MATERIALS AND METHODSDNA Preparatio

MATERIALS AND METHODS
DNA Preparations
Human DNA was extracted from peripheral blood lymphocytes of 190
Swedish blood donors to serve as control samples. The forensic evidence materials were purified by one of three
methods. The Wizard
®
Genomic DNA
Extraction Kit (Promega, Madison, WI,
USA) was used to extract DNA from
most of the evidence materials collected
by cotton swabs and blood. Chelex
®
100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, USA) was used to extract DNA
from bloodstains. This method was developed for extracting DNA from forensic samples (32). Hair samples were extracted using an extraction procedure
based on proteinase K and DTT (31).
Primer Design and PCR
The software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA) was used for PCR and sequence
primer design. An optimal target selection was made to cover most of the informative polymorphism in the D-loop. On
the basis of the determined heterogeneity in the Swedish and other populations
(14), a number of informative regions
outside the D-loop were chosen for
analysis in addition to the D-loop. These
regions are highly polymorphic, with
SNP frequencies in a range between
0.15 and 0.50, serving as suitable mt DNA markers for forensic identification.
HVI and HVII were PCR amplified
in two separate reactions. Each of the
two templates was analyzed using four
sequencing primers per fragment, including the forward PCR primer. A
large number of the polymorphisms in
the D-loop will be determined based on
these eight short overlapping sequences. The coding region fragments
were amplified in 11 separate reactions,
followed by analysis in 11 pyrosequencing reactions using the forward
PCR primer as sequencing primer.
Each of the regions outside the D-loop
contains from two to eight polymorphic
sites within the range of nucleotides (50
nucleotides) that can be read by the
SQA reaction. Control-sample PCRs
contain 1.5 µL DNA, 200 nM of each
primer (Table 1), 200 µM of each
dNTP, 1.5 mM MgCl
2
, 2 U AmpliTaq
Gold
®
DNA polymerase, and 1× GeneAmp
®
PCR Buffer II (Applied Biosystems) in a total volume of 70 µL. PCR
amplifications for the forensic materi als contain 10 µL DNA, 200 nM of
each primer, 200 µM of each dNTP, 2.4
mM MgCl
2
, 10 U AmpliTaq Gold
DNA polymerase, 1.2× GeneAmp PCR
Buffer II, 0.16 mg/mL BSA, and 10%
glycerol in a total volume of 100 µL.
The amplifications were performed in a GeneAmp PCR System 9600 (Applied
Biosystems). The samples were kept
for 10 min at 95°C, followed by 40 cycles of 30 s at 95°C, 45 s at 60°C (53°C
for the coding region primers), 60 s at
72°C, with a final extension step for 7
min at 72°C.
Template Preparation and
Pyrosequencing Reaction
Streptavidin-coated beads were used
as a solid-phase support to obtain single-stranded biotinylated PCR products,
as described by Pyrosequencing AB.
When necessary, 440 ng Single-Stranded DNA Binding Protein
®
(SSB)
(Amersham Pharmacia Biotech AB,
Uppsala, Sweden) were added to the
primed DNA template before pyrosequencing (23). The sequencing was performed at room temperature, and 15 µL

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการและวัสดุ
เตรียมดีเอ็นเอ
ดีเอ็นเอมนุษย์ถูกแยกจากเลือดต่อพ่วง lymphocytes ของ 190
ผู้บริจาคเลือดสวีดิชเป็นควบคุมตัวอย่าง วัสดุหลักฐานทางนิติวิทยาศาสตร์ได้บริสุทธิ์ โดยสาม
วิธีการ ตัวช่วยสร้าง
®
Genomic DNA
ชุดสกัด (Promega เมดิสัน WI,
สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เพื่อแยกดีเอ็นเอจาก
รวบรวมทั้งวัสดุหลักฐาน
ฝ้าย swabs และเลือด Chelex
®
100 (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส,
CA, USA) ใช้ในการแยกดีเอ็นเอ
จาก bloodstains วิธีการนี้ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อแยกดีเอ็นเอจากตัวอย่างทางกฎหมาย (32) ตัวอย่างผมถูกสกัดโดยใช้กระบวนการสกัด
ตาม proteinase K และ DTT (31) .
ออกแบบพื้นและ PCR
ซอฟต์แวร์ Express รองพื้น (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ CA,
สหรัฐอเมริกา) ใช้ PCR และลำดับ
ออกแบบรองพื้น การเลือกเป้าหมายที่เหมาะสมที่จะครอบคลุมส่วนใหญ่ของโพลิมอร์ฟิซึมข้อมูลใน D-ลูป ใน
พื้นฐานของ heterogeneity กำหนดในสวีเดนและอื่น ๆ populations
(14) จำนวนข้อมูลภูมิภาค
นอกวง D ถูกเลือก
วิเคราะห์นอกวง D เหล่านี้
ภูมิภาคมี polymorphic สูง ด้วย
SNP ความถี่ในช่วงระหว่าง
0.15 และ 0.50 ให้บริการเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอเอ็มทีเหมาะสมสำหรับรหัสนิติเวช
HVI HVII นำ PCR ขยาย
2 แยกปฏิกิริยา แต่ละ
แม่สองถูกวิเคราะห์โดยใช้สี่
ไพรเมอร์ลำดับต่อส่วน รวมถึงรองพื้น PCR ไปข้างหน้า A
polymorphisms ในจำนวนมาก
D-ลูปจะถูกกำหนดตาม
นี้แปดสั้นลำดับที่ทับซ้อนกัน ชิ้นส่วนภูมิภาครหัส
ถูกขยายในปฏิกิริยาแยก 11,
ตามการวิเคราะห์ในปฏิกิริยา pyrosequencing 11 ที่ใช้ไปข้างหน้า
PCR พื้นเป็นลำดับรองพื้น.
แต่ละภูมิภาคนอกวง D
ประกอบด้วยตั้งแต่สองถึงแปด polymorphic
ไซต์ของนิวคลีโอไทด์ (50
นิวคลีโอไทด์) ที่สามารถอ่านได้โดย
SQA ปฏิกิริยาได้ ตัวอย่างควบคุม PCRs
ประกอบด้วย 1.5 µL DNA, 200 nM แต่ละ
พื้น (ตาราง 1), µM 200 แต่ละ
dNTP, 1.5 มม. MgCl
2
, 2 U AmpliTaq
ทอง
®
ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส และ 1 × GeneAmp
®
PCR บัฟเฟอร์ II (Biosystems ใช้) ในไดรฟ์ข้อมูลทั้งหมดของ 70 µL PCR
amplifications สำหรับ materi ทางนิติวิทยาศาสตร์ ยังประกอบด้วย 10 µL DNA, 200 nM ของ
แต่ละพื้น µM 200 ของแต่ละ dNTP, 2.4
มม. MgCl
2
, 10 U AmpliTaq ทอง
ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส, 1.2 × GeneAmp PCR
กันชน II บีเอสเอ 0.16 mg/mL และ 10%
กลีเซอรในปริมาณรวมของ 100 µL
amplifications ที่ได้ดำเนินการใน GeneAmp PCR ระบบ 9600 (ประยุกต์
Biosystems) ตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้
ใน 10 นาทีที่ 95° C ตามรอบ 40 30 s ที่ 95° C, 45 s ที่ 60° C (53° C
สำหรับไพรเมอร์ภูมิภาครหัส), 60 s ที่
° C 72 ขยายสุดท้ายขั้นตอน 7
นาทีที่ 72 ° C.
เตรียมแม่แบบ และ
ปฏิกิริยา Pyrosequencing
Streptavidin ที่เคลือบลูกปัดถูกใช้
ขณะของแข็งเฟสเดียวควั่น biotinylated รับผลิตภัณฑ์ PCR,
ตามที่อธิบายไว้ โดย Pyrosequencing AB.
เมื่อจำเป็น 440 ng เดียวควั่น DNA Binding โปรตีน
®
(SSB)
(ชีวภาพ Pharmacia Amersham AB,
Uppsala สวีเดน) ถูกเพิ่มเข้าไป
ดีเอ็นเอแม่แบบที่มีการรองก่อน pyrosequencing (23) ลำดับที่ทำที่อุณหภูมิห้อง และ 15 µL

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
เตรียมดีเอ็นเอ
ของมนุษย์ดีเอ็นเอที่สกัดจากเซลล์เม็ดเลือดขาวในเลือดจาก 190
ผู้บริจาคโลหิตสวีเดนเพื่อทำหน้าที่เป็นตัวอย่างการควบคุม นิติวิทยาศาสตร์วัสดุหลักฐานบริสุทธิ์โดยหนึ่งในสามของ
วิธีการ ตัวช่วยสร้าง
®
จีโนมดีเอ็นเอ
สกัด Kit (Promega, เมดิสัน, WI,
USA) ถูกนำมาใช้ในการสกัดดีเอ็นเอจาก
ส่วนใหญ่วัสดุหลักฐานที่รวบรวม
โดย swabs ผ้าฝ้ายและเลือด Chelex
®
100 (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ, ดาว,
CA, USA) ถูกนำมาใช้ในการสกัดดีเอ็นเอ
จากคราบเลือด วิธีการนี้ได้รับการพัฒนาสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างนิติวิทยาศาสตร์ (32) ตัวอย่างผมถูกสกัดโดยใช้ขั้นตอนการสกัด
ขึ้นอยู่กับโปร K และ DTT (31)
ศึกษาการออกแบบและ PCR
ซอฟต์แวร์ประถมศึกษาExpress (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี้, CA,
USA) ที่ใช้สำหรับวิธี PCR และลำดับ
การออกแบบไพรเมอร์ การเลือกเป้าหมายที่เหมาะสมที่สุดที่ถูกสร้างขึ้นเพื่อให้ครอบคลุมมากที่สุดของข้อมูลในหลายรูปแบบ D-ห่วง บน
พื้นฐานของความแตกต่างในความมุ่งมั่นของประชากรสวีเดนและอื่น ๆ
(14), จำนวนพื้นที่ให้ข้อมูล
นอก D-ห่วงถูกเลือกสำหรับ
การวิเคราะห์ที่นอกเหนือไปจาก D-ห่วง เหล่านี้
เป็นภูมิภาค polymorphic สูงด้วย
ความถี่ SNP อยู่ในช่วงระหว่าง
0.15 และ 0.50 การให้บริการเครื่องหมายดีเอ็นเอ mt เหมาะที่จะเป็นสำหรับประชาชนทางกฎหมาย
และเอชวีไอ HVII ถูก PCR ขยาย
ในสองปฏิกิริยาที่แยกต่างหาก แต่ละ
สองแม่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้สี่
ไพรลำดับต่อชิ้นรวมทั้งไปข้างหน้าไพรเมอร์พีซีอาร์
จำนวนมากของความหลากหลายใน
D-วงจะถูกกำหนดขึ้นอยู่กับ
เหล่านี้แปดลำดับที่ทับซ้อนกันสั้น การเข้ารหัสเศษภูมิภาค
ถูกขยายใน 11 ปฏิกิริยาแยก
ตามด้วยการวิเคราะห์ใน 11 ปฏิกิริยา pyrosequencing ใช้ไปข้างหน้า
ไพร PCR เป็นลำดับไพรเมอร์
แต่ละภูมิภาคนอก D-ห่วง
มี 2-8 polymorphic
เว็บไซต์ในช่วงของนิวคลีโอ (50
นิวคลีโอ) ที่สามารถอ่านได้โดย
ปฏิกิริยา SQA PCRs ควบคุมตัวอย่าง
มี 1.5 ไมโครลิตรดีเอ็นเอ 200 นาโนเมตรของแต่ละ
ไพรเมอร์ (ตารางที่ 1), 200 ไมโครโมลาร์ของแต่ละ
dNTP 1.5 มิลลิ MgCl
2
, 2 U AmpliTaq
ทอง
®
ดีเอ็นเอโพลิเมอร์และ 1 × GeneAmp
®
PCR บัฟเฟอร์ II (Applied Biosystems) ในปริมาณรวมของ 70 ไมโครลิตร PCR
เครื่องขยายเสียงสำหรับ ALS materi นิติวิทยาศาสตร์มี 10 ไมโครลิตรดีเอ็นเอ 200 นิวตันเมตร
แต่ละไพรเมอร์, 200 ไมโครโมลาร์ของแต่ละ dNTP 2.4
มิลลิ MgCl
2
, 10 U AmpliTaq ทอง
ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ 1.2 × GeneAmp PCR
บัฟเฟอร์ที่สอง 0.16 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรบีเอสเอและ 10%
กลีเซอรอลในปริมาณรวมของ 100 ไมโครลิตร
เครื่องขยายเสียงที่ได้รับการดำเนินการในระบบ GeneAmp PCR 9600 (Applied
Biosystems) กลุ่มตัวอย่างที่ถูกเก็บไว้
เป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 ° C ตามด้วย 40 รอบที่ 30 s ที่ 95 ° C, 45 s ที่ 60 ° C (53 ° C
สำหรับการเขียนโปรแกรมไพรภูมิภาค), 60 s ที่
72 ° C ด้วย ขั้นตอนสุดท้ายสำหรับการขยาย 7
นาทีที่ 72 ° C
แม่และการเตรียม
pyrosequencing ปฏิกิริยา
ลูกปัด Streptavidin เคลือบถูกนำมาใช้
เป็นสนับสนุนเฟสของแข็งที่จะได้รับผลิตภัณฑ์พีซีอาเดียวติด biotinylated,
ตามที่อธิบาย pyrosequencing AB
เมื่อมีความจำเป็น 440 เส้นทางเดี่ยว ดีเอ็นเอเกลียวโปรตีนจำเป็น
®
(SSB)
(Amersham Pharmacia ไบโอเทค AB,
Uppsala, สวีเดน) ถูกเพิ่มเข้าไปใน
ดีเอ็นเอแม่แบบรองพื้นก่อน pyrosequencing (23) ลำดับที่ได้รับการดำเนินการที่อุณหภูมิห้องและ 15 ไมโครลิตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการเตรียม

ดีเอ็นเอของมนุษย์ดีเอ็นเอจากเม็ดเลือดขาวลิมโฟซัยต์ของ 190
สวีเดนผู้บริจาคโลหิตเพื่อเป็นตัวอย่างควบคุม วัสดุหลักฐานทางนิติเวช มีความบริสุทธิ์ โดยหนึ่งในสามของ
วิธี ตัวช่วยสร้างการสกัดดีเอ็นเอ®


ชุด ( promega Madison , WI ,
, USA ) ถูกใช้เพื่อสกัดดีเอ็นเอจากหลักฐานส่วนใหญ่วัสดุเก็บ

โดย swabs ฝ้าย และเลือด chelex

®100 ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules ,
CA , USA ) ถูกใช้เพื่อสกัดดีเอ็นเอ
จากรอยเลือด วิธีนี้ถูกพัฒนาสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างทางนิติเวช ( 32 ) ตัวอย่างที่ผมใช้เป็นขั้นตอนการสกัด
ตามโปร K ส่วน ( 31 )

บริการออกแบบไพรเมอร์และ PCR ไพรเมอร์ซอฟต์แวร์ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา
) ใช้วิธี PCR และออกแบบไพรเมอร์ลำดับ

การเลือกเป้าหมายที่เหมาะสมที่สุดได้ครอบคลุมมากที่สุดของรูปแบบข้อมูลใน d-loop . บนพื้นฐานของการพิจารณา

สามารถในประชากร สวีเดน และ อื่นๆ ( 14 ) จำนวนข้อมูลภูมิภาค
นอก d-loop ถูกเลือกสำหรับ
การวิเคราะห์นอกเหนือไปจาก d-loop . ภูมิภาคเหล่านี้จะขอจำนวนด้วย

, SNP ความถี่ในช่วงระหว่าง
0.15 และ 0.50 ,ให้เหมาะสำหรับการ MT ดีเอ็นเอนิติเวช และได้ขยาย hvii
ค่า )
2 แยกปฏิกิริยา ของแต่ละ
2 แม่แบบวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเชื้อ 4
, รวมทั้งรองพื้น PCR ไปข้างหน้า มีจำนวนมากของความหลากหลายใน


d-loop จะตัดสินใจบนพื้นฐานเหล่านี้แปดสั้นซ้อนกัน ลำดับ เขตเศษ
นะครับกำลังขยายใน 11 ปฏิกิริยาแยก
ตามด้วยการวิเคราะห์ในปฏิกิริยา PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ 11 ไพโรซีเควนซิงเป็นลำดับต่อไป

รองพื้น ของแต่ละภูมิภาค นอกจาก d-loop
ประกอบด้วยสองถึงแปดเว็บไซต์ polymorphic
ภายในช่วงของนิวคลีโอไทด์ ( 50
นิวคลีโอไทด์ ) ซึ่งสามารถอ่านได้โดย
SQA ปฏิกิริยา ตัวอย่างควบคุม pcrs
ประกอบด้วย 1.5 µ L ดีเอ็นเอ , 200 nm ของแต่ละ
primer ( ตารางที่ 1 )200 µ M ละ
dntp 1.5 มม. MgCl
2
2 U amplitaq ทอง


® DNA polymerase และ 1 × geneamp

® PCR buffer 2 ( Applied Biosystems ) ในปริมาตรรวม 70 µ L )
amplifications สำหรับ ALS materi นิติเวชดีเอ็นเอประกอบด้วย 10 ลิตรµ , 200 นาโนเมตร ของ
แต่ละ primer , 200 µ M ของแต่ละ dntp 2.4 mm
2

คลอไรด์ 10 U amplitaq ทอง
DNA polymerase 1.2 × geneamp PCR
บัฟเฟอร์ 2 , 0.16 มก. / มล. และ 10 %
บีเอสเอกลีเซอรอลในปริมาณรวม 100 µ L .
amplifications แสดงในระบบ PCR เป็น geneamp 9600 ( ประยุกต์
Biosystems ) ตัวอย่างถูกเก็บ
10 นาทีที่ 95 องศา C ตามด้วย 40 รอบ 30 s ที่ 95 องศา C 45 S 60 ° C ( 53 ° C
สำหรับรหัสดีเอ็นเอภูมิภาค ) , 60 s
72 ° C ด้วยขั้นตอนการสุดท้ายสำหรับ
7 นาทีที่ 72 ° C


และการเตรียมแม่แบบปฏิกิริยาไพโรซีเควนซิงลูกปัดเคลือบ streptavidin ใช้
เป็นส่วนสนับสนุนให้ได้เดียวติดไล PCR ผลิตภัณฑ์
ตามที่อธิบายไว้โดยไพโรซีเควนซิง AB
เมื่อจำเป็น ถ้าหลุดเดี่ยวเกลียวดีเอ็นเอโปรตีน®

( SSB )
( ที่มุ่งมั่นพัฒนา AB
Uppsala , สวีเดน ) ถูกเพิ่มไปยัง
primed แม่แบบก่อนไพโรซีเควนซิง ( ดีเอ็นเอ 23 ) การจัดกระทำที่อุณหภูมิห้อง และ 15 µ l