนึ่ง STS แตกต่างกัน พบ 17 STS เป็นนวนิยาย
เพื่อการศึกษา st-3 เป็นประเภทชุกชุมมากที่สุด ( 53 จาก 108 แยก ) ;
ไอโซเลทที่เซนต์นี้พบใน 3 ภูมิที่แตกต่างกัน ( O3 : K6
, n = 47 01 : กุด , n = 5 และ o4 : k68 , n = 1 )แปด STS เพิ่มเติม
แสดงโดยมากกว่าหนึ่งแยก รวมทั้ง st-189 ( n = 8 ; ทั้งหมด
o4 : กานต์แอร์ ) st-265 ( N = 6 ; ทั้งหมด o4 : กานต์แอร์ ) st-345 ( N = 6 ; ทั้งหมด o4 : กานต์แอร์ ) st-199
( n = 4 ; ทั้งหมด 01 : st-337 ( กุด ) N = 3 ; ทั้งหมด o4 : k34 ) st-8 ( n = 2 ; 01 : 01 : k56 และกุด
) st-492 ( n = 2 ; 2 O3 : K6 ) และ st-787 ( n = 2 ; 2
o4 : k68 )
eburst พบสี่รูปแบบการวิเคราะห์เชิงซ้อน ( cc3 cc345 cc120 , ,
cc8 ) , และและ 20 singletons ( รูปที่ 1 ) cc3 จำนวน 58 ไอโซเลตจาก
5 [ st-3 STS , ผู้ก่อตั้ง ; st-431 SLV , ( gyrb ) ; st-435 SLV ( รีก้า , เซนต์ - 661 ) ;
, ( pnta SLV ) ; และ st-787 SLV , ( pyrc ) ] และสามซีโรวาร์ ( O3 : K6
01 : และ , กุด o4 : k68 ) การ st-3 O3 : K6
cc3 โคลนซึ่งตั้งอยู่ภายใน . cc8 ประกอบด้วยสองระบบ ( st-8 และ st-783 ) ต่างกันที่ pyrc