Cell-based assay methods are now ro

Cell-based assay methods are now routinely incorporated into high throughput screening activities for drug discovery and development (Digan, 2005; Boisclair, 2005). Automated dispensing and ancillary robotic systems make it possible to rapidly and efficiently interrogate a compound library for biological effects on a target cell population. As assay well densities increase and volumes plummet however, new physical constraints and practical hurdles commonly emerge that negatively impact reproducibility and sensitivity (Rose, 1997; Maffia, 1999). Therefore, new robust and scalable reagents are sought to produce higher quality data in a cost-effective manner.

Cytotoxicity is one of the most common biological parameters measured after experimental manipulation largely because it is easily measured and adheres to the dose-dependence paradigm of Paracelsus. It is well known that many drugs produce physiological and therapeutic actions at lower concentrations while the toxic effects including necrosis or apoptosis occur at higher concentrations. Regardless of the mechanism of cell death, mammalian cells after interacting with toxins undergo a series of dramatic structural and morphological changes that lead to loss of membrane integrity (Leist, 2001). This irreparable damage to cellular architecture allows free movement of previously excluded molecules into the cell, as well as their enzymatic contents to leak into the culture medium (Riss, 2004). Therefore, measurement of intracellular enzyme marker activity in the extra-cellular environment is the basis of several cytotoxicity assays for accessing cell membrane integrity.

Currently, several cell-based cytoxicity assays are available for determining cell membrane integrity. Dye uptake assays using neutral red, trypan blue and fluorescent compounds such as propidium iodide are traditional methods to assess cell viability and membrane damage. Trypan blue and fluorescent compounds such as propidium iodide are excluded by healthy, functional cell membranes but are able to traverse damaged cell membranes thereby preferentially staining dead cells. Conversely, neutral red accumulates only in the lysosomes of viable cells. The lactate dehydrogenase (LDH) release assay is widely used in in vitro toxicology studies. This assay is based on the measurement of LDH activity in the extracellular medium. Membrane integrity can be also evaluated by other enzyme release assays including adenylate kinase (Olsson et al., 1983) or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Corey et at., 1997), which are present in all cells. These enzymes are normally compartmentalized within the cell, but their activities are significantly increased in the extracellular environment as a result of cell death. However, these assays have their limitations including multiple reagent additions, low sensitivity, low-throughput and scalability, poor linearity, and the need for requisite washes or medium exchanges.

Although many assay methods have been developed for determining cytotoxicity in lower density formats, precious few have been validated for use in high throughput screening that requires simple, homogenous assay procedure with robust assay signal. Niles et al. recently described a novel proteolytic biomarker profile for cytotoxicity that embodies many biological attributes desirable for robust assay development (Niles et al., 2007). Subsequently, a homogenous luminescent assay was developed for measuring this biomarker that comprises a formulation containing an aminoluciferin-conjugated substrate, ATP, MgSO4 and a thermostable, recombinant luciferase (Figure 1). We describe here the development and validation of a bioluminescent cytotoxicity assay using a protease biomarker in a 1536-well plate format, by the screening of the1408 compound collection from National Toxicology Program (NTP) (Xia et al., 2008). We have identified several known and novel membrane disrupters by screening NTP library, which indicates that the assay is robust and suitable for large scale library screening.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์ตามวิธีการตรวจในขณะนี้โดยรวมสูง throughput กลั่นกรองกิจกรรมสำหรับการค้นพบและพัฒนายา ( digan , 2005 ; boisclair , 2005 ) จ่ายยาอัตโนมัติ และระบบหุ่นยนต์ ancillary ให้มันเป็นไปได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ สอบสวนและห้องสมุดสำหรับผลกระทบทางชีวภาพบนเซลล์เป้าหมายประชากรเซลล์ตามวิธีการตรวจในขณะนี้โดยรวมสูง throughput กลั่นกรองกิจกรรมสำหรับการค้นพบและพัฒนายา ( digan , 2005 ; boisclair , 2005 ) จ่ายยาอัตโนมัติ และระบบหุ่นยนต์ ancillary ให้มันเป็นไปได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ สอบสวนและห้องสมุดสำหรับผลกระทบทางชีวภาพบนเซลล์เป้าหมายประชากรมะเร็งเป็นหนึ่งในที่พบมากที่สุดชีวภาพวัดหลังจากทดลองการจัดการส่วนใหญ่เพราะมันวัดได้ง่ายและสอดคล้องกับการใช้กระบวนทัศน์ของพาราเซลซัส . มันเป็นที่รู้จักกันดีว่าหลายยาเสพติดผลิตทางสรีรวิทยาและการกระทำที่ความเข้มข้นต่ำในขณะที่พิษรวมทั้งการวาดเส้นหรือ apoptosis เกิดขึ้นที่ความเข้มข้นสูงเป็น การทดสอบความหนาแน่นเพิ่มขึ้น และปริมาณก็ดิ่งอย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดและอุปสรรคทางกายภาพใหม่ในทางปฏิบัติมักโผล่ที่ส่งผลกระทบในทางลบตรวจสอบและความไว ( กุหลาบ , 1997 ; maffia , 1999 ) เพราะฉะนั้น ใหม่ที่แข็งแกร่งและยืดหยุ่นเพื่อขอผลิตข้อมูลคุณภาพสูงในลักษณะที่ประหยัดต้นทุน .

รวมทั้งเนื้อหาของเอนไซม์ที่รั่วไหลลงในวัฒนธรรมขนาดกลาง ( ริส , 2004 ) ดังนั้นการวัดเซลล์ของเอนไซม์เครื่องหมายกิจกรรมในสภาพแวดล้อมที่มือถือเสริมพื้นฐานของวิธีการหลายเซลล์สำหรับการเข้าถึงเยื่อเซลล์สมบูรณ์

ปัจจุบันหลายปัจจุบัน ) มีกำหนด cytoxicity เยื่อหุ้มเซลล์ความซื่อสัตย์โดยไม่คำนึงถึงกลไกการตายของเซลล์ เซลล์ mammalian หลังจากการโต้ตอบกับสารพิษผ่านชุดของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่น่าทึ่ง ทำให้สูญเสียความสมบูรณ์ของเมมเบรน ( leist , 2001 ) นี้แก้ไขไม่ได้ ความเสียหายกับสถาปัตยกรรมมือถือช่วยให้การเคลื่อนไหวของการยกเว้นก่อนหน้านี้โมเลกุลฟรีในมือถือการใช้สีที่เป็นกลางหรือสีแดง , สีฟ้าเรืองแสงไตรแพนและสารประกอบ เช่น propidium ไอโอไดด์เป็นวิธีการแบบดั้งเดิมเพื่อประเมินความมีชีวิตของเซลล์เมมเบรนและความเสียหาย ไตรแพนสีฟ้าเรืองแสงและสารประกอบ เช่น propidium ไอโอไดด์จะถูกแยกออกโดยสุขภาพ การทำงาน เยื่อหุ้มเซลล์ แต่สามารถที่จะเข้าไปทำลายเยื่อหุ้มเซลล์จึง preferentially คราบเซลล์ที่ตายแล้ว ในทางกลับกันสีแดงกลางสะสมเฉพาะในไลโซโซมของใช้เซลล์ และ lactate dehydrogenase ( LDH ) รุ่นทดสอบที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อวิทยาศึกษา วิธีนี้อาศัยการวัดกิจกรรมในกลางและหลัง . เยื่อที่สมบูรณ์สามารถประเมินโดยวิธีปล่อยเอนไซม์อื่น ๆ รวมทั้งการนำเสนอภาพนิ่งไคเนส ( โอลส์สัน et al . ,สูงต่ำและ scalability , ถึงยากจน และต้องล้างที่จำเป็นหรือแลกเปลี่ยนสื่อ

ถึงแม้ว่าการทดสอบมากมายได้ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อกำหนดความเป็นพิษในรูปแบบความหนาแน่นต่ำน้อยได้รับการตรวจสอบเพื่อใช้ในการคัดกรองสูง throughput ที่ใช้ง่าย ขั้นตอนการทดสอบ การทดสอบเนื้อเดียวกันกับสัญญาณที่แข็งแกร่ง ไนล์ et al .1983 ) หรือ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( gapdh ) ( Corey et . , 1997 ) ซึ่งมีอยู่ในทุกเซลล์ เอนไซม์เหล่านี้โดยปกติจะถูกแบ่งแยกภายในเซลล์ แต่กิจกรรมของพวกเขาจะเพิ่มขึ้นในสภาพแวดล้อมที่สำคัญ เป็นผลให้เซลล์ตาย อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้มีข้อ จำกัด ของพวกเขา รวมถึงหลายสารเคมีที่ใช้เพิ่มความไวต่ำเมื่อเร็ว ๆนี้อธิบายนวนิยายโปรตีนไบโอมาร์คเกอร์โปรไฟล์สำหรับเซลล์ที่ embodies คุณลักษณะทางชีวภาพมากมายพึงปรารถนาเพื่อการพัฒนาการทดสอบประสิทธิภาพ ( Niles et al . , 2007 ) ต่อมาเป็นเนื้อเดียว โดยรวม พัฒนาวัดนี้ไบโอมาร์คเกอร์ที่ประกอบด้วยสูตรที่มี aminoluciferin conjugated ตั้งต้น และสร้างสาร ATP MgSO4 ใ , ,รีคอมบิแนนท์เอนไซม์ลูซิเฟอเรส ( รูปที่ 1 ) เราอธิบายที่นี่การพัฒนาและตรวจสอบความตรงของไบโอลูมิเนสเซนต์ต่อการทดสอบโดยใช้โปรตีนไบโอมาร์คเกอร์ในรูปแบบคู่ดีจาน โดยการคัดเลือก the1408 ผสมคอลเลกชันจากโปรแกรมพิษวิทยาแห่งชาติ ( NTP ) ( Xia et al . , 2008 ) เราได้ระบุหลายที่รู้จักและ disrupters เยื่อนวนิยายโดยห้องสมุด NTP การคัดกรอง ,ซึ่งบ่งชี้ว่าแบคทีเรียที่แข็งแกร่ง และเหมาะสมสำหรับการคัดกรองห้องสมุดขนาดใหญ่