Protein/lipid Interactions on Dot B

Protein/lipid Interactions on Dot Blots

Lipid dot blots were performed as previously described with few modifications [35]. Indeed, 4 µL of DMPC at 2 mg/mL (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Aventi Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL USA) or cholesterol or asolectin (Sigma) were allowed to dry on a PVDF transfer membrane (Hybond™-P, GE Healthcare Europe GmbH, Orsay, France) for 5 min. The lipid blotted membranes were then incubated at room temperature overnight with 2 mL of 20 µM WT or M8 proteins. Blots were washed twice with 1X PBS and blocked with PBS 5% screamed dried milk (Régilait, Saint Martin Belle Roche France). To detect the proteins bound to blotted DMPC, asolectin or cholesterol, mouse anti-His-tag antibody (GE Healthcare), anti-mouse-phosphatase-alkaline antibody (Sigma) and NBT/BCIP (Euromedex) were used.

Ellipsometry Images and Measurements

Adsorption experiments were performed at 25±1°C on a circular Teflon trough (20.4 cm2). The surface pressure (π) was measured with a plate of Whatman filter paper held by a Nima Wilhelmy balance. The trough was filled with 8 ml of 1× PBS buffer (pH 7.4). The surface tension of the water was measured at 72.8 mN.m−1. The interaction of proteins with lipid films (asolectin or DMPC) was performed in two steps. First, a homogeneous Langmuir monolayer of lipids was formed by spreading a 1 mg/mL solution (in 20% methanol/80% chloroforme) at the air/water interface to finally reach a constant surface pressure of 28 mN.m−1. Second, freshly defrozen and non-glycerolated proteins were injected at a concentration of 1 µM into the subphase. The surface pressure was continuously monitored. Images were obtained with an NFT IElli2000 ellipsometer (NFT, Göttingen, Germany) equipped with a double-frequency Nd–Yag laser (532 nm, 50 mW), a polarizer, an analyzer, and a CCD camera. The film morphology at the interface was observed by the CCD camera. An incidence angle of 54.58°, which gives the null conditions, was used. All images were corrected from the tilt angle observation. The spatial resolution was about 2 µm, and the image size was 450×670 µm, with a 10× magnification lens. Thickness was determined using a mean value of 1.45 for the refractive index.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปรตีน/ไขมันการโต้ตอบบน Blots จุดจัดจุดไขมันถูกดำเนินการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กับการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [35] DMPC จริง 4 µL ที่ 2 mg/mL (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ไขมันขั้วโลก Aventi, Inc., Alabaster, AL สหรัฐอเมริกา) หรือคอเลสเตอรหรือ asolectin (Sigma) ได้รับอนุญาตให้แห้งบนเยื่อโอน PVDF (P Hybond ™ GE สุขภาพสถาบัน Orsay ฝรั่งเศส) 5 นาที ไขมันเยื่อหุ้ม blotted ถูกแล้วได้รับการกกที่อุณหภูมิห้องค้างคืนด้วย 2 มล. 20 µM WT หรือ M8 โปรตีน ล้าง ด้วย 1 X PBS ครั้ง และถูกบล็อค ด้วย PBS จัด 5% กรีดร้องนมแห้ง (Régilait เซนต์มาร์ตินเบลล์ Roche ฝรั่งเศส) การตรวจหาโปรตีนที่ถูกผูกไว้กับ blotted DMPC, asolectin หรือ อร แอนติบอดีต่อต้าน His แท็กเมาส์ (GE แพทย์), NBT/BCIP (Euromedex) และแอนติบอดีต่อต้าน-mouse-ฟอสฟาเตสอัลคาไลน์ (Sigma) ใช้Ellipsometry ภาพและการวัดดำเนินการทดลองการดูดซับที่ 25±1 ° C บนรางเทฟลอนแบบวงกลม (20.4 cm2) มีวัดความดันที่พื้นผิว (π) กับแผ่นของกระดาษกรอง Whatman โดยดุล Nima Wilhelmy รางเต็มไป ด้วย 8 ml 1 × PBS บัฟเฟอร์ (pH 7.4) มีวัดแรงตึงผิวของน้ำที่ 72.8 mN.m−1 ปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน ด้วยฟิล์มไขมัน (asolectin หรือ DMPC) ที่ดำเนินการในสองขั้นตอน ครั้งแรก monolayer Langmuir เหมือนไขมันถูกสร้างขึ้น โดยการกระจายการแก้ไขปัญหา 1 mg/mL (ใน 20% methanol/80% chloroforme) ที่เชื่อมอากาศน้ำไปจน ถึงความดันคงพื้นผิวของ 28 mN.m−1 ที่ สอง defrozen สด และโปรตีน-glycerolated ถูกฉีดที่ความเข้มข้นของ 1 µM ในการ subphase อย่างต่อเนื่องมีติดตามความดันที่พื้นผิว รับภาพ ด้วยการ NFT IElli2000 ellipsometer (NFT, Göttingen เยอรมนี) มีความถี่สอง Nd-Yag เลเซอร์ (532 nm, 50 mW), การโพลาไรซ์ ตัววิเคราะห์ และกล้อง CCD สัณฐานวิทยาของฟิล์มที่อินเทอร์เฟซถูกตรวจสอบ ด้วยกล้อง CCD ใช้มุมเกิดองศา 54.58 ซึ่งทำให้เงื่อนไขเป็น null ภาพทั้งหมดถูกแก้ไขจากการตรวจสอบมุมเอียง ความละเอียดเชิงพื้นที่ประมาณ 2 µm และภาพขนาด 450 × 670 µm ด้วยเลนส์กำลังขยาย 10 × พิจารณาความหนาโดยใช้ค่าเฉลี่ย 1.45 สำหรับดัชนีหักเหของแสง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โปรตีน / ไขมันที่จุด Blots ไขมัน dot blots ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ที่มีการปรับเปลี่ยน [35] อันที่จริง 4 ไมโครลิตรของ DMPC ที่ 2 mg / ml (1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine; Aventi ขั้วโลกไขมัน, Inc เศวตศิลา, AL สหรัฐอเมริกา) หรือคอเลสเตอรอลหรือ asolectin (ซิกม่า) ได้รับอนุญาตให้แห้งบน เมมเบรนถ่ายโอน PVDF (Hybond ™ -P, GE Healthcare Europe GmbH, Orsay ฝรั่งเศส) เป็นเวลา 5 นาที เยื่อไขมันเปื้อนถูกบ่มแล้วที่อุณหภูมิห้องค้างคืนกับ 2 มิลลิลิตร 20 WT ไมครอนหรือโปรตีน M8 blots ถูกล้างครั้งที่สองกับ 1X พีบีเอสและถูกปิดกั้นด้วยนมพีบีเอส 5% กรีดร้องแห้ง (Régilait, เซนต์มาร์ติเบลล์โรชฝรั่งเศส) เพื่อตรวจหาโปรตีนผูกพันที่จะลบล้าง DMPC, asolectin หรือคอเลสเตอรอลเมาส์ต่อต้านเขาแท็กแอนติบอดี (GE Healthcare), ป้องกันเมาส์ phosphatase ด่างแอนติบอดี (ซิกม่า) และ NBT / BCIP (Euromedex) ถูกนำมาใช้. ellipsometry แสดงสินค้าและการวัดการทดลองการดูดซับได้ดำเนินการวันที่ 25 ± 1 ° C บนรางเทฟลอนกลม (20.4 cm2) ความดันพื้นผิว (π) คือการวัดที่มีแผ่นกระดาษกรอง Whatman ที่จัดขึ้นโดยความสมดุล Nima Wilhelmy รางก็เต็มไปด้วย 8 มิลลิลิตร 1 ×พีบีเอสบัฟเฟอร์ (pH 7.4) แรงตึงผิวของน้ำวัดที่ 72.8 mN.m-1 การทำงานร่วมกันของโปรตีนที่มีไขมันภาพยนตร์ (asolectin หรือ DMPC) ได้ดำเนินการในสองขั้นตอน ขั้นแรกให้ monolayer Langmuir เป็นเนื้อเดียวกันของไขมันที่ถูกสร้างขึ้นโดยการกระจายเป็นทางออกที่ 1 mg / ml (ในเมทานอล 20% / 80% chloroforme) ที่ติดต่อทางอากาศ / น้ำไปจนเข้าถึงความดันคงที่ของพื้นผิว 28 mN.m-1 ประการที่สอง defrozen สดและโปรตีนที่ไม่ใช่ glycerolated ถูกฉีดที่ความเข้มข้น 1 ไมครอนลง subphase ความดันพื้นผิวที่ได้รับการตรวจสอบอย่างต่อเนื่อง ภาพที่ได้รับกับ NFT IElli2000 ellipsometer (NFT, Göttingen, เยอรมนี) พร้อมกับคู่ความถี่ ND-Yag Laser (532 นาโนเมตร 50 MW) เป็นโพลาไร, วิเคราะห์, และกล้องวงจรปิด สัณฐานฟิล์มอินเตอร์เฟซที่ได้รับการตรวจสอบโดยกล้อง CCD ใน มุมอุบัติการณ์ของ 54.58 องศาซึ่งจะช่วยให้สภาพ null ถูกนำมาใช้ ภาพทุกภาพที่ได้รับการแก้ไขจากการสังเกตมุมเอียง ความละเอียดเชิงพื้นที่เป็นประมาณ 2 ไมครอนและขนาดของภาพ 450 × 670 ไมโครเมตรมีเลนส์ขยาย 10 เท่า ความหนาถูกกำหนดโดยใช้ค่าเฉลี่ย 1.45 สำหรับดัชนีหักเห

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โปรตีน / ไขมันปฏิสัมพันธ์บน blots จุดไขมันจุดไม้ มีการปฏิบัติการอธิบายไว้ก่อนหน้า ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [ 35 ] แน่นอน , 4 µ l dmpc 2 mg / ml ( 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ; aventi polar lipids , อิงค์ , เศวตศิลา , al USA ) หรือคอเลสเตอรอลหรือ asolectin ( Sigma ) ได้รับอนุญาตให้แห้งบนเมมเบรน PVDF ( โอน hybond ™ - P , GE Healthcare ยุโรป GmbH , ออเซ ฝรั่งเศส ) สำหรับ 5 นาทีที่เปื้อนไขมันสูงขึ้น แล้ว บ่มที่อุณหภูมิห้องในชั่วข้ามคืนกับ 2 มิลลิลิตร เติม M 20 µหรือ M8 โปรตีน ไม้ถูกล้างสองครั้งกับ 1x PBS และถูกปิดกั้นด้วย PBS 5% ร้องนมแห้ง ( R é gilait , เซนต์มาร์ตินเบลล์โรชประเทศฝรั่งเศส ) การตรวจหาโปรตีนต้องเปื้อน dmpc asolectin หรือคอเลสเตอรอล , เมาส์ , แอนติบอดีต่อต้านแท็กของเขา ( GE Healthcare ) ป้องกันเมาส์ alkaline phosphatase แอนติบอดี ( Sigma ) และ NBT / bcip ( euromedex ) สถิติที่ใช้ภาพลิปโซมิตรีและการวัดการดูดซับทดลอง 25 ± 1 ° C ราง Teflon วงกลม ( 20.4 ตร. ซม. ) พื้นผิวความดัน ( π ) วัดด้วยแผ่นกระดาษกรอง whatman จัดขึ้นโดยความสมดุล wilhelmy นิมา รางเต็มกับ 8 ml 1 × PBS buffer pH 7.4 ) แรงตึงผิวของน้ำวัดที่ 72.8 MN m − 1 ปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนกับไขมัน ภาพยนตร์ ( asolectin หรือ dmpc ) แบ่งเป็นสองขั้นตอน แรก , อย่างเป็นเนื้อเดียวกัน ขนาดของไขมันที่ถูกสร้างขึ้นโดยการกระจาย 1 mg / mL สารละลาย ( 20 % เมทานอล / 80% chloroforme ) ในอากาศ น้ำ เฟสสุดท้าย ถึงพื้นผิวความดันคงที่ 28 มิล m − 1 วินาทีสด defrozen และไม่ใช่โปรตีน glycerolated ฉีดที่ระดับความเข้มข้น 1 µ M ใน subphase . พื้นผิวความดันมีการติดตามอย่างต่อเนื่อง . ภาพที่ได้มาด้วย nft ielli2000 ลิปโซมิเตอร์ ( nft G ö ttingen , เยอรมนี ) ซึ่งมีความถี่คู่ ND YAG เลเซอร์– ( 532 nm 50 MW ) , polarizer , วิเคราะห์ , และกล้อง CCD . ภาพยนตร์ของอินเตอร์เฟซที่พบโดยกล้อง CCD . อุบัติการณ์มุม 54.58 °ซึ่งให้เงื่อนไขการใช้ ภาพทั้งหมดถูกแก้ไขจากมุมเอียงแบบสังเกต ความละเอียดเชิงพื้นที่ประมาณ 2 µเมตร และขนาดภาพ 450 × 1033 µ M กับ 10 ×ขยายเลนส์ ความหนาก็ตัดสินใจใช้หมายถึงมูลค่า 1.45 สำหรับดัชนีการหักเห .