Screening and Isolation of Bacillus

Screening and Isolation of Bacillus sp. Producing Protease
Forty samples of raw milk were obtained from a farm at Walailak University,
Nakhon Si Thammarat, Thailand. Samples were suspended and serial diluted with
sterile distilled water. Each sample was heated at 80 °C for 30 min in a water bath,
spread onto Luria Bertani (LB) agar and subsequently incubated at 37 °C for 24 h.
Colonies producing a clear zone were selected from LB supplemented with 2 %
skimmed milk agar and transferred onto a new agar by the point inoculation technique
following incubation at 50 °C for 24 h. Bacteria having a clear zone diameter of more
than 10 mm were selected for protease activity assay and were used throughout the
study.
Determination of Protease Activity
The bacteria having a clear zone diameter of more than 10 mm were selected
and cultivated in LB supplemented with 2 % skimmed milk broth. The culture broth
was incubated at 50 °C in a rotary shaker operated at 200 rpm for 24 h. Afterwards the
bacterial cell cultures were centrifuged at 10,000 rpm for 10 min. The supernatant was
collected and assayed for protease activity. The reaction mixtures containing 1 ml
enzyme solution and 1.5 % casein were incubated in a water bath at 50 °C for 10 min.
K SANTONG et al
153
The supernatant was obtained by centrifugation at 10,000 rpm for 10 min. Next, 0.4 M
Na2CO3 and Folin’s reagent were added to terminate the reaction, and the reaction
mixture was left to stand at room temperature for 10 min. The protease activity was
determined spectrophotometrically at 660 nm. One unit of enzyme activity was defined
as the amount of enzyme which produced 1 U/ml of tyrosine per min at 660 nm under
control conditions. Specific activity was expressed as units per mg of protein of the
enzyme extract. Additionally, the gelatinolytic activity and caseinolytic activity were
performed according to the above protocol using 1 % gelatin and 1 % casein,
respectively [9].
Effect of Temperature on Protease Stability
The effect of temperature on protease stability was evaluated by using various
temperatures tested including 37 °C, 50 °C, 100 °C and 121 °C for 3 h, 1 h, 30 min and
15 min, respectively [9].
Protein Assay
Protein content was estimated by the Bradford method (Bio-Rad protein dye
reagent). Bovine serum albumin (BSA) was used as a standard protein. The protein
concentration was measured spectophotometrically at 595 nm [10].
Identification of Bacillus sp. Producing Protease
The isolates containing maximum proteolytic activity were identified according
to physiological and Gram stain characteristics outlined in Bergey’s Manual [11]. The
morphology of the bacteria was observed with a light microscope. Gram staining was
performed using crystal violet, I2 in KI and safranin as reagents. The biochemical
characteristics were tested using API 50 CHB medium (bioMérieux) according to the
manufacturer’s instructions, incubating at 55 °C. The 16S rRNA gene was amplified
from genomic DNA obtained from the bacterial culture by the PCR method with the
universal primers FC27 (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) and RC1492 (5′-
TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) [12]. PCR conditions consisted of an initial
denaturation at 94 °C for 5 min; 30 cycles at 94 °C for 1 min, 55 °C for 1 min and 72 °C
for 1 min; and a final extension at 72 °C for 10 min. The amplification products were
cloned into pGEM-TEasy (Promega) and sequenced using an ABI prism 377 apparatus.
The 16S rRNA sequences were analyzed by the National Center for Biotechnology
Information using the BLAST network service.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คัดกรองและแยกคัด sp.ผลิตรติเอสสี่สิบตัวอย่างน้ำนมดิบที่ได้รับมาจากฟาร์มที่มหาวิทยาลัยวลัยลักษณ์นครศรีธรรมราช ไทย ตัวอย่างถูกหยุดชั่วคราว และประจำผสมกับน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ แต่ละอย่างถูกความร้อนที่ 80 ° C สำหรับ 30 นาทีในการอาบน้ำแพร่กระจาย สู่ agar Luria Bertani (ปอนด์) และต่อมา incubated ที่ 37 ° C ใน 24 ชมเลือกอาณานิคมผลิตโซนชัดเจนจากปอนด์เสริม ด้วย 2%เอานม agar และโอนไป agar ใหม่เทคนิค inoculation จุดบ่มต่อที่ 50 ° C ใน 24 h. แบคทีเรียที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางโซนชัดเจนมากกว่ากว่า 10 มม.ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์กิจกรรมรติเอส และใช้ตลอดทั้งการศึกษากำหนดกิจกรรมรติเอส เลือกเชื้อแบคทีเรียที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางโซนชัดเจนกว่า 10 มม.และปลูกปอนด์เสริม ด้วยซุปนมขาดมันเนย 2% ซุปวัฒนธรรมมี incubated ที่ 50 ° C ในเชคเกอร์โรตารี่ที่ดำเนินที่ 200 rpm สำหรับ 24 h. ภายหลังวัฒนธรรมเซลล์แบคทีเรียมี centrifuged ที่ 10000 rpm สำหรับ 10 นาที Supernatant ถูกรวบรวม และ assayed สำหรับกิจกรรมรติเอส ส่วนผสมของปฏิกิริยาที่ประกอบด้วย 1 mlโซลูชั่นเอนไซม์และเคซีน 1.5% มี incubated ในห้องน้ำที่ 50 องศาเซลเซียสใน 10 นาทีK SANTONG et al153Supernatant ที่กล่าว โดย centrifugation ที่ 10000 rpm สำหรับ 10 นาที ถัดไป 0.4 MNa2CO3 และรีเอเจนต์ของ Folin เพิ่มเพื่อหยุดปฏิกิริยา และปฏิกิริยาmixture was left to stand at room temperature for 10 min. The protease activity wasdetermined spectrophotometrically at 660 nm. One unit of enzyme activity was definedas the amount of enzyme which produced 1 U/ml of tyrosine per min at 660 nm undercontrol conditions. Specific activity was expressed as units per mg of protein of theenzyme extract. Additionally, the gelatinolytic activity and caseinolytic activity wereperformed according to the above protocol using 1 % gelatin and 1 % casein,respectively [9].Effect of Temperature on Protease Stability The effect of temperature on protease stability was evaluated by using varioustemperatures tested including 37 °C, 50 °C, 100 °C and 121 °C for 3 h, 1 h, 30 min and15 min, respectively [9].Protein AssayProtein content was estimated by the Bradford method (Bio-Rad protein dyereagent). Bovine serum albumin (BSA) was used as a standard protein. The proteinconcentration was measured spectophotometrically at 595 nm [10].Identification of Bacillus sp. Producing ProteaseThe isolates containing maximum proteolytic activity were identified accordingto physiological and Gram stain characteristics outlined in Bergey’s Manual [11]. Themorphology of the bacteria was observed with a light microscope. Gram staining wasperformed using crystal violet, I2 in KI and safranin as reagents. The biochemicalcharacteristics were tested using API 50 CHB medium (bioMérieux) according to themanufacturer’s instructions, incubating at 55 °C. The 16S rRNA gene was amplified
from genomic DNA obtained from the bacterial culture by the PCR method with the
universal primers FC27 (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) and RC1492 (5′-
TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) [12]. PCR conditions consisted of an initial
denaturation at 94 °C for 5 min; 30 cycles at 94 °C for 1 min, 55 °C for 1 min and 72 °C
for 1 min; and a final extension at 72 °C for 10 min. The amplification products were
cloned into pGEM-TEasy (Promega) and sequenced using an ABI prism 377 apparatus.
The 16S rRNA sequences were analyzed by the National Center for Biotechnology
Information using the BLAST network service.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การคัดกรองและการแยกเชื้อ Bacillus sp การผลิตโปรติเอสสี่สิบตัวอย่างน้ำนมดิบที่ได้รับจากฟาร์มที่มหาวิทยาลัยวลัยลักษณ์, นครศรีธรรมราช, ไทย ตัวอย่างถูกระงับและอนุกรมเจือจางด้วยน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ แต่ละตัวอย่างถูกความร้อนที่ 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีในอ่างน้ำที่แพร่กระจายไปยังLuria Bertani (LB) วุ้นและบ่มต่อมาที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง. อาณานิคมผลิตโซนที่ชัดเจนได้รับเลือกจาก LB เสริมด้วย 2% นมไขมันต่ำ วุ้นและโอนไปยังวุ้นใหม่โดยใช้เทคนิคการฉีดวัคซีนจุดต่อไปบ่มที่50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แบคทีเรียที่มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางโซนที่ชัดเจนมากขึ้นกว่า 10 มมถูกเลือกสำหรับการทดสอบกิจกรรมโปรติเอสและถูกนำมาใช้ตลอดการศึกษา. การกำหนดกิจกรรมโปรติเอสแบคทีเรียที่มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางโซนที่ชัดเจนมากกว่า 10 มมได้รับการคัดเลือกและปลูกในLB เสริมด้วย 2% น้ำซุปนมไขมันต่ำ น้ำซุปวัฒนธรรมได้รับการบ่มที่ 50 องศาเซลเซียสในเครื่องปั่นหมุนดำเนินการที่ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นเซลล์เพาะเลี้ยงแบคทีเรียถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที สารละลายที่ถูกเก็บรวบรวมและ assayed กิจกรรมโปรติเอส ผสมปฏิกิริยาที่มีมล. 1 แก้ปัญหาเอนไซม์และเคซีน 1.5% ถูกบ่มในอ่างน้ำที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที. K Santong et al, 153 ใสที่ได้รับโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที ถัดไป 0.4 M Na2CO3 และน้ำยา Folin ถูกเพิ่มในการยุติปฏิกิริยาและเกิดปฏิกิริยาส่วนผสมถูกทิ้งให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา10 นาที กิจกรรมโปรติเอสที่ได้รับการกำหนด spectrophotometrically ที่ 660 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ซึ่งผลิต 1 U / ml ของซายน์ต่อนาทีที่ 660 นาโนเมตรภายใต้เงื่อนไขการควบคุม กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงได้รับการแสดงเป็นหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนของสารสกัดจากเอนไซม์ นอกจากนี้กิจกรรม gelatinolytic และกิจกรรม caseinolytic ถูกดำเนินการตามโปรโตคอลข้างต้นโดยใช้เจลาติน1% และเคซีน 1% ตามลำดับ [9]. ผลของอุณหภูมิต่อน้ำย่อยเสถียรภาพผลของอุณหภูมิที่มีต่อความมั่นคงโปรติเอสได้รับการประเมินโดยใช้ต่างๆอุณหภูมิทดสอบรวมทั้ง37 ° C, 50 ° C, 100 ° C ถึง 121 ° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง, 1 ชั่วโมง 30 นาทีและ15 นาทีตามลำดับ [9]. โปรตีนวิเคราะห์ปริมาณโปรตีนเป็นที่คาดกันโดยวิธีแบรดฟอ (Bio-Rad โปรตีนย้อมน้ำยา) ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) ถูกใช้เป็นโปรตีนมาตรฐาน โปรตีนเข้มข้นวัด spectophotometrically ที่ 595 นาโนเมตร [10]. บัตรประจำตัวของเชื้อ Bacillus sp การผลิตโปรติเอสแยกกิจกรรมที่มีโปรตีนสูงสุดถูกระบุตามไปทางสรีรวิทยาและคู่มือการใช้งานแกรมลักษณะคราบที่ระบุไว้ในBergey ของ [11] สัณฐานวิทยาของเชื้อแบคทีเรียที่พบว่ามีแสงกล้องจุลทรรศน์ การย้อมสีแกรมได้รับการดำเนินการโดยใช้สีม่วงคริสตัล, I2 ใน KI และ safranin เป็นน้ำยา ชีวเคมีลักษณะถูกทดสอบโดยใช้ API 50 CHB กลาง (bioM? rieux) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต, การบ่มที่ 55 องศาเซลเซียส 16S rRNA ยีนถูกขยายจากดีเอ็นเอที่ได้จากการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียโดยวิธีPCR ด้วยไพรเมอร์สากลFC27 (5'-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3) และ RC1492 (5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ') [12] เงื่อนไข PCR ประกอบด้วยเบื้องต้นdenaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; 30 รอบที่ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 55 ° C เป็นเวลา 1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา1 นาที; และขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์เครื่องขยายเสียงถูกโคลนเข้า pGEM-TEasy (Promega) ติดใจใช้อุปกรณ์ปริซึม ABI 377. ลำดับ 16S rRNA วิเคราะห์โดยศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติข้อมูลการใช้บริการเครือข่ายการระเบิด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การคัดกรองและแยกเชื้อผลิตเอนไซม์โปรติเอส 40 sp .
ตัวอย่างน้ำนมดิบที่ได้จากฟาร์มที่ มหาวิทยาลัยวลัยลักษณ์
นครศรีธรรมราช , ประเทศไทย ตัวอย่างถูกหยุดชั่วคราว และอนุกรม
หมันเจือจางด้วยน้ำกลั่น แต่ละตัวอย่างก็ร้อน 80 องศา C เป็นเวลา 30 นาทีในการอาบน้ำ ,
แพร่กระจายไปยังลุเรียแบร์ตานิ ( LB ) วุ้น และภายหลังบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
อาณานิคมการผลิตใสจำนวนปอนด์เสริม 2 %
ตักวุ้นนม และย้ายบนวุ้นใหม่ โดยจุดที่ใช้เทคนิค
ต่อไปนี้บ่มที่ 50 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แบคทีเรียมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางของเคลียร์โซนมากขึ้น
10 มม. เลือก protease activity assay และใช้ตลอด
ศึกษา

กิจกรรมการหาโปรติเอสแบคทีเรียที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางโซนชัดเจนมากกว่า 10 มิลลิเมตร และมีปลูกในอาหาร LB
2 % เลือกตักน้ำซุป นม วัฒนธรรมซุป
ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 50 องศาซีในการปั่นหมุนที่ความเร็วรอบ 200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น
วัฒนธรรมเซลล์แบคทีเรียเป็นระดับที่ 10 , 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที และน่านคือ
รวบรวมและซีรั่มสำหรับกิจกรรมโปรติเอสปฏิกิริยาของของผสมที่มี 1 ml
สารละลายเอนไซม์และ 1.5 เปอร์เซ็นต์ เคซีน คือบ่มในน้ำอาบที่ 50 ° C 10 นาที
K santong et al

สูง 153 ได้โดยการเหวี่ยงแยกที่ 10 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีถัดไป 0.4 M
Na2CO3 folin ของรีเอเจนต์และเพิ่มการตอบสนองและ ปฏิกิริยา
ส่วนผสมถูกปล่อยให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีและ protease activity คือ
วัดนี้ที่ 660 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ได้นิยาม
เมื่อปริมาณเอนไซม์ที่ผลิต 1 U / ml ของไทโรซีนต่อนาทีที่ 660 nm ภายใต้
เงื่อนไขการควบคุม กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงจะแสดงเป็นหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนของเอนไซม์สกัด
. นอกจากนี้ กิจกรรม กิจกรรม และ caseinolytic ถูก
gelatinolyticดำเนินการตามขั้นตอนข้างต้นโดยใช้เจลาติน 1 % และ 1% เคซีน ,
3 [ 9 ] .

ติผลของอุณหภูมิต่อความมั่นคง ผลกระทบของอุณหภูมิต่อเสถียรภาพของเอนไซม์โปรตีเอสจะถูกประเมินโดยใช้อุณหภูมิต่าง ๆรวมทั้ง 37 ° C
ทดสอบ 50 ° C 100 ° C และ 121 ° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง 1 ชั่วโมง 30 นาทีและ 15 นาทีตามลำดับ
, [ 9 ] .
3
โปรตีนปริมาณโปรตีนประมาณโดยวิธี Bradford ( ไบโอ ราดโปรตีนย้อม
3 ) อัลบูมิน ( BSA ) ใช้เป็นสารมาตรฐาน โปรตีนเข้มข้น spectophotometrically
วัดที่ 595 nm [ 10 ] .
ตัว sp . ในการผลิตโปรตีนไอโซเลตโปรตีนที่มีกิจกรรมสูงสุด

ถูกระบุตามในทางสรีรวิทยาและกรัมคราบลักษณะที่ระบุไว้ในคู่มือวิธี [ 11 ]
สัณฐานวิทยาของแบคทีเรียถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ กรัมย้อม
โดยใช้คริสตัลสีม่วง , I2 ในกิและซาฟรานินตามที่ reagents ลักษณะทางชีวเคมี
จำนวน API 50 chb ขนาดกลาง ( biom é rieux ) ตามคำสั่ง
ของผู้ผลิตไข่ที่ 55 องศาส่วนเบส 16S rRNA ยีนฮีโม
จาก genomic DNA ที่ได้จากการเพาะเชื้อโดยวิธีพีซีอาร์ด้วยไพรเมอร์ fc27
สากล ( 5 ’ - agagtt tgatcctggctcag-3 School ) และ rc1492 ( 5 ’ -
tacggctaccttgttacgactt-3 School ) [ 12 ] เงื่อนไขซึ่งประกอบด้วยการเริ่มต้นที่ 94 ° C (
5 นาที ; 30 รอบที่ 94 °องศาเซลเซียสนาน 1 นาที 55 ° C เป็นเวลา 1 นาที 72 ° C
1 นาที ;และส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ที่ขยายอยู่
pgem โคลนเข้า teasy ( promega ) และลำดับการใช้ปริซึม 377 ABI อุปกรณ์
เบส 16S rRNA ลำดับวิเคราะห์โดยศูนย์สารสนเทศเทคโนโลยีชีวภาพ
ใช้ระเบิดเครือข่ายบริการแห่งชาติ