Article outlineShow full outlineHig

Article outlineShow full outline
Highlights
Abstract
Keywords
Introduction
Materials and methods
Results
Discussion
Conclusions
Conflict of interest
References
Figures and tables

Table 1

Table 2



ADVERTISEMENT

Protein Expression and Purification
Volume 104, December 2014, Pages 14–19

Cover image
Expression and purification of soluble human cystatin C in Escherichia coli with maltose-binding protein as a soluble partner
Qing Zhanga, 1, Xiaozhi Zhaoa, 1, Xiaoyu Xuc, Bo Tangc, Zhenglei Zhaa, Mingxin Zhanga, Dongwei Yaoa, Xiaoxiang Chena, Xuhong Wua, Lin Caob, c, , , Hongqian Guoa, ,
Show more
Choose an option to locate/access this article:
Check if you have access through your login credentials or your institution
Check access
Purchase $41.95


doi:10.1016/j.pep.2014.09.010
Get rights and content
Highlights
•
Expressing recombinant CYSC is difficult in E. coli because of resulting low yield and insufficient purity and insolubility.
•
We found that MBP was best at enhancing the soluble expression of CYSC in E. coli.
•
We purified the de-tagged CYSC with immobilized metal affinity chromatography and cation-affinity purification.
•
The de-tagged CYSC could react specifically with CYSC polyclonal antibody and displayed full biological activity.
•
We provide a method to produce large amounts of soluble recombinant human CYSC in E. coli.
Abstract
Human cystatin C (CYSC) is a 13-kDa endogenous cysteine proteinase inhibitor and was investigated as a replacement for creatinine as a marker of renal function. However, expressing recombinant CYSC is difficult in Escherichia coli because of resulting low yield and insufficient purity and insolubility. Here, we cloned and fused CYSC to the C-terminus of three soluble partners – maltose-binding protein (MBP), glutathione S-transferase (GST) and translation initiation factor 2 domain I (IF2) – to screen for their ability to improve the solubility of recombinant CYSC when expressed in E. coli. MBP was best at enhancing the soluble expression of CYSC, with soluble fractions accounting for 92.8 ± 3.11% of all proteins. For scaled production, we purified the de-tagged CYSC by using a 3C protease-cleaved MBP-T3-CYSC fused protein with immobilized metal affinity chromatography and cation-affinity purification. The molecular weights of the de-tagged CYSC and human natural CYSC were similar, and the former could react specifically with CYSC polyclonal antibody. Moreover, the de-tagged CYSC displayed full biological activity against papain and cathepsin B, which was very similar to that of the human natural CYSC protein standard. We provide a method to produce large amounts of soluble recombinant human CYSC in E. coli.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทความเค้าเต็ม outlineShowไฮไลท์บทคัดย่อคำสำคัญแนะนำวัสดุและวิธีการผลลัพธ์สนทนาบทสรุปความขัดแย้งทางผลประโยชน์การอ้างอิงตัวเลขและตารางตารางที่ 1ตารางที่ 2โฆษณา นิพจน์โปรตีนและทำให้บริสุทธิ์เล่ม 104, 2557 ธันวาคม หน้า 14-19 ภาพปกนิพจน์และฟอกละลายมนุษย์ cystatin C ใน Escherichia coli มีโปรตีน maltose ผูกเป็นพันธมิตรละลายชิง Zhanga, 1, Xiaozhi Zhaoa, 1, Xiaoyu Xuc, Bo Tangc, Zhenglei Zhaa, Mingxin Zhanga, Dongwei Yaoa, Chena เชา วัว Xuhong, Lin Caob, c,, Hongqian Guoa,, ดูเพิ่มเติมเลือกตัวเลือกการค้นหา/เข้าถึงบทความนี้:ตรวจสอบถ้าคุณเข้าถึงข้อมูลประจำตัวการเข้าสู่ระบบหรือสถาบันของคุณเข้าตรวจสอบซื้อ $41.95 doi:10.1016/j.pep.2014.09.010ได้รับสิทธิและเนื้อหาไฮไลท์•แสดง recombinant CYSC ได้ยากใน E. coli เนื่องจากได้ผลตอบแทนต่ำ และความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอ และ insolubility•เราพบว่า MBP สุดในการเพิ่มค่าการละลายของ CYSC ใน E. coli•เราบริสุทธิ์ CYSC de-แท็ก มีความเกี่ยวข้องของโลหะเอนไซม์ฟอก chromatography และ cation-ความสัมพันธ์•CYSC ติดแท็กยกเลิกสามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดี polyclonal CYSC โดยเฉพาะ และแสดงกิจกรรมชีวภาพเต็มรูปแบบ•เรามีวิธีการในการผลิตจำนวนมากละลาย CYSC มนุษย์ recombinant ใน E. coliบทคัดย่อมนุษย์ cystatin C (CYSC) เป็นสารยับยั้งที่ 13 kDa endogenous cysteine proteinase และถูกสอบสวนแทน creatinine เป็นเครื่องหมายของฟังก์ชันไต อย่างไรก็ตาม การแสดง recombinant CYSC ได้ยากใน Escherichia coli เนื่องจากได้ผลตอบแทนต่ำ และความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอ และ insolubility ที่นี่ เราโคลน และ fused CYSC กับนัส C ละลายน้ำได้สามคู่-maltose ผูกโปรตีน (MBP), ไธ S-transferase (GST) และโดเมน 2 ปัจจัยเริ่มต้นแปลฉัน (IF2) – การจอสำหรับความสามารถในการเพิ่มการละลายของ CYSC recombinant เมื่อแสดงใน E. coli MBP สุดเพิ่มค่าการละลายของ CYSC กับบัญชี 92.8 ± 3.11% ของโปรตีนทั้งหมดส่วนที่ละลายน้ำได้ สำหรับการผลิตปรับสัดส่วนได้ เราบริสุทธิ์ CYSC ติดแท็กยกเลิก โดยใช้ MBP-T3-CYSC fused โปรตีน 3 C แหวกรติเอสมีความเกี่ยวข้องของโลหะเอนไซม์ฟอก chromatography และ cation-ความสัมพันธ์ น้ำหนักโมเลกุลของ CYSC de-แท็กและ CYSC ธรรมชาติมนุษย์ได้เหมือนกัน และเดิมสามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดี polyclonal CYSC โดยเฉพาะ นอกจากนี้ CYSC de-แท็กแสดงกิจกรรมชีวภาพเต็มรูปแบบกับเอนไซม์ปาเปนและ cathepsin B ซึ่งเป็นคล้ายกับของมนุษย์ธรรมชาติ CYSC โปรตีนมาตรฐาน เรามีวิธีการในการผลิตจำนวนมากละลาย CYSC มนุษย์ recombinant ใน E. coli

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

บทความ outlineshow เต็มร่าง



แนะนำคำหลักเน้นนามธรรม
วัสดุและวิธีการ ผลการอภิปรายสรุป





ความขัดแย้งอ้างอิงตัวเลขและตาราง ตารางที่ 1







โฆษณา ตารางที่ 2


เล่ม 104 โปรตีนการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ , ธันวาคม 2014 หน้า 14 – 19


ภาพปกการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของมนุษย์ cystatin C ละลายในแบคทีเรีย Escherichia coli โปรตีนละลายน้ำกับน้ำตาลเป็นคู่
zhanga ชิง 1 , xiaozhi zhaoa 1 , Xiaoyu xuc โบ tangc zhenglei zhaa mingxin zhanga , , , yaoa dongwei , Chena xuhong xiaoxiang , วัว , หลิน caob , c , , , hongqian guoa , ,
แสดง เพิ่มเติม
เลือกตัวเลือกการค้นหา / การเข้าถึงบทความนี้ :
ตรวจสอบว่าคุณมีการเข้าถึงผ่านเข้าสู่ระบบข้อมูลหรือตรวจสอบการเข้าถึงสถาบัน

ซื้อ $ 41.95


ดอย : 10.1016 / j.pep . 2014.09.010
ได้รับสิทธิและเนื้อหา

-
แสดงแนนท์ไฮไลท์ cysc ยากใน E . coli เพราะส่งผลให้ผลผลิตต่ำและความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอและกรดเมตา .
-
เราพบว่า MBP ที่ดีที่สุดเพื่อส่งเสริมการแสดงออกของ cysc ละลายใน E . coli .
-
เราบริสุทธิ์ เดอ แท็ก cysc ด้วยโครมาโตกราฟีสามารถตรึงโลหะประจุบวก Affinity บริสุทธิ์

de แท็ก cysc สามารถตอบสนองโดยใช้แอนติบอดี และ cysc แสดงฤทธิ์ทางชีวภาพเต็ม
-
เรามีวิธีการผลิตจำนวนมากของ cysc ปริมาณ recombinant มนุษย์ใน E . coli .

บทคัดย่อมนุษย์ cystatin C ( cysc ) เป็น 13 กิโลภายใน 8-12 ตัวยับยั้งโปรและถูกสอบสวนแทนครีเป็นเครื่องหมายของไต . อย่างไรก็ตาม การแสดงแบบ cysc ยากใน Escherichia coli เพราะส่งผลให้ผลผลิตต่ำและความบริสุทธิ์ไม่เพียงพอและกรดเมตา . ที่นี่เราสามารถผสม cysc กับ c-terminus สามคู่และน้ำตาลละลายโปรตีน ( MBP ) , กลูต้าไธโอน เรส ( GST ) และการแปลเริ่มต้นปัจจัย 2 โดเมน ( if2 ) และหน้าจอสำหรับความสามารถในการเพิ่มการละลายของโปรตีนที่ cysc เมื่อแสดงออกใน E . coli . MBP ที่ดีที่สุดเพื่อส่งเสริมการแสดงออกของ cysc ละลาย , ละลายสำหรับเศษส่วนที่มีบัญชีอยู่± 311 เปอร์เซ็นต์ของโปรตีน สำหรับปรับขนาดการผลิต เราบริสุทธิ์ เดอ แท็ก cysc โดยใช้ 3C ของเอส mbp-t3-cysc ผสมโปรตีน chromatography สามารถตรึงโลหะประจุทางบริสุทธิ์ น้ำหนัก โมเลกุลของ เดอ แท็ก cysc cysc ธรรมชาติและมนุษย์มีความคล้ายคลึงกับอดีตอาจเป็นเฉพาะกับ cysc ใช้แอนติบอดี นอกจากนี้เดอ แท็ก cysc แสดงเต็มรูปแบบทางชีวภาพ กิจกรรมกับปาเปนและคาเทปซิน บี ซึ่งเป็นคล้ายกับที่ของมนุษย์ cysc ธรรมชาติโปรตีนมาตรฐาน เรามีวิธีการผลิตจำนวนมากของ cysc ปริมาณ recombinant มนุษย์ใน E . coli .