was expressed and purified in a man

was expressed and purified in a manner similar to the preparation of CYP2C9, as described previously (Locuson et al., 2006). In brief, Escherichia coli transformed with the CYP3A4 construct in a pCW vector, with ampicillin resistance and a 6× histidine tag, was streaked on a Luria broth agar plate. Single colonies were added to 10 ml of Luria broth with ampicillin and grown overnight at 37°C and at 225 rpm. These primary cultures were used to incubate 0.5-liter terrific broth cultures containing trace elements, ampicillin, and thiamine. On reaching an optical density of 0.4 to 0.6, usually in approximately 4 h, the 0.5-liter cultures were induced with isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, vitamins, and alanine supplements. The induced cultures were then maintained at a lower temperature and speed of 25°C and 175 rpm, respectively. The cultures were harvested 16 h postinduction, and the pellets were stored at −80°C until purification. For purification of CYP3A4, the pellets were solubilized at 4°C in bacterial protein extraction reagent, sodium chloride, detergent (sodium cholate and Tergitol), EDTA, imidazole, protease inhibitors, lysozyme, DNAase and β-mercaptoethanol, and the protein then was extracted using a French press. After ultracentrifugation at 100,000g, the protein from the supernatant was purified using a nickel column. Hydroxyapatite resin was then used to eliminate all the detergent, and the resulting protein was dialyzed overnight twice to further purify the protein. Finally, the enzyme was concentrated using a Centricon (Millipore Corporation, Billerica, MA) centrifuge concentrator with a molecular mass cutoff of 12 kDa. Purity was assessed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and a single band at 57 kDa was detected.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แสดง และบริสุทธิ์ในลักษณะคล้ายกับการเตรียมของ CYP2C9 อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Locuson และ al., 2006) สังเขป Escherichia coli CYP3A4 ที่แตกต่างสร้างในเวกเตอร์ pCW กับแอมพิซิลลิน ต้านทานและ 6 × histidine แท็ก มีลายบนจาน Luria ซุป agar อาณานิคมเดียวได้เพิ่ม 10 ml ของ Luria ซุปกับแอมพิซิลลิน และโตค้างคืน ที่ 37° C และ ที่ 225 รอบต่อนาที วัฒนธรรมหลักเหล่านี้ได้ใช้ฟัก 0.5 ลิตรซุปมากมายวัฒนธรรมที่ประกอบด้วยการสืบค้นกลับ และองค์ประกอบ แอมพิซิลลิน ไทอามีน ในการเข้าถึงมีความหนาแน่นออปติคัลของ 0.4 ถึง 0.6 มักจะอยู่ในประมาณ 4 h, 0วัฒนธรรม 5 ลิตรนำ ด้วย isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside วิตามิน และอะลานีนผลิตภัณฑ์เสริมอาหาร วัฒนธรรมอาจได้แล้วเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำและความเร็ว 175 รอบต่อนาที และ 25° C ตามลำดับ วัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยว 16 h postinduction และเกล็ดถูกเก็บไว้ที่ −80 ° C จนถึงฟอก การทำให้บริสุทธิ์ของ CYP3A4 เกล็ดถูก solubilized ที่ 4° C ในรีเอเจนต์การสกัดโปรตีนจากแบคทีเรีย โซเดียมคลอไรด์ ผงซักฟอก (cholate โซเดียมและ Tergitol), EDTA อิมิดาโซล รติเอส inhibitors, lysozyme, DNAase และβ-mercaptoethanol และโปรตีนแล้วถูกสกัดโดยใช้กดฝรั่งเศส หลัง ultracentrifugation 100, 1000 กรัม โปรตีนจาก supernatant ไม่บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์นิกเกิล แล้วใช้ยาง hydroxyapatite เพื่อกำจัดผงซักฟอกทั้งหมด และโปรตีนได้ถูก dialyzed ค้างคืนสองครั้งเพื่อเพิ่มเติม บริสุทธิ์โปรตีน สุดท้าย เอนไซม์เข้มข้นด้วยการ Centricon (บริษัทมาก Billerica, MA) เครื่องหมุนเหวี่ยงอาทิตย์หัวตัดเป็นมวลโมเลกุลของ 12 kDa ความบริสุทธิ์ถูกประเมิน โดย SDS polyacrylamide เจ electrophoresis และวงเดียวที่ 57 kDa พบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ได้แสดงออกและบริสุทธิ์ในลักษณะที่คล้ายคลึงกับการเตรียมความพร้อมของ CYP2C9 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Locuson และคณะ. 2006) ในช่วงสั้น ๆ Escherichia coli เปลี่ยนด้วย CYP3A4 สร้างในเวกเตอร์ PCW มีความต้านทาน ampicillin และ 6 ×แท็กฮิสทิดีเป็นลายบนแผ่นวุ้น Luria น้ำซุป โคโลนีเดี่ยวที่เพิ่มขึ้นถึง 10 มล. ของน้ำซุปที่มี ampicillin Luria และเติบโตขึ้นในชั่วข้ามคืนที่ 37 ° C และ 225 รอบต่อนาที เหล่านี้วัฒนธรรมหลักถูกนำมาใช้ในการฟักไข่ 0.5 ลิตรน้ำซุปวัฒนธรรมที่ยอดเยี่ยมที่มีธาตุ, ampicillin และวิตามินบี ในการเข้าถึงความหนาแน่นของแสงของ 0.4-0.6 มักจะอยู่ในประมาณ 4 ชั่วโมงวัฒนธรรม 0.5 ลิตรที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยไอโซโพรพิβ-D-1-thiogalactopyranoside, วิตามินและผลิตภัณฑ์เสริมอาหารอะลานีน วัฒนธรรมที่เกิดแล้วถูกเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำและความเร็วของ 25 ° C และ 175 รอบต่อนาทีตามลำดับ วัฒนธรรมที่ถูกเก็บเกี่ยว 16 ชั่วโมง postinduction และเม็ดถูกเก็บไว้ที่ -80 ° C จนทำให้บริสุทธิ์ สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ CYP3A4, เม็ดถูกละลายที่ 4 ° C ในการสกัดโปรตีนของเชื้อแบคทีเรียสารโซเดียมคลอไรด์, ผงซักฟอก (โซเดียม cholate และ Tergitol) EDTA, imidazole ยับยั้งโปรติเอส, ไลโซไซม์, DNAase และβ-Mercaptoethanol และโปรตีนจากนั้นเป็น สกัดโดยใช้การกดฝรั่งเศส หลังจาก ultracentrifugation 100,000 กรัมโปรตีนจากใสบริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์นิกเกิล ไฮดรอกซีเรซินที่ถูกนำมาใช้เพื่อกำจัดผงซักฟอกและโปรตีนที่เกิดขึ้นในชั่วข้ามคืนเป็น dialyzed สองครั้งเพื่อชำระล้างโปรตีน ในที่สุดการทำงานของเอนไซม์ที่ใช้ความเข้มข้น Centricon (คคอร์ปอเรชั่นบริดจ์) หัวเหวี่ยงกับการตัดมวลโมเลกุล 12 กิโลดาลตัน ความบริสุทธิ์ได้รับการประเมินจาก SDS-polyacrylamide เจลอิเล็กและวงเดียวใน 57 กิโลดาลตันได้รับการตรวจพบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และบริสุทธิ์ถูกแสดงออกในลักษณะที่คล้ายกับการเตรียม cyp2c9 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( locuson et al . , 2006 ) ในช่วงสั้น ๆ , Escherichia coli เปลี่ยนด้วย ( สร้างใน pcw เวกเตอร์ , แอมพิความต้านทานและ 6 ×ีนแท็ก เป็นลายบนลุเรียน้ำวุ้นแผ่นโคโลนีเดี่ยวเพิ่ม 10 มล. ของน้ำซุปที่มี ampicillin ลุเรียและเติบโตค้างคืนที่ 37 ° C และที่ 225 รอบต่อนาที วัฒนธรรมหลักเหล่านี้ถูกใช้เพื่อบ่มเพาะ 0.5-liter ยอดเยี่ยมซุปวัฒนธรรมที่มีองค์ประกอบ , แอมพิซิลิน , ติดตาม และการประเมินผลทางการศึกษา . เกี่ยวกับการเข้าถึงการซิกแซ็ก 0.4 0.6 ปกติประมาณ 4 H , 0วัฒนธรรม 5-liter ถูกชักนำด้วยไอโซโพรพิลบีตา - d-1-thiogalactopyranoside วิตามิน และอาหารเสริม นกนางนวล . เกิดวัฒนธรรม แล้วเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำกว่า 25 องศา C และความเร็ว 175 รอบต่อนาที ตามลำดับ วัฒนธรรมเก็บ 16 H postinduction และเม็ดที่อุณหภูมิ 80 องศา C −จนบริสุทธิ์ สำหรับการสร้างของ ,เม็ดที่ 4 ° C ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่ใช้ในการสกัดโปรตีน โซเดียมคลอไรด์ ผงซักฟอก ( มิติและ EDTA , โซเดียม tergitol ) อิมิดาโซล protease inhibitors , ไลโซไซม์และ dnaase , บีตา - mercaptoethanol และโปรตีน แล้วถูกสกัดโดยใช้กดฝรั่งเศส หลังจาก ultracentrifugation ที่ 100000g , โปรตีนจากน่านบริสุทธิ์โดยใช้นิกเกิล คอลัมน์ไฮดรอกซีเรซินก็ใช้เพื่อขจัดผงซักฟอก และผลของโปรตีนที่ผ่านข้ามคืนสองครั้งเพื่อเพิ่มเติมบริสุทธิ์ของโปรตีน ในที่สุด , เอนไซม์เข้มข้นใช้ centricon ( มิลลิ Corporation , โตเกียว , MA ) ซึ่งมีมวลโมเลกุลของหัวตัด 12 กิโลดาลตัน ความบริสุทธิ์และ SDS polyacrylamide gel electrophoresis โดย ,และเป็นวงเดียวที่ 57 กิโลดาลตันถูกตรวจพบ