PCR reaction and DNA digestions. Ce

PCR reaction and DNA digestions. Cells were directly collected
from a fresh yeast colony using a yellow tip and
suspended in 100 pl PCR reaction mix containing 0.5 pM
primer ITS 1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'),
0.5 pM primer ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC
3'), 10 pM deoxynucleotides, 1.5 mM MgCl, and 1 x buffer
(MAD-GEN). The suspension was heated at 95 "C for
15 min in a Progene (Techne) thermocycler. One unit of
DNA Polymerase SuperTherm (MAD-GEN) was then
added to each tube. PCR conditions were as follows : initial
denaturation at 95 "C for 5 min; 35 cycles of denaturing at
94 "C for 1 min, annealing at 55.5 "C for 2 min and extension
at 72 "C for 2 min; and a final extension at 72 "C for 10 min.
PCR products (10 p1 or approximately 0.5-1.0 pg) were
digested without further purification with the restriction
endonucleases CfoI, HaeIII and Hinff (Boehringer
Mannheim), although endonucleases AM, DdeI, ScrFI or
Tag1 were additionally used in some particular cases. The
PCR products and their restriction fragments were separated
on 1-4 YO and 3 YO agarose gels, respectively, with 1 x TAE
buffer. After electrophoresis, gels were stained with ethidium
bromide, visualized under UV light and photographed
(Image Master, Pharmacia). Sizes were estimated by comparison
against a DNA length standard (100 bp ladder,
Gibco-BRL)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ปฏิกิริยา PCR และ digestions ดีเอ็นเอ เซลล์ถูกรวบรวมโดยตรงจากอาณานิคมยีสต์สดที่ใช้แนะนำเป็นสีเหลือง และหยุดชั่วคราวใน 100 pl PCR ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 0 เวลา 17.00 น.รองพื้นเป็น 1 (5' 3' TCCGTAGGTGAACCTGCGG),0.5 น.พื้น ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC3), น. 10 deoxynucleotides, 1.5 มม. MgCl และบัฟเฟอร์ x 1(MAD-GEN) ระบบกันสะเทือนถูกความร้อนที่ 95 "C สำหรับ15 นาทีใน thermocycler Progene (Techne) หนึ่งหน่วยSuperTherm ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (MAD-GEN) ถูกแล้วเพิ่มเข้าไปแต่ละหลอด เงื่อนไข PCR มีดังนี้: ครั้งแรกdenaturation ที่ 95 "C 5 นาที รอบ 35 ของ denaturing ที่94 "C ใน 1 นาที การอบเหนียวที่ 55.5 "C 2 นาทีและส่วนขยายที่ 72 "C 2 นาที และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 "C สำหรับ 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR (10 p1 หรือประมาณ 0.5-1.0 pg) ได้ต้องไม่ มีฟอกเพิ่มเติมมีข้อจำกัดendonucleases CfoI, HaeIII และ Hinff (Boehringerมา), แม้ว่า endonucleases น. DdeI, ScrFI หรือนอกจากนี้ก็ใช้ Tag1 ในบางกรณีเฉพาะ ที่แยกผลิตภัณฑ์ PCR และบางส่วนของข้อจำกัดของพวกเขาYO 1-4 และ 3 ยอ agarose เจ ตามลำดับ 1 x เต้บัฟเฟอร์ หลังจาก electrophoresis เจมีสี ด้วย ethidiumโบรไมด์ visualized ภายใต้แสง UV และถ่ายภาพ(ภาพมาสเตอร์ Pharmacia) ขนาดถูกประเมินโดยการเปรียบเทียบกับดีเอ็นเอยาวมาตรฐาน (100 bp บันไดGibco-BRL)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ปฏิกิริยา PCR และการย่อยดีเอ็นเอ เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมโดยตรง
จากอาณานิคมยีสต์สดโดยใช้ปลายสีเหลืองและ
แขวนลอยใน 100 pl ปฏิกิริยา PCR ที่มีการผสมผสาน 12:05
ไพรอย 1 (5 'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3')
12:05 ไพร ITS4 (5 'TCCTCCGCTTATTGATATGC
3 ') 22:00 deoxynucleotides 1.5 มิลลิ MgCl และ 1 x บัฟเฟอร์
(MAD-GEN) ระงับความร้อนที่ 95 "C เป็นเวลา
15 นาทีใน Progene (Techne) เครื่อง thermocycler หนึ่งหน่วยของ.
ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ SuperTherm (MAD-GEN) จากนั้นก็
เข้ามาอยู่ในแต่ละหลอดเงื่อนไข PCR มีดังนี้. เริ่มต้น
denaturation ที่ 95 "C เป็นเวลา 5 นาที; 35 รอบของ denaturing ที่
94 "C เป็นเวลา 1 นาที, หลอมที่ 55.5" C เป็นเวลา 2 นาทีและการขยาย
ที่ 72 "C เป็นเวลา 2 นาทีและนามสกุลสุดท้ายที่ 72" C เป็นเวลา 10 นาที.
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ (10 p1 หรือประมาณ 0.5 -1.0 PG) ถูก
ย่อยสลายโดยไม่บริสุทธิ์ต่อไปด้วยข้อ จำกัด
endonucleases CfoI, HaeIII และ Hinff (Boehringer
Mannheim) แม้ว่า endonucleases AM, DdeI, ScrFI หรือ
tag1 นอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้ในบางกรณีโดยเฉพาะอย่างยิ่ง
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์และชิ้นส่วนข้อ จำกัด ของพวกเขาถูกแยกออก
ใน 1-4 YO และ 3 เจล agarose YO ตามลำดับ 1 x TAE
บัฟเฟอร์ หลังจาก electrophoresis เจลถูกย้อมด้วย ethidium
bromide, มองเห็นภายใต้แสงยูวีและถ่ายภาพ
(Master ภาพ Pharmacia) ขนาดกำลังประเมินโดยเปรียบเทียบ
กับระยะเวลาในดีเอ็นเอมาตรฐาน (100 bp บันได,
Gibco-BRL)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ปฏิกิริยา PCR และดีเอ็นเอ digestions . เซลล์โดยตรงเก็บ
จากอาณานิคมยีสต์สดใช้ปลายสีเหลือง
แขวนลอยใน 100 PL PCR ปฏิกิริยาผสมที่มี 0.5 PM
primer ของ 1 ( tccgtaggtgaacctgcgg 5 ' 3 ' )
0 น. รองพื้น its4 ( 5 ' tcctccgcttattgatatgc
3 ' ) , 10 deoxynucleotides ทุ่ม 1.5 มม. คลอไรด์และ 1 x บัฟเฟอร์
( mad-gen ) ถูกระงับความร้อน 95 C
"15 นาทีในโปรจีน ( techne ) เทอร์มอไซเคล ์ . หน่วยหนึ่งของ
supertherm ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ( mad-gen ) จากนั้น
เพิ่มเข้าไปในแต่ละหลอด โดยเงื่อนไขดังนี้ เริ่มต้นที่ 95 (
" C เป็นเวลา 5 นาที ; 35 รอบี่ที่
94 " เป็นเวลา 1 นาที การอบอ่อนที่ 55.5 " C 2 นาทีที่ 72 )
" C เป็นเวลา 2 นาที และงานสุดท้ายที่ 72 " C 10 นาที
PCR ( ผลิตภัณฑ์ 10 P1 หรือประมาณ 0.5-1 .0 PG )
ย่อยต่อไปโดยไม่มีข้อ จำกัด ผลิตและ cfoi haeiii
สงบเงียบ , hinff ( Boehringer Mannheim
) แม้ว่าสงบเงียบเป็น ddei scrfi
tag1 ถูกจับกุม , หรือใช้ในเฉพาะบางคดี
เทคนิคผลิตภัณฑ์และชิ้นส่วนจำกัดของพวกเขาแยกกัน
ใน 1-4 โย่ 3 เจล ( โย่ตามลำดับ 1 x แท
บัฟเฟอร์ หลังจากอิเล็กเจลถูกย้อมด้วยสีคู่
โบรไมด์ , มองเห็นแสงยูวีและถ่ายภาพ
( ภาพมาสเตอร์ ที่มุ่งมั่น ) ขนาดประมาณโดยเทียบกับความยาวดีเอ็นเอมาตรฐาน (

gibco BRL 100 BP บันได )