2.2. Nested PCRThe total genomic DN

2.2. Nested PCR

The total genomic DNA was subjected to nested PCR using universal primers designed to amplify a specific sequence within the 16S rDNA of phytoplasmas (Gundersen and Lee, 1996). Primers P6 (5′ CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3′) (Deng and Hiruki, 1991) and SN910601 (5′ CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3′) (Namba et al., 1993) were used for the first round amplification of the 16S rDNAs. For the second round, to amplify an internal fragment of the 16S rDNA, primers R16F2n (5′ GAAACGACTGCTAAGACTGG 3′) corresponding to bases 144–163 and R16R2 (5′ TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3′) corresponding to bases 1365–1386 (Lee et al., 1993) were used. The PCR reaction (100 μl) contained 200 ng each of the primers, 2.5 units Taq Polymerase 1× PCR buffer, 1.25 mM MgCl2 and 10 μM each of the dNTPs. PCR mix (27 μl) containing the above components was added to the tubes containing the template DNA (73 μl) resulting in a final reaction volume of 100 μl. Amplification was performed in an automated thermal cycler (Eppendorf Master Cycler Gradient) programmed for one cycle of 94 °C for 3 min followed by 35 cycle reaction profile involving 30 s of denaturation at 94 °C, 60 s of annealing at 53 °C and 90 s of extension at 72 °C and single cycle of final extension at 72 °C for 10 min for the first round amplification. The reaction product (1 μl) of first round amplification was used as template for the second round of amplification with similar reaction profile except for the annealing step, which was carried out at 56 °C (instead of 53 °C).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2 การซ้อน PCRDNA genomic รวมถูกยัดเยียดให้ซ้อน PCR โดยใช้ไพรเมอร์สากลมาขยายลำดับเฉพาะภายใน rDNA 16S ของ phytoplasmas (Gundersen และลี 1996) P6 ไพรเมอร์ (5′ CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3′) (เต็งและ Hiruki, 1991) และ SN910601 (5′ CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3′) ใช้สำหรับขยายรอบแรกของ 16S rDNAs (นัมบะ et al., 1993) รอบสอง ขยายเป็นส่วนภายในของ 16S rDNA ไพรเมอร์ R16F2n (5′ GAAACGACTGCTAAGACTGG 3′) ที่สอดคล้องกับฐาน 144 – 163 และ R16R2 (5′ TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3′) ที่สอดคล้องกับฐาน 1365 – เมืองไฮเดลแบรก (Lee et al., 1993) ได้ใช้ (100 μl) ปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 200 ng แต่ละของไพรเมอร์ 2.5 หน่วย× Taq พอลิเมอเรส 1 PCR บัฟเฟอร์ 1.25 mM MgCl2 และ 10 μM ละของ dNTPs ผสม PCR (27 μl) ประกอบด้วยส่วนประกอบข้างต้นได้เพิ่มหลอดที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอแม่แบบ (73 μl) ในปริมาณปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 μl ทำการขยายในการอัตโนมัติร้อน cycler (ไล่ระดับหลัก Eppendorf Cycler) โปรแกรมสำหรับวงจรหนึ่งของ 94 ° C สำหรับ 3 นาทีตาม ด้วยโพรไฟล์ปฏิกิริยารอบ 35 รวม 30 s denaturation ที่ 94 ° C, 60 ของการอบเหนียวที่ 53 ° C และ 90 ของส่วนขยายที่ 72 ° C และรอบเดียวของส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 10 นาทีสำหรับขยายรอบแรก ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา (1 μl) ของขยายรอบแรกถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบสองของขยายกับส่วนกำหนดค่าปฏิกิริยาคล้ายกันยกเว้นการหลอมขั้นตอน ซึ่งที่ 56 ° C (แทน 53 ° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 PCR ซ้อนดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่ถูกยัดเยียดให้PCR ที่ซ้อนกันโดยใช้ไพรเมอร์สากลที่ออกแบบมาเพื่อขยายลำดับที่เฉพาะเจาะจงภายใน 16S rDNA ของไฟโตพลาสมา (Gundersen และลี, 1996) ไพรเมอร์ P6 (5 'CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3') (เติ้งและ Hiruki, 1991) และ SN910601 (5 'CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3') (Namba et al., 1993) ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายรอบแรกของ 16S rDNAs สำหรับรอบที่สองเพื่อขยายชิ้นส่วนภายในของ 16S rDNA ไพรเมอร์ R16F2n (5 'GAAACGACTGCTAAGACTGG 3') ที่สอดคล้องกับฐาน 144-163 และ R16R2 (5 'TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3') ที่สอดคล้องกับฐาน 1365-1386 (Lee et al, , 1993) ถูกนำมาใช้ ปฏิกิริยา PCR (100 ไมโครลิตร) ที่มี 200 ng แต่ละไพรเมอร์ 2.5 หน่วย Taq โพลิเมอร์ 1 ×บัฟเฟอร์ PCR 1.25 มิลลิ MgCl2 และ 10 ไมครอนแต่ละ dNTPs ผสม PCR (27 ไมโครลิตร) ที่มีส่วนประกอบดังกล่าวข้างต้นถูกบันทึกอยู่ในท่อที่มีแม่แบบดีเอ็นเอ (73 ไมโครลิตร) ส่งผลให้ปริมาณการเกิดปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 ไมโครลิตร ขยายได้ดำเนินการใน Cycler ความร้อนอัตโนมัติ (Eppendorf โท Cycler ไล่โทนสี) โปรแกรมสำหรับหนึ่งรอบ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบรายละเอียดปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับวันที่ 30 ของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ° C 60 ของการอบที่ 53 องศาเซลเซียสและ 90 ของส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสและรอบเดียวของการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีสำหรับการขยายรอบแรก ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา (1 ไมโครลิตร) ของการขยายรอบแรกถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบที่สองของการขยายปฏิกิริยากับโปรไฟล์ที่คล้ายกันยกเว้นสำหรับขั้นตอนการอบซึ่งได้ดำเนินการที่ 56 ° C (แทน 53 ° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . ที่ซ้อนกัน )

ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดอยู่ภายใต้วิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาเพื่อกันถ้วนหน้า โดยเฉพาะภายในลำดับ 16S rDNA ของ phytoplasmas ( กันเดอร์เซน และ ลี , 1996 ) ไพรเมอร์ ( 5 ’’ cggtagggatcacttgttacgactta P6 3 ) ( เติ้งและ hiruki , 1991 ) และ sn910601 ( 5 ’’ cgaaaaaaccttaccaggtctttg 3 ) ( นัมบะ et al . , 1993 ) ถูกใช้เพื่อเพิ่มจำนวนรอบแรกของ 16S rdnas .สำหรับรอบสอง จะขยายเป็นส่วนภายในของ 16S rDNA , ไพรเมอร์ r16f2n ( 5 ’’ gaaacgactgctaagactgg 3 ) สอดคล้องกับฐาน 144 –แล้ว r16r2 ( 5 ’’ tgacgggcggtgtgtacaaaccccg 3 ) สอดคล้องกับฐาน 1365 – 1386 ( ลี et al . , 1993 ) สถิติที่ใช้ การตรวจปฏิกิริยา ( 100 μ L ) ที่มีอยู่ 200 นาโนแต่ละของไพรเมอร์ 2.5 หน่วยได้ดีวิธี PCR buffer 1 × 1ชุด 25 มม. และ 10 μ M ของแต่ละ dntps . เชื้อผสม ( 27 μ L ) ที่มีส่วนประกอบข้างต้นถูกเพิ่มลงในหลอดที่มีแม่แบบดีเอ็นเอ ( 73 μ L ) ส่งผลให้ปริมาณปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 μ Lในการปฏิบัติแบบอัตโนมัติ ( Thermal cycler เพนดอร์ฟต้นแบบวงจรไล่ระดับ ) โปรแกรมสำหรับหนึ่งรอบ 94 ° C เป็นเวลา 3 นาที ตามด้วย 35 รอบโปรไฟล์ของปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับ 30 ( ที่ 94 ° C 60 วินาที annealing ที่ 53 ° C และ 90 ของส่วนขยายที่ 72 ° C และเดี่ยวรอบสุดท้ายของนามสกุล 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที ( สำหรับรอบแรกผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา ( 1 μ L ) ( รอบแรกที่ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบที่สอง ( กับโปรไฟล์ปฏิกิริยาคล้ายคลึงกันยกเว้นขั้นตอน annealing ซึ่งดำเนินการที่ 56 ° C ( แทนที่จะ 53 ° C )