2. Methods2.1. Preparation of GBS-s

2. Methods
2.1. Preparation of GBS-spiked samples

Streptococcus agalactiae (strain ATCC 12386) was cultured overnight on Columbia Blood Agar (CBA) at 37 °C in a 10% CO2 atmosphere and resuspended in sterile phosphate buffered saline (PBS) to an optical density of ~ 1.5. Tenfold serial dilutions were prepared with the number of colony forming units per ml (CFU·ml− 1) ascertained by the spread plate method (Cruickshank). Triplicate aliquots (100 μl) of duplicate serial dilutions were plated onto CBA plates. Following overnight incubation at 37 °C in 10% CO2 atmosphere individual colonies were counted and the mean CFU·ml− 1 count determined. Aliquots (200 μl) of the GBS suspension were stored at − 20 °C until required. Each aliquot of GBS cells underwent one freeze-thaw cycle only. Aliquots (2.8 ml) of sterile PBS or whole EDTA-treated human blood were inoculated with cell suspension (200 μl) containing either 6.3 × 104 cfu·μl− 1 (“high spike” sample) or 63 cfu·μl− 1 (“low spike” sample) prior to DNA extraction.

2.2. Sample pre-lysis protocols

Two protocols for sample pre-lysis prior to DNA extraction were compared: enzymatic lysis using achromopeptidase (ACH, lysyl endopeptidase, EC 3.4.21.50) and mechanical lysis using bead-beating. Controls were extracted without any pre-lysis.

For enzymatic lysis, ACH (100kU; Sigma-Aldrich, Gillingham, U.K.) was dissolved in 5.2 ml of Tris-EDTA buffer (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Sample aliquots (200 μl) were mixed with an equal volume of ACH stock (200 μl, containing 3.85kU ACH) and incubated at room temperature (22 °C) for 5 min. For spiked saline samples, ACH was inactivated prior to extraction by heating to 95 °C for 5 min. Preliminary experiments found the efficiency of ACH lysis in EDTA-blood was significantly reduced compared to lysis in saline (data not shown). Dilution (1:4) with Tris–HCl buffer (10 mM, pH 8.0) prior to ACH treatment resolved this, so blood samples were diluted before addition of ACH and incubation. For blood samples, instead of heating (which caused blood to clot), ACH was inactivated prior to extraction by addition of lysis buffer from the extraction kit being evaluated.

For mechanical lysis, samples were processed by bead-beating using Pathogen Lysis Tubes S (Qiagen, Manchester, UK). Saline or blood (400 μl) spiked with GBS cells were mixed with lysis buffer (100 μl) containing anti-foam Reagent DX (0.67% v/v) in a Lysis Tube. The recommended lysis buffer for each extraction protocol being evaluated was used (Qiagen Buffer ATL, Fuji Buffer LDB or Roche Lysis Buffer). Bead beating was done using a Mini-BeadBeater-1 (Biospec Products Inc., Bartlesville, USA) on full speed for 90 s.

2.3. DNA extraction protocols

Following sample pre-lysis, five different DNA extraction kits were compared (Table 1): QIAamp Blood Mini kit (Qiagen); QIAamp UCP Pathogen Mini kit (Qiagen); QuickGene DNA Whole Blood kit S (Fuji); MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, US); and SpeedXtract Nucleic Acid Kit 200 (Qiagen). Each kit was used according to the manufacturers' instructions, with one exception. The SpeedXtract kit uses two rounds of binding onto magnetic beads, leaving the target DNA in solution after the second magnetic separation. The protocol was modified to include ACH pre-lysis between the two magnetic separations, prior to removal of the magnetic beads. Buffer EN (400 μl) was added to spiked EDTA whole blood (200 μl) and incubated with SpeedXtract Suspension A magnetic beads, according to the manufacturer's protocol for liquid samples. Following magnetic separation, removal of supernatant and a wash step using Buffer EN, the Suspension A beads were resuspended in ACH (100 μl) and incubated at room temperature for 5 min followed by heating to 95 °C for 5 min. After ACH treatment, Buffer SL (100 μl) was added and samples were heated again to 95 °C for 5 min before completing the manufacturer's protocol. Controls were extracted without ACH by resuspending the Suspension A magnetic beads in Buffer SL (200 μl) and heating to 95 °C for 10 min. It was not feasible to incorporate bead-beating into the SpeedXtract protocol without major deviation from the manufacturer's protocol. Bead-beating would either lyse bacterial cells in blood prior to the first magnetic separation (with loss of the bacterial DNA) or would require bead-beating of the magnetic particles prior to the second magnetic separation (with possible mechanical breakdown of the particles).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วิธี2.1. เตรียมตัวอย่างที่ได้ถูกแทง GBSอุณหภูมิ agalactiae (สายพันธุ์ ATCC 12386) ถูกล้างค้างคืนในโคลัมเบียวุ้นเลือด (CBA) ที่ 37 ° C ในบรรยากาศ 10% CO2 และ resuspended ในน้ำเกลือปลอดเชื้อฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) ที่มีความหนาแน่นออปติคอล ~ 1.5 จัดทำเจือจาง serial ออก ด้วยหมายเลขของอาณานิคมสร้างหน่วยต่อมิลลิลิตร (CFU·ml− 1) ตรวจสอบ โดยวิธีจานแพร่กระจาย (Cruickshank) ขึ้น Aliquots ตสแควร์ (100 μl) ของเจือจางประจำสินค้าที่ซ้ำกันถูกชุบลงบนแผ่น CBA ต่อคืนบ่มที่ 37 ° C ในอาณานิคมแต่ละบรรยากาศ 10% CO2 นับ และกำหนดหมายถึงจำนวน CFU·ml− 1 Aliquots (200 μl) ระงับ GBS ถูกเก็บอยู่ที่− 20 ° C จนกว่าจำเป็น แต่ละส่วนลงตัวของเซลล์ GBS ผ่าน freeze-thaw รอบหนึ่งเท่านั้น Aliquots (2.8 ml) ของ PBS ปลอดเชื้อหรือรักษา EDTA ทั้งเลือดมนุษย์ถูก inoculated กับระงับเซลล์ (200 μl) ที่ประกอบด้วย cfu·μl− ใด cfu·μl− 1 (ตัวอย่าง "สูงเข็ม") หรือ 63 6.3 × 104 1 (ตัวอย่าง "เข็มต่ำ") ก่อนสกัดดีเอ็นเอ2.2. ตัวอย่างโปรโตคอลการ lysis ก่อนสองโปรโตคอลสำหรับ lysis ล่วงหน้าตัวอย่างก่อนการสกัดดีเอ็นเอมาเปรียบเทียบ: lysis เอนไซม์โดยใช้ achromopeptidase (ACH, lysyl endopeptidase, EC 3.4.21.50) และจักรกล lysis ใช้ตีลูกปัด ตัวควบคุมถูกสกัด โดย lysis ใด ๆ ก่อนสำหรับ lysis เอนไซม์ ACH (100kU Sigma-Aldrich, Gillingham สหราชอาณาจักร) ถูกละลายใน 5.2 ml ของทริสเรทติ้ง EDTA บัฟเฟอร์ (10 mM – ทริสเรทติ้ง HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) อย่าง aliquots (200 μl) มาผสมกับปริมาณสต็อก ACH เท่ากับ (200 μl, 3.85kU ที่มี ACH) และรับการกกที่อุณหภูมิห้อง (22 ° C) 5 นาที ตัวอย่างเกลือที่ถูกแทง ACH ถูกยกก่อนสกัด โดยความร้อนถึง 95 ° C สำหรับการทดลองเบื้องต้น 5 นาทีพบประสิทธิภาพของ ACH lysis เลือด EDTA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการ lysis ในน้ำเกลือ (ไม่แสดงข้อมูล) เจือจาง (1:4) กับทริสเรทติ้ง – HCl บัฟเฟอร์ (10 มม. pH 8.0) ก่อนรักษา ACH แก้ไขนี้ ดังนั้นตัวอย่างเลือดถูกเจือจางก่อน ACH และกกไข่ ตัวอย่างเลือด แทนเครื่องทำความร้อน (ซึ่งเกิดจากเลือดแข็งตัว), ACH ถูกยกก่อนสกัด โดยเติม lysis บัฟเฟอร์จากชุดสกัดกำลังประเมินสำหรับ lysis กล ตัวอย่างถูกประมวลผลโดยลูกปัดตีโดยใช้เชื้อโรค Lysis หลอด S (Qiagen แมนเชสเตอร์ สหราชอาณาจักร) น้ำเกลือหรือเลือด (400 μl) ได้ถูกแทง GBS เซลล์ถูกผสมกับ lysis บัฟเฟอร์ (100 μl) ที่ประกอบด้วย DX น้ำยาโฟมป้องกัน (0.67% v/v) ในหลอด Lysis แนะนำ lysis บัฟเฟอร์สำหรับแต่ละโพรโทคอดูดกำลังประเมินถูกใช้ (Qiagen บัฟเฟอร์ ATL ฟูจิบัฟเฟอร์ LDB หรือโรช Lysis บัฟเฟอร์) ตีลูกปัดที่ทำใช้แบบมินิ-BeadBeater-1 (inc.ผลิตภัณฑ์ Biospec, Bartlesville สหรัฐอเมริกา) บนความเร็ว 90 s2.3. ดีเอ็นเอแยกโพรโทคอลต่อไปนี้ตัวอย่างก่อน lysis ห้าต่าง ๆ สกัดดีเอ็นเอถูกชุดเปรียบเทียบ (ตาราง 1): ชุดมินิเลือด QIAamp (Qiagen); ชุดมินิ QIAamp UCP เชื้อโรค (Qiagen); QuickGene DNA เลือดชุด S (ฟูจิ); MagNA บริสุทธิ์กรดนิวคลีอิกขนาดเล็กแยกชุดผม (โรชวินิจฉัย Corp. อินเดียนาโพลิส สหรัฐอเมริกา); และ SpeedXtract กรดนิวคลีอิกชุด 200 (Qiagen) แต่ละชุดถูกใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ยกเว้น ชุด SpeedXtract ใช้รอบสองของผูกลงบนเม็ดแม่เหล็ก ออกจากดีเอ็นเอเป้าหมายในการแก้ปัญหาหลังจากการแยกแม่เหล็กสอง โพรโทคอลแก้ไขรวม ACH lysis ก่อนระหว่างแยกแม่เหล็กสอง ก่อนเอาเม็ดแม่เหล็ก บัฟเฟอร์ EN (400 μl) ถูกเพิ่มเข้าถูกแทง EDTA เลือด (200 μl) และได้รับการกก SpeedXtract ระงับ A เม็ดแม่เหล็ก ตามโพรโทคอลของผู้ผลิตสำหรับตัวอย่างของเหลว แยกแม่เหล็ก กำจัดของ supernatant และขั้นตอนการล้างโดยใช้บัฟเฟอร์ EN ลูกปัดระงับ A ถูก resuspended ใน ACH (100 μl) และที่อุณหภูมิห้อง 5 นาทีตามความร้อนถึง 95 ° C 5 นาทีได้รับการกก หลังการรักษา ACH, SL บัฟเฟอร์เพิ่ม (100 μl) และตัวอย่างถูกทำให้ร้อนอีกครั้งถึง 95 ° C 5 นาทีก่อนที่จะจบโพรโทคอลผู้ผลิต ตัวควบคุมถูกสกัด โดย ACH โดย resuspending เม็ดแม่เหล็กแขวน A ในบัฟเฟอร์ SL (200 μl) และเครื่องทำความร้อนถึง 95 ° C 10 นาที ไม่เหมาะสมในการรวมโพรโทคอล SpeedXtract โดยไม่เบี่ยงเบนหลักจากโพรโทคอลผู้ผลิตลูกปัดตี ตีลูกปัดจะ lyse เซลล์แบคทีเรียในเลือดก่อนการแยกแม่เหล็กครั้งแรก (กับการสูญเสียของดีเอ็นเอของแบคทีเรีย) อย่างใดอย่างหนึ่ง หรือจะต้องมีลูกปัดเต้นของอนุภาคแม่เหล็กก่อนการแยกแม่เหล็กสอง (พร้อมได้จักรเสียของอนุภาค)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วิธีการ
2.1 การเตรียมการของกลุ่มตัวอย่าง GBS-ถูกแทง

Streptococcus agalactiae (สายพันธุ์ ATCC 12386) คือการเพาะเลี้ยงค้างคืนบนโคลัมเบียเลือดวุ้น (CBA) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศ CO2 10% และ resuspended ในฟอสเฟตหมันบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS) เพื่อให้ความหนาแน่นแสงของ ~ 1.5 . สิบเท่าเจือจางอนุกรมถูกจัดทำขึ้นด้วยจำนวนหน่วยอดีตอาณานิคมต่อมิลลิลิตร (CFU · ml- 1) การตรวจสอบโดยวิธีการแพร่กระจายแผ่น (Cruickshank) aliquots เพิ่มขึ้นสามเท่า (100 ไมโครลิตร) ของเจือจางอนุกรมซ้ำถูกชุบลงบนแผ่น CBA ต่อไปนี้การบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศ 10% CO2 บุคคลอาณานิคมนับและค่าเฉลี่ย CFU · ml- 1 นับกำหนด aliquots (200 ไมโครลิตร) ของการระงับ GBS ถูกเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียสจนต้อง หารของเซลล์ GBS แต่ละขนานหนึ่งรอบแช่แข็งละลายเท่านั้น aliquots (2.8 มิลลิลิตร) ผ่านการฆ่าเชื้อหรือพีบีเอสได้รับการรักษา EDTA เลือดของมนุษย์ทั้งที่ถูกเชื้อด้วยเซลล์แขวนลอย (200 ไมโครลิตร) ที่มีทั้ง 6.3 × 104 CFU ·μl- 1 ( "เข็มสูง" ตัวอย่าง) หรือ 63 cfu ·μl- 1 ( " ขัดขวางต่ำ "ตัวอย่าง) ก่อนที่จะสกัดดีเอ็นเอ.

2.2 ตัวอย่างโปรโตคอลก่อนสลาย

สองโปรโตคอลตัวอย่างก่อนสลายก่อนที่จะสกัดดีเอ็นเอถูกนำมาเปรียบเทียบ: สลายเอนไซม์ใช้ achromopeptidase (ACH, endopeptidase lysyl, EC 3.4.21.50) และสลายกลโดยใช้ลูกปัดเต้น การควบคุมถูกสกัดโดยไม่ต้องมีก่อนสลาย.

สำหรับสลายเอนไซม์ ACH (100kU; Sigma-Aldrich, จิลลิ่ง, สหราชอาณาจักร) ถูกละลายใน 5.2 มิลลิลิตร Tris-EDTA บัฟเฟอร์ (10 mM Tris-HCl 1 มิ EDTA, ค่า pH 8.0) aliquots ตัวอย่าง (200 ไมโครลิตร) ถูกนำมาผสมกับปริมาณที่เท่ากันของ ACH หุ้น (200 ไมโครลิตรมี 3.85kU ACH) และบ่มที่อุณหภูมิห้อง (22 องศาเซลเซียส) เป็นเวลา 5 นาที สำหรับตัวอย่างน้ำเกลือแหลม ACH ถูกยกเลิกก่อนที่จะมีการสกัดโดยใช้ความร้อนถึง 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที การทดลองเบื้องต้นพบว่าประสิทธิภาพของ ACH สลายใน EDTA เลือดลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการสลายในน้ำเกลือ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เจือจาง (1: 4) กับ Tris-HCl บัฟเฟอร์ (10 มิลลิค่า pH 8.0) ก่อนที่จะมีการรักษา ACH การแก้ไขนี้เพื่อให้ตัวอย่างเลือดเจือจางก่อนนอกเหนือจาก ACH และการบ่ม สำหรับตัวอย่างเลือดแทนการให้ความร้อน (ซึ่งเกิดจากเลือดก้อน) ACH ถูกยกเลิกก่อนที่จะมีการสกัดโดยนอกเหนือจากบัฟเฟอร์สลายจากชุดสกัดถูกประเมิน.

สำหรับสลายกลตัวอย่างที่ถูกประมวลผลโดยลูกปัดเต้นโดยใช้เชื้อโรคสลายท่อ S ( QIAGEN, แมนเชสเตอร์, สหราชอาณาจักร) น้ำเกลือหรือเลือด (400 ไมโครลิตร) ถูกแทงด้วยเซลล์ GBS ถูกผสมกับบัฟเฟอร์สลาย (100 ไมโครลิตร) ที่มีการป้องกันโฟม Reagent DX (0.67% v / v) ในหลอดสลาย บัฟเฟอร์สลายแนะนำสำหรับแต่ละโปรโตคอลสกัดถูกประเมินได้ถูกใช้ (Qiagen บัฟเฟอร์ ATL ฟูจิบัฟเฟอร์ LDB หรือ Roche สลายบัฟเฟอร์) ลูกปัดเต้นที่ได้กระทำโดยใช้ Mini-BeadBeater-1 (ไบโอสเปผลิตภัณฑ์อิงค์, บาร์เทิล, สหรัฐอเมริกา) กับความเร็วเต็มรูปแบบสำหรับ 90 s.

2.3 โปรโตคอลการสกัดดีเอ็นเอ

ตัวอย่างต่อไปนี้ก่อนสลายห้าชุดสกัดดีเอ็นเอที่แตกต่างกันเมื่อเทียบ (ตารางที่ 1): QIAamp เลือดชุดมินิ (Qiagen); ชุด QIAamp UCP เชื้อโรคขนาดเล็ก (Qiagen); ชุดเลือด QuickGene ดีเอ็นเอทั้ง S (ฟูจิ); Magna เพียวกระชับนิวคลีอิกกรดแยก Kit I (Roche Diagnostics คอร์ป, อินเดียแนโพลิสหรัฐ); และ SpeedXtract นิวคลีอิกกรด Kit 200 (Qiagen) แต่ละชุดถูกนำมาใช้ตามคำแนะนำของผู้ผลิตที่มีข้อยกเว้น ชุด SpeedXtract ใช้รอบสองของการผูกบนลูกปัดแม่เหล็กออกจากดีเอ็นเอเป้าหมายในการแก้ปัญหาหลังจากที่แยกแม่เหล็กสอง โปรโตคอลที่ได้รับการแก้ไขให้มี ACH ก่อนสลายระหว่างทั้งสองแยกแม่เหล็กก่อนที่จะมีการกำจัดของเม็ดแม่เหล็ก บัฟเฟอร์ TH (400 ไมโครลิตร) ถูกบันทึกอยู่ใน EDTA ถูกแทงทั้งเลือด (200 ไมโครลิตร) และบ่มกับ SpeedXtract ล่าง A ลูกปัดแม่เหล็กตามโปรโตคอลของผู้ผลิตสำหรับตัวอย่างของเหลว ต่อไปนี้การแยกแม่เหล็กกำจัดของสารละลายและขั้นตอนการล้างโดยใช้บัฟเฟอร์ EN ที่ลูกปัด Suspension ถูก resuspended ใน ACH (100 ไมโครลิตร) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วยความร้อนถึง 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที หลังจากการรักษา ACH บัฟเฟอร์ SL (100 ไมโครลิตร) ถูกบันทึกและตัวอย่างที่ถูกความร้อนอีกครั้งถึง 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีก่อนที่จะจบโพรโทคอของผู้ผลิต การควบคุมถูกสกัดโดยไม่ต้อง ACH โดย resuspending ระงับลูกปัดแม่เหล็กในบัฟเฟอร์ SL (200 ไมโครลิตร) และความร้อนถึง 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที มันเป็นไปไม่ได้ที่จะรวมลูกปัดเต้นเข้าสู่โปรโตคอล SpeedXtract โดยไม่ต้องเบี่ยงเบนที่สำคัญจากโปรโตคอลของผู้ผลิต ลูกปัดเต้นจะทั้งเซลล์แบคทีเรีย Lyse ในเลือดก่อนที่จะมีการแยกแม่เหล็กแรก (กับการสูญเสียของดีเอ็นเอของแบคทีเรีย) หรือจะต้องมีลูกปัดเต้นของอนุภาคแม่เหล็กก่อนที่จะมีการแยกแม่เหล็กสอง (กับการสลายเครื่องจักรกลที่เป็นไปได้ของอนุภาค)