2.5. Cloning and expression in A. n

2.5. Cloning and expression in A. niger The gene cadA which encodes cis-aconitate decarboxylase was cloned based on a PCR amplified gene copy derived from the used A. terreus strain. Two primers Cadfor53 C 50 –TCCCGGATCCTTAT ACCAGTGGCGATTT-30 , Cadrev52 C 50 -CCCCGGATCCTTATACCAGTG GCGATTTTACGG-30 containing BspHI and BamHI restriction sites, respectively, were generated to amplifying the cadA sequence based on A. terreus genomic DNA. The complete coding region of the cadA gene was isolated from the PCR product as BspHI–BamHI fragments, and cloned into the Aspergillus expression vector pAN52-4amdS. Subsequently, this vector was transformed into an Aspergillus niger strain AB 1.13. The transformants resulting for this experiment were purified twice by single colony purification on AmdS+ selection plates (Kelly and Hynes, 1985). The chromosomal DNAs were isolated from 67 h cultivated (minimal medium) A. niger AB 1.13 CAD transformants for Southern blot analysis (Okabe et al., 2009; Punt et al., 2008). Hybridisation was carried out using a probe derived from the cadA gene for probe labeling. The Alkphos direct labeling and detection system Amersham was used. As a loading control, a probe derived from the A. niger gpdA gene was used.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 การโคลน และนิพจน์ในไนเจอร์ A. cadA ยีนซึ่งจแมป decarboxylase cis aconitate ถูกโคลนตามสำเนายีน PCR ที่ขยายมาจากสายพันธุ์ A. terreus ใช้ ไพรเมอร์สอง Cadfor53 C 50-TCCCGGATCCTTAT ACCAGTGGCGATTT-30, Cadrev52 C 50 - CCCCGGATCCTTATACCAGTG GCGATTTTACGG-30 ที่มี BspHI และ BamHI จำกัดเว็บไซต์ ตามลำดับ สร้างขึ้นกับมือลำดับ cadA ตาม A. terreus genomic DNA ภูมิภาคสภาพสมบูรณ์ของยีน cadA ถูกแยกต่างหากจากผลิตภัณฑ์ PCR เป็นบางส่วนของ BspHI – BamHI และโคลนในการ Aspergillus นิพจน์เวกเตอร์ pAN52-4amdS ในเวลาต่อมา เวกเตอร์นี้ถูกเปลี่ยนเป็นต้องใช้ Aspergillus ไนเจอร์ AB 1.13 Transformants ที่เกิดในการทดลองนี้ได้บริสุทธิ์สองครั้ง โดยฟอกฝูงเดียวใน AmdS + เลือกแผ่น (เคลลี่และ Hynes, 1985) DNAs ของโครโมโซมที่แยกจาก transformants AB 1.13 CAD ไนเจอร์อ. 67 h cultivated (น้อยกลาง) สำหรับการวิเคราะห์คืนในใต้ตา (Okabe et al., 2009 ตัด et al., 2008) Hybridisation ถูกดำเนินโดยใช้โพรบที่สืบทอดมาจากยีน cadA สำหรับการติดฉลากของโพรบ Alkphos ตรงติดฉลากและการตรวจสอบระบบ Amersham ใช้ มีใช้โพรบที่สืบทอดมาจากยีน gpdA A. ไนเจอร์เป็นตัวควบคุมที่โหลด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 การโคลนและการแสดงออกในเอไนเจอร์ Cada ยีนซึ่ง encodes decarboxylase ถูกต้อง-aconitate ถูกโคลนขึ้นอยู่กับวิธี PCR สำเนายีนขยายมาจากสายพันธุ์ที่ใช้ A. terreus ไพรเมอร์สอง Cadfor53 C 50 -TCCCGGATCCTTAT ACCAGTGGCGATTT-30, C 50 Cadrev52 -CCCCGGATCCTTATACCAGTG GCGATTTTACGG-30 ที่มี BspHI และ BamHI เว็บไซต์ข้อ จำกัด ตามลำดับถูกสร้างขึ้นเพื่อขยายลำดับ Cada ขึ้นอยู่กับ A. terreus ดีเอ็นเอ ภาคการเข้ารหัสที่สมบูรณ์ของยีน Cada ที่แยกได้จากผลิตภัณฑ์ PCR เป็นเศษเล็กเศษน้อย BspHI-BamHI และโคลนเข้าไปในเวกเตอร์แสดงออก Aspergillus pAN52-4amdS ต่อมาเวกเตอร์นี้ก็กลายเป็นสายพันธุ์เชื้อรา Aspergillus ไนเจอร์ AB 1.13 transformants ผลสำหรับการทดลองนี้ได้รับการชำระล้างครั้งที่สองโดยการทำให้บริสุทธิ์อาณานิคมเดียวบน AMDS + แผ่นเลือก (เคลลี่และ Hynes, 1985) ดีเอ็นเอโครโมโซมที่แยกได้จากการเพาะปลูก 67 ชั่วโมง (กลางน้อยที่สุด) เอไนเจอร์ AB 1.13 transformants CAD สำหรับการวิเคราะห์ blot ภาคใต้ (Okabe et al, 2009;.. ถ่อ et al, 2008) hybridisation ได้รับการดำเนินการโดยใช้หัววัดที่ได้มาจากยีน Cada สำหรับการติดฉลากแสดงความคิดเห็น Alkphos โดยตรงการติดฉลากและการตรวจสอบระบบ Amersham ถูกนำมาใช้ การควบคุมการโหลด, การสอบสวนที่ได้มาจากยีนเอไนเจอร์ GPDA ถูกนำมาใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 การโคลนและการแสดงออกของยีนใน A . niger คาด้าที่ encodes CIS อะโคนิเตตใช้ถูกโคลนบนพื้นฐานของ PCR ของยีนคัดลอกมาจากสายพันธุ์ที่ใช้ A . terreus ที่ . สองชนิด cadfor53 C 50 – tcccggatccttat accagtggcgattt-30 cadrev52 C , 50 - ccccggatccttataccagtg gcgattttacgg-30 ที่มี bsphi BamHI และเว็บไซต์ จำกัด ตามลำดับถูกสร้างขึ้นเพื่อ amplifying คาด้าลำดับตาม A . terreus ที่จีโนมดีเอ็นเอ รหัสภูมิภาคที่สมบูรณ์ของยีนคาด้าถูกแยกจากผลิตภัณฑ์ PCR เป็น bsphi BamHI และชิ้นส่วนและโคลนเข้าไปในการควบคุมการแสดงออก pan52-4amds เวกเตอร์ . ต่อมา , เวกเตอร์นี้ก็กลายเป็นเชื้อรา Aspergillus niger สายพันธุ์ AB 1.13 .พลาสมิดเป็นผลสำหรับการทดลองนี้มีความบริสุทธิ์ถึงสองครั้งโดยบริสุทธิ์อาณานิคมเดียวใน amds เลือกแผ่น ( Kelly และไฮน์ส , 1985 ) ที่แยกได้จากแถบโครโมโซม 67 H ปลูก ( minimal medium ) A . niger AB 1.13 CAD พลาสมิดสำหรับการทำ Southern blot analysis ( โอคาเบะ et al . , 2009 ; ถ่อ et al . , 2008 )ไฮบริไดเซชันมีการใช้โพรบมาจากยีนคาด้าเพื่อตรวจสอบการติดฉลาก การ alkphos โดยการติดฉลากและระบบตรวจจับที่ใช้ เป็นการควบคุม ตรวจสอบได้จาก A . niger gpda ยีนที่ใช้