2. Materials and Methods2.1. Partic

2. Materials and Methods
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected from anonymous participants at commercial male homosexual venues of Taipei and NewTaipei City on weekends. The questionnaires included measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pretest counseling, were informed about the purpose of this study and gave written informed consent.
HIV diagnosis was made using a recombinant HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
blood samples were tested for HIV-1 subtype. Based on the regular blood sampling every 3 months, 89 participants were infected with HIV-1. Of the subjects who were identified to be seroconverted within
prior 6 months, 20 of them were recruited to join this MRJ-L evaluation study. Another 30 uninfected subjects were randomly recruited as controls.This study was conducted with the approval of the institutional review
board of the Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan.


2.2. Cell Lines and Cell Preparations
After obtaining informed consent, CD4+T lymphocytes and CD14+ monocytes were isolated from PBMCs from healthy donors and HIV infected patients by Ficoll-Paque gradient (GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh, PA, USA) using CD4+/CD14+ magnetic microbeads(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Laboratory personnel were blind to the identity and HIV-1 infection status of blood donors.To induce macrophage differentiation, monocytes isolated from donors
were maintained in RPMI1640 supplemented with 10% human AB serum, 5% fetal bovine serum (FBS), and 50 ng/mL M-CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ, USA) for seven days. Jurkat cells were cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS. In addition, phytohaemagglutinin(PHA) was added to stimulate Jurkat cells. THP-1 (a monocyte cell line) and U937 cells were cultured in RPMI1640 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% FBS and 2 mM DMSO. 293 T cells were cultured in DMEM (Life Technologies) supplemented with 10% FBS. To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.


2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.The HA-MRJ-L and HA-MRJ-S plasmids were constructed in the pcDNA vector. The lentiviral expression vector of MRJ-L was constructed in the pLKO_AS3w.puro vector. The MRJ-L 3′UTR shRNA (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) was designed using InvivoGen siRNA Wizard v3.1 software, and was constructed in the pLKO.1-puro vector (obtained from the National RNAi Core Facility, Academia Sinica, Taiwan). All construct identities were confirmed by sequencing the entire insert.


2.4. HIV-1 Virus Production and Viral Infection
293 T cells (2 × 106) were transfected with 2 μg of p125 (M-tropic,ADA strain) plasmids using Lipofectamine 2000, and the supernatants were harvested at 48 h post-transfection. Viruses were pretreated with 2 U/mL DNase I (Life Technologies) at 37 °C for 30 min before infection,and the viral titer was quantified using the p24 ELISA assay(PerkinElmer, Waltham, MA,USA). Cells with over-expressed or reduced levels of MRJ-L were titrated to adjust for equal cell numbers, and 1 × 106 cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of p24 antigen) at 37 °C for 2 h. After washing three times with PBS, cells were maintained in RPMI1640/2% FBS and half of the medium was replaced every three days. Culture supernatants were collected every three days for quantification of p24 antigen by HIV-1 p24 ELISA(PerkinElmer).


2.5. Statistical Analysis
The significance level was set at 0.05, and all p values were twotailed.Risk factors for HIV-1 infection were analyzed using simple logistic regression, followed by Bayesian multiple logistic regression because of sparse data. The simple logistic regression was performed using the software Stata (version 13, StataCorp, College Station, Texas) or
WinBUGS (version 1.4.3; MRC Biostatistics Unit, Cambridge, England) when there were sparse data. Bayesian multiple regression analysis was undertaken using the software package WinBUGS.


2.6. Ethical Research Conduct
This study conformed to the provisions of the 1975 Helsinki Declaration and was approved by the institutional review board of the National Taiwan University Hospital (NTUH-201102003RC) and Mackay Memorial Hospital (13MMHIS039).
All patients gave written consents before they participated in this study.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. ผู้เข้าร่วมสรรหาและการคัดกรอง Serologic สำหรับเชื้อเอชไอวี แบบสอบถามที่เสร็จสมบูรณ์ด้วยตนเองและตัวอย่างเลือดได้รวบรวมจากผู้เข้าร่วมแบบที่ค้าชายเกย์แห่งไทเปและเมือง NewTaipei เสาร์ แบบสอบถามรวมวัดข้อมูลประชากร เอชไอวีประวัติและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ (เสริมตาราง 1) จำนวนผู้เข้าร่วมศึกษา 1200 รับpretest ให้คำปรึกษา ได้ทราบเกี่ยวกับวัตถุประสงค์ของการศึกษานี้ และให้เขียนแจ้งความยินยอม ทำการวินิจฉัยเชื้อเอชไอวีใช้ immunoassay การเอนไซม์เอชไอวีเป็น recombinant (มูเร็กซ์ จำกัดวินิจฉัย ดราฟท์ฟอร์ด UK) ผลการทดสอบเป็นบวกถูกยืนยันจากเอชไอวีเวสเทิร์นคืนในตา 2.2 (Genelab เทคโนโลยี อิงค์ สิงคโปร์) นอกจากนี้ บวกเลือดตัวอย่างที่ทดสอบสำหรับชนิดย่อยของเชื้อเอชไอวี-1 ร่วม 89 ตามเลือดสม่ำเสมอทุก 3 เดือนในการสุ่มตัวอย่าง ได้ติดเชื้อเอชไอวี 1 เรื่องที่ระบุจะเป็น seroconverted ภายในก่อน 6 เดือน 20 ของพวกเขาถูกคัดเข้าศึกษาประเมิน MRJ L อีกเรื่องเชื้อ 30 ถูกสุ่มคัดเป็นตัวควบคุมการศึกษานี้ได้ดำเนินการ โดยการอนุมัติของสถาบันการตรวจทานคณะแมคเคย์เมโมเรียล ไทเป ไต้หวัน 2.2. บรรทัดเซลล์ และเซลล์เตรียม หลังจากได้รับแจ้งความยินยอม CD4 + T lymphocytes และ CD14 + monocytes ถูกแยกต่างหากจาก PBMCs จากผู้บริจาคมีสุขภาพดีและผู้ป่วยติดเชื้อเอชไอวี โดย Ficoll Paque การไล่ระดับสี (วิทยาศาสตร์สุขภาพสุขอนามัย GE พิตส์เบิร์ก PA สหรัฐอเมริกา) ใช้ CD4 + /mts CD14 + แม่เหล็ก microbeads (ไบโอเทค Miltenyi, Bergisch Gladbach เยอรมนี) บุคลากรห้องปฏิบัติการซ่อนตัวตนและสถานะการติดเชื้อเอชไอวี-1 ของผู้บริจาคเลือดได้เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่าง macrophage, monocytes แยกต่างหากจากผู้บริจาคถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640 เสริม ด้วยเซรั่ม AB มนุษย์ 10%, 5% และทารกในครรภ์วัวซีรั่ม (FBS), และ 50 ng/mL M CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ, USA) 7 วัน Jurkat เซลล์มีอ่างใน RPMI1640 เสริม ด้วย 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin(PHA) ถูกเพิ่มเพื่อกระตุ้นเซลล์ Jurkat THP-1 (โมโนไซต์เซลล์บรรทัด) และเซลล์ U937 ได้อ่างใน RPMI1640 (เทคโนโลยีชีวิต เกาะแกรนด์ NY, USA) เสริม ด้วย 10% FBS และ DMSO 2 มม. 293 T เซลล์มีอ่างใน DMEM (ชีวิตเทคโนโลยี) เสริม ด้วย 10% FBS เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่างของเซลล์ U937 ลงในเซลล์ macrophage เหมือน เพิ่ม myristate 200 μM phorbol acetate (PMA) mitogen ปานกลางวัฒนธรรม และเซลล์เก็บเกี่ยวผลผลิตหลังจาก 48 h2.3 plasmids PEGFP – Vpr plasmid ถูกสร้างขึ้น โดยการใส่ยีน Vpr ขยายเป็นเวกเตอร์ที่เหมาะสมจากโคลน pNL4 3 เอชไอวี-1ฮา MRJ L และ S ฮา MRJ plasmids ถูกสร้างในเวกเตอร์ pcDNA เวกเตอร์นิพจน์ lentiviral ของ MRJ L ถูกสร้างในเวกเตอร์ pLKO_AS3w.puro ShRNA 3′UTR MRJ L (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) ถูกออกแบบโดยใช้ตัวช่วยสร้าง InvivoGen siRNA v3.1 ซอฟต์แวร์ และถูกสร้างในเวกเตอร์ใช้ pLKO.1 (ได้รับจากการชาติ RNAi หลักสิ่งอำนวยความสะดวก Academia Sinica ไต้หวัน) รหัสประจำตัวโครงสร้างทั้งหมดถูกยืนยัน โดยลำดับเบสแทรกทั้งหมด2.4 การผลิตไวรัสเอชไอวี-1 และติดเชื้อไวรัส 293 T เซลล์ (2 × 106) มี transfected กับ μg 2 ของ p125 (M-ทรอปิก ต้องใช้ ADA) plasmids ใช้ Lipofectamine 2000 และ supernatants ได้เก็บเกี่ยวที่ transfection หลัง 48 h ไวรัสถูก pretreated กับ DNase U/mL 2 ฉัน (ชีวิตเทคโนโลยี) ที่ 37 ° C สำหรับ 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ และ titer ไวรัสถูก quantified ใช้ p24 การทดสอบ ELISA (PerkinElmer, Waltham, MA สหรัฐอเมริกา) เซลล์แสดงมากเกินไป หรือลดระดับของ MRJ L ที่ titrated ปรับเลขเซลล์เท่า และ 1 × 106 เซลล์ติดเชื้อต้องใช้ M-ทรอปิกของเอชไอวี-1 (เทียบเท่ากับ 25 ng ตรวจหา p24) ที่ 37 ° C สำหรับ 2 h หลังจากซักสามครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640/2% FBS และครึ่งหนึ่งของสื่อถูกแทนทุกสามวัน Supernatants วัฒนธรรมได้รวบรวมทุกวันนับของการตรวจหา p24 สาม โดย ELISA(PerkinElmer) p24 เอชไอวี-12.5. สถิติวิเคราะห์ มีการตั้งค่าระดับนัยสำคัญที่ 0.05 และค่า p ทั้งหมดมี twotailedปัจจัยเสี่ยงต่อการติดเชื้อเอชไอวี-1 ได้วิเคราะห์โดยใช้การถดถอยโลจิสติกอย่าง ตามทฤษฎีหลายถดถอยโลจิสติก เพราะข้อมูลบ่อ ถดถอยโลจิสติกอย่างถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Stata (รุ่น 13, StataCorp วิทยาลัยสถานี เท็กซัส) หรือWinBUGS (ฉบับปรุง 1.4.3 หน่วยชีวสถิติ MRC เคมบริดจ์ อังกฤษ) เมื่อมีข้อมูลบ่อ ทฤษฎีการวิเคราะห์การถดถอยหลายดำเนินใช้ชุดซอฟต์แวร์ WinBUGS2.6. จริยธรรมวิจัยปฏิบัติ การศึกษานี้ตามบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975 และได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการตรวจสอบสถาบันแห่งชาติไต้หวัน (NTUH-201102003RC) โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยและโรงพยาบาลแมคเคย์ (13MMHIS039) ผู้ป่วยทั้งหมดให้ consents เขียนก่อนที่จะเข้าร่วมในการศึกษานี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2. Materials and Methods
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected from anonymous participants at commercial male homosexual venues of Taipei and NewTaipei City on weekends. The questionnaires included measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pretest counseling, were informed about the purpose of this study and gave written informed consent.
HIV diagnosis was made using a recombinant HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
blood samples were tested for HIV-1 subtype. Based on the regular blood sampling every 3 months, 89 participants were infected with HIV-1. Of the subjects who were identified to be seroconverted within
prior 6 months, 20 of them were recruited to join this MRJ-L evaluation study. Another 30 uninfected subjects were randomly recruited as controls.การศึกษานี้ดำเนินการด้วยความเห็นชอบของคณะกรรมการสถาบันทบทวน
ของ Mackay โรงพยาบาลเมโมเรียล , ไทเป , ไต้หวัน .


. . เซลล์มะเร็งและเซลล์การเตรียม
หลังจากที่ได้รับความยินยอม , CD4 T เม็ดเลือดขาว cd14 โมโนไซทและที่แยกได้จากเลือดและนำไปตรวจสุขภาพผู้ติดเชื้อเอชไอวี โดยการ ficoll ปั๊ก ( GE Healthcare ชีวิตวิทยาศาสตร์ , Pittsburgh , PA ,