2.2.8. Particle sizes and zeta-pote

2.2.8. Particle sizes and zeta-potentials of FA-SLICS/pDNA polyplexes The particle sizes and zeta potentials of different FA-SLICS/pDNA polyplexes were measured by a Malvern Zetasizer (Malvern Inst. Ltd. UK) at pH 7.2, equipped with a four-side clear cuvette or ZET 5104 cell at room temperature [16]. The concentration of pDNA was kept at 5 g/mL for these polyplexes. For particle size analysis, the cumulant method was used to convert intensity–intensity autocorrelation functions to apparent particle sizes according to the Stokes–Einstein relationship [17]. The Smuloschowski model was used to convert electrophoresis mobility to zeta potential. Ten parallel runs were carried out for each measurement and the final data were obtained based on statistical analysis.

2.2.9. Ethidium bromide (EtBr) exclusion assays The pDNA condensation was measured by EtBr exclusion method [18]. Briefly, 4 g pDNA was mixed with the gradually increased amounts of FA-SLICS to a final volume of 280 L at 58 B. Shi et al. / Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 119 (2014) 55–65 different N/P ratios and pH 7.2. After incubation for 30 min at room temperature, 20 L of a 0.1 mg/mL EtBr solution was added to the solutions of polymer/pDNA polyplexes and mixed intensively. Fluorescence was recorded using a fluorescence plate reader (LS 50 B; Perkin-Elmer, Rodgau-Jugesheim, Germany) at 518 nm excitation and 605 nm emission wavelengths. Analytical results were presented as the relative fluorescence intensity values, where 1 represents the fluorescence of naked DNA with EtBr and without polycation, and 0 represents the remaining fluorescence of nonintercalating EtBr.

2.2.10. pDNA release ex vivo The FA-SLICS/pDNA polyplexes prepared at N/P ratios of 5, 10, and 20 were incubated at 37 ◦C with DMEM at pH 7.2 for 30 min. The solution pHs of the FA-SLICS/pDNA polyplexes were adjusted to 7, 6 and 5, respectively. At each pH, the complex suspension was centrifuged at 20,000 × g for 30 min and the supernatant was quantified for pDNA content by spectrofluorimetry after the addition of Hoechst 33258 (20 L, 1 mmol/L) [19].


2.2.11. Cytotoxicity Cancer cells (HeLa and HepG2) and normal cell (CHO) were cultured in DMEM medium supplied with 10% FBS in 96-well plates (200 L/well) at a cell density of 1.0 × 105 cells/mL. After inoculation, the cells were allowed to adhere overnight at 37 ◦C in a humidified 5% CO2-containing atmosphere. The growth medium was replaced with 200 L fresh medium containing FA-SLICS polymers at final concentrations of 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, and 50 g/mL. Cells were then incubated for 24–72 h before 10 L of MTT (5.0 mg/mL in PBS) was added to each well to measure cell viability [20]. After incubating for another 4 h at 37 ◦C, the growth medium was replaced by 150 L of dimethyl sulfoxide (DMSO) to ensure complete solubilization of the formed formazan crystals. Finally, the absorbance was determined using the Biotek Microplate Reader (Biotek, USA) at a wavelength of 570 nm [21].

2.2.12. Intracellular uptake by confocal laser scanning microscopy (CLSM) HeLa and HepG2 cells at a concentration of 2 × 105 cells/well were cultured in 6-well plates loaded with cover-glass slides for 24 h. 4 g YOYO-1 labeled pDNA (YOYO-1 labeled pDNA was prepared according to the instruction from Life Technologies) was loaded onto different gene carriers (chitosan, L-PEI, SLICS-2 and FA-SLICS-2) at various charge ratios (N/P) of 10.0, 5.0, 10.0 and 10.0, respectively, to form polymer/pDNA polyplexes. Cells were incubated with polymer/pDNA polyplexes for another 4 h and then the polyplexes were removed by washing the cells with PBS three times before fixing with 4% formaldehyde. The cell membrane and nucleus were separately stained by 100 L of Alexa Fluor 594 (5.0 g/mL) and Hoechst 33258 (2 M) for 15 min at 37 ◦C. The cells were further washed with PBS three times and incubated with 500 L PBS, and kept at room temperature for further analysis. The fluorescence images were observed from a confocal laser scanning microscope (Leica Confocal 1P/FCS) equipped with a 405 nm diode laser for Hoechst33258, a 488 nm argon ion laser for YOYO-1 and a 561 diode laser for Alexa Fluor 594. The high magnification images were obtained with a 100× objective. Optical sections were averaged 4 times to reduce noise, and images were processed using the Leica Confocal software [22].

2.2.13. Gene transfection HeLa and HepG2 cells were seeded in 24-well plates and cultured in complete DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ◦C in a humidified incubator, in the presence of 5% CO2. After 24 h culturing, the confluent percentage of the cell culture cell culture reached 80%. The medium was replaced with fresh 200 L culture medium in the absence of FBS. Meanwhile, the polymer/pDNA polyplexes, which were prepared by incubating FASLICS or SLICS polymers and pDNA at various N/P ratios at room temperature for 20 min, were added to each well. After 6 h incubation, the cultured medium was replaced by 1 mL fresh complete culture medium with 10% FBS and the cells were further incubated for another 42 h [23].

2.2.14. GFP expression by fluorescent microscope and flow cytometry Green fluorescent protein (GFP) expression level can be evaluated by fluorescence microscopic analysis. Briefly, living cells were rinsed 3 times by 1× PBS and visualized in situ by the detection under an epi-fluorescence multi-photon microscope (Nikon) connected to a CCD camera (RS Photometrics). A band pass filter (BP 485/20) was chosen for excitation and a 520 nm long pass filter was used for emission as barrier filter in viewing emission. Digitalized photographs were stored and analyzed by using the Bio-Rad Radiance 2000MP visualizing system. The green fluorescence intensity was also detected directly by a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson), and the transfection efficiency was calculated by the percentage of positive cells, using non-transfection cells (mock cells) as the negative control. Briefly, cells were harvested from trypsin digestion after 42 h post-transfection. One million cells were washed with 2% FCS/PBS buffer, and centrifuged at 1000 rpm for 5 min. The cells were stained by propidium iodide (400 L, 0.5 g/mL) in 1× PBS. Approximately 1–2 × 104 cells were analyzed atthe rate of 200–600 cells per second. CellQuest3.3 software was used for data analysis [24].

2.2.15. Statistical analysis Data obtained from our experiments are represented as mean ± SE (standard error). Statistical analysis of the numerical variables was performed using a two-sample, two-tailed t-test. A value of p < 0.05 is considered to be significant [25]. 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2.8 อนุภาคขนาดและแคเธอรีนซีตาศักยภาพของ FA-SLICS/pDNA polyplexes ถูกวัดขนาดอนุภาคและแคเธอรีนซีตาศักยภาพของ polyplexes FA-SLICS/pDNA ที่แตกต่างกัน โดยมัลเวิร์น Zetasizer (มัลเวิร์น Inst. จำกัดสหราชอาณาจักร) ที่ pH 7.2 มี cuvette ใสสี่ด้านหรือเซลล์ ZET 5104 ที่อุณหภูมิห้อง [16] ความเข้มข้นของ pDNA ถูกเก็บไว้ที่ 5 g/mL สำหรับ polyplexes เหล่านี้ สำหรับการวิเคราะห์ขนาดอนุภาค มีใช้วิธี cumulant การแปลงฟังก์ชัน autocorrelation ความเข้ม – ความเข้มขนาดอนุภาคชัดเจนตามความสัมพันธ์ของสโตกส์ – ไอน์สไตน์ [17] รุ่น Smuloschowski ที่ใช้แปลงเคลื่อน electrophoresis เป็นซีตา ทำสิบขนานถูกดำเนินการสำหรับแต่ละการประเมิน และข้อมูลสุดท้ายที่ได้จากการวิเคราะห์ทางสถิติ 2.2.9 Ethidium โบรไมด์ (EtBr) แยก assays แน่น pDNA ถูกวัด โดยวิธีการแยก EtBr [18] สั้น ๆ pDNA 4 g ถูกผสม มีจำนวนเพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ ของ FA SLICS ปริมาตรสุดท้ายของ L 280 ที่ 58 B. Shi et al. / b:พื้นผิวและคอลลอยด์ pH 7.2 และอัตราส่วน N/P แตกต่างกันของ Biointerfaces 119 (2014) 55-65 หลังจากฟักตัวในอุณหภูมิห้อง 30 นาที 20 L เป็น 0.1 mg/mL EtBr โซลูชั่นถูกเพิ่มลงในโซลูชันของพอลิ เมอร์/pDNA polyplexes และผสม intensively Fluorescence ถูกบันทึกโดยใช้เครื่องอ่านแผ่น fluorescence (LS 50 B Perkin-Elmer, Rodgau Jugesheim เยอรมนี) ที่ 518 nm ในการกระตุ้นและความยาวคลื่นที่ปล่อยก๊าซ nm 605 ผลการวิเคราะห์ได้แสดงเป็นญาติ fluorescence ความเข้มค่า ที่ 1 แทน fluorescence เอ็นเปลือย มี EtBr และไม่ มี polycation และ 0 แทน fluorescence ที่เหลือของ nonintercalating EtBr 2.2.10 pDNA ปล่อย ex vivo polyplexes FA-SLICS/pDNA ที่เตรียมไว้ในอัตราส่วน N/P 5, 10 และ 20 ถูก incubated ที่ 37 ◦C กับ DMEM ที่ pH 7.2 สำหรับ 30 นาที การแก้ปัญหา pHs polyplexes FA-SLICS/pDNA ได้ปรับปรุง การ 7, 6 5 ตามลำดับ ที่แต่ละค่า pH การระงับซับซ้อนถูก centrifuged ที่ 20000 × g ใน 30 นาที และ supernatant ถูก quantified เนื้อหา pDNA โดย spectrofluorimetry หลังจากการเพิ่มอย่างไร Hoechst 33258 (20 L, 1 mmol/L) [19] 2.2.11. cytotoxicity มะเร็ง (HeLa และ HepG2) และเซลล์ปกติ (ช่อ) มีอ่างใน DMEM ให้มาพร้อมกับ 10% FBS ในแผ่นดี 96 (200 L/ดี) ที่ความหนาแน่นเซลล์ของ 1.0 × 105 เซลล์/mL หลังจาก inoculation เซลล์ได้รับอนุญาตไปค้างคืนที่ ◦C 37 ในบรรยากาศที่ประกอบด้วย CO2 5% humidified เชื้อถูกแทนที่ ด้วย 200 L สดปานกลางมี FA SLICS โพลิเมอร์ที่ความเข้มข้นสุดท้าย ของ 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 g/mL เซลล์ได้แล้ว incubated ใน 24 – 72 h ก่อน L 10 ของ MTT (5.0 mg/mL ใน PBS) เพิ่มไปด้วยการวัดเซลล์ชีวิต [20] หลังจาก incubating สำหรับ h อีก 4 ที่ 37 ◦C ปานกลางเจริญเติบโตถูกแทนที่ ด้วย L 150 ของ dimethyl sulfoxide (DMSO) ให้ solubilization สมบูรณ์ของผลึก formazan รูปแบบ สุดท้าย absorbance ที่กำหนดโดยใช้เครื่องอ่าน Microplate Biotek (Biotek สหรัฐอเมริกา) ที่ความยาวคลื่นของ 570 nm [21] 2.2.12 intracellular ดูดซับ โดยเลเซอร์ confocal สแกนเซลล์ HeLa และ HepG2 ของ microscopy (CLSM) ที่ความเข้มข้น 2 × 105 เซลล์/ดีมีอ่างในดี 6 แผ่นรองแก้วฝาสไลด์สำหรับ 24 h. 4 g โยโย-1 ชื่อ pDNA (โยโย-1 ชื่อ pDNA ถูกจัดทำตามคำแนะนำจากเทคโนโลยีชีวิต) ถูกโหลดลงในยีนต่าง ๆ สายการบิน (ไคโตซาน พีอี ไอ L, SLICS-2 และ FA-SLICS-2) ที่ต่าง ๆ ค่าธรรมเนียมอัตรา (N/P) 10.0 , 10.0, 5.0 และ 10.0 ตามลำดับ การ polyplexes แบบฟอร์ม เมอร์/pDNA เซลล์มี incubated กับ polyplexes พอลิ เมอร์/pDNA สำหรับ 4 h อีกแล้ว polyplexes ถูกเอาออก โดยการล้างเซลล์ ด้วย PBS 3 ครั้งก่อนทำการซ่อมกับฟอร์มาลดีไฮด์ 4% เยื่อหุ้มเซลล์และนิวเคลียสถูกแยกสี โดย L 100 594 Fluor Alexa (5.0 g/mL) และอย่างไร Hoechst 33258 (2 เมตร) ใน 15 นาทีที่ 37 ◦C เซลล์ถูกเพิ่มเติมล้าง ด้วย PBS 3 ครั้ง incubated กับ PBS 500 L และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม ภาพ fluorescence สุภัคจากเลเซอร์ confocal สแกนกล้องจุลทรรศน์ (P Confocal ไล 1 FCS) พร้อมเลเซอร์ไดโอด 405 nm สำหรับ Hoechst33258, 488 nm อาร์กอนเลเซอร์ไอออน 1 โยโยและเลเซอร์ไดโอด 561 สำหรับ Alexa Fluor 594 ภาพสูง ๆ ได้รับกับวัตถุประสงค์ซื้อ 100 ส่วนแสงที่ averaged 4 ครั้งเพื่อลดเสียงรบกวน และภาพที่ถูกประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ไล Confocal [22] 2.2.13 ยีน transfection HeLa และเซลล์ HepG2 seeded ในดี 24 แผ่น และอ่างใน DMEM สมบูรณ์เสริม ด้วย serum วัว 10% และทารกในครรภ์ (FBS) ที่ 37 ◦C ใน incubator ที่ humidified ในต่อหน้าของ 5% CO2 หลังจาก 24 ชม culturing เปอร์เซ็นต์ confluent วัฒนธรรมเซลล์วัฒนธรรมเซลล์ถึง 80% สื่อถูกแทนที่ ด้วยสื่อวัฒนธรรม 200 L สดของ FBS ในขณะเดียวกัน มีเพิ่ม polyplexes พอลิ เมอร์/pDNA ซึ่งถูกจัดทำ โดย incubating โพลิเมอร์ FASLICS หรือ SLICS และ pDNA ในอัตราส่วน N/P ต่าง ๆ ที่อุณหภูมิห้องสำหรับ 20 นาที ให้ดีละกัน หลังจากฟักตัว 6 h กลางอ่างถูกแทนที่ ด้วย 1 mL สดสมบูรณ์วัฒนธรรมกลาง 10% FBS และเซลล์ได้ต่อไป incubated สำหรับ h 42 อีก [23] 2.2.14 สามารถประเมินนิพจน์ GFP เรืองแสงกล้องจุลทรรศน์และกระแสเซลล์โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) นิพจน์ระดับ โดย fluorescence วิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ สั้น ๆ เซลล์ชีวิตมี rinsed 3 ครั้ง โดย 1 ราย PBS และ visualized ใน situ โดยตรวจภายใต้การ epi fluorescence โฟตอนหลายกล้องจุลทรรศน์ (Nikon) เชื่อมต่อกับกล้อง CCD (RS Photometrics) ตัวกรองผ่านแถบ (485 BP 20) ถูกเลือกในการกระตุ้น และกรองผ่านยาว 520 nm ใช้สำหรับเป็นกรองอุปสรรคในการดูมลพิษที่ปล่อยก๊าซ ภาพถ่ายดิจิทัลถูกเก็บ และวิเคราะห์โดยระบบ visualizing 2000MP ใส Bio Rad ยังพบ fluorescence สีเขียวความเข้มได้โดยตรง โดย cytometer เป็นกระแส FACSCalibur (สัน Becton), และประสิทธิภาพ transfection คำนวณตามเปอร์เซ็นต์ของค่าบวกเซลล์ ใช้ transfection ไม่ใช่เซลล์ (เซลล์จำลอง) เป็นตัวควบคุมลบ สั้น ๆ เซลล์เก็บเกี่ยวจากทริปซินย่อยอาหารหลัง 42 h หลัง transfection หนึ่งล้านเซลล์ถูกล้าง ด้วยบัฟเฟอร์ FCS/PBS 2% และ centrifuged ที่ 1000 rpm สำหรับ 5 นาที เซลล์มีสี โดย propidium ไอโอไดด์ (400 L, 0.5 g/mL) ใน 1 × PBS ประมาณ 1 – 2 × 104 เซลล์ถูกวิเคราะห์ในอัตรา 200 – 600 เซลล์ต่อวินาที ซอฟต์แวร์ CellQuest3.3 ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล [24] 2.2.15 การทางสถิติวิเคราะห์ข้อมูลที่ได้จากการทดลองของเราจะแสดงเป็นเฉลี่ย± SE (มาตรฐานข้อผิดพลาด) วิเคราะห์ทางสถิติของตัวแปรเป็นตัวเลขที่ดำเนินการโดยใช้ t-ทดสอบตัว อย่าง 2 สองด้าน ค่าของ p < 0.05 ถือเป็นสำคัญ [25] 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2.8 ขนาดอนุภาคและศักยภาพซีตาของ FA-SLICS / pDNA polyplexes ขนาดอนุภาคและศักยภาพซีตาที่แตกต่างกัน FA-SLICS / pDNA polyplexes ถูกวัดโดยเวิร์น Zetasizer (เวิร์น Inst. จำกัด สหราชอาณาจักร) ที่พีเอช 7.2 พร้อมกับสี่ ด้าน cuvette ชัดเจนหรือ ZET 5104 มือถือที่อุณหภูมิห้อง [16] ความเข้มข้นของ pDNA ถูกเก็บไว้ที่ 5 กรัม / มิลลิลิตรสำหรับ polyplexes เหล่านี้ สำหรับการวิเคราะห์ขนาดอนุภาควิธี cumulant ถูกใช้ในการแปลงฟังก์ชั่นอัตเข้มเข้มให้มีขนาดอนุภาคที่ชัดเจนตามความสัมพันธ์ Stokes-Einstein [17] รูปแบบ Smuloschowski ถูกใช้ในการแปลงความคล่องตัวอิศักยภาพซีตา สิบวิ่งขนานได้ดำเนินการในการวัดแต่ละคนและข้อมูลสุดท้ายที่ได้รับขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์ทางสถิติ. 2.2.9 โบรไมด์ ethidium (EtBr) การยกเว้นการตรวจหยดน้ำ pDNA วัดโดยวิธีการยกเว้น EtBr [18] สั้น ๆ 4 กรัม pDNA ผสมกับจำนวนเงินที่เพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ ของ FA-SLICS ปริมาณสุดท้ายของ 280 L ที่ 58 บีชิเอตอัล / คอลลอยด์และพื้นผิว B: Biointerfaces 119 (2014) 55-65 ที่แตกต่างกันยังไม่มีข้อความ / อัตราส่วน P และพีเอช 7.2 หลังจากการบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 20 ลิตร 0.1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรวิธีการแก้ปัญหา EtBr ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อแก้ปัญหาของพอลิเมอ / pDNA polyplexes และผสมอย่างหนาแน่น เรืองแสงได้รับการบันทึกโดยใช้เครื่องอ่านแผ่นเรืองแสง (LS 50 B; เพอร์กินเอลเมอ, Rodgau-Jugesheim, เยอรมนี) ที่ 518 นาโนเมตรกระตุ้นและ 605 นาโนเมตรความยาวคลื่นที่ปล่อยก๊าซเรือนกระจก ผลการวิเคราะห์ถูกนำเสนอเป็นค่าความเข้มแสงญาติที่ 1 แสดงให้เห็นถึงการเรืองแสงของดีเอ็นเอที่มี EtBr เปลือยกายและไม่พอลิและ 0 แสดงให้เห็นถึงการเรืองแสงที่เหลืออยู่ของ nonintercalating EtBr. 2.2.10 pDNA ปล่อย ex vivo เอฟเอคั-SLICS / pDNA polyplexes เตรียมที่ไม่มีอัตราส่วน P / 5, 10, และ 20 ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cกับ DMEM ที่ 7.2 ค่าความเป็นกรดเป็นเวลา 30 นาที แก้ปัญหาของพีเอชเอฟเอ-SLICS / pDNA polyplexes มีการปรับถึง 7, 6 และ 5 ตามลำดับ ที่ pH แต่ละจังหวะที่ซับซ้อนได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 20,000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาทีและใสถูกวัดสำหรับเนื้อหา pDNA โดย spectrofluorimetry หลังจากที่นอกเหนือจาก Hoechst 33258 (ที่ 20 ลิตร 1 มิลลิโมล / ลิตร) [19]. 2.2.11 พิษเซลล์มะเร็ง (HeLa และ HepG2) และเซลล์ปกติ (CHO) มีการเพาะเลี้ยงในอาหาร DMEM มาพร้อมกับ 10% FBS ในแผ่น 96 หลุม (200 L / กัน) ที่มีความหนาแน่นของเซลล์ 1.0 × 105 เซลล์ / มิลลิลิตร หลังจากฉีดวัคซีนเซลล์ที่ได้รับอนุญาตให้เป็นไปตามค้างคืนที่ 37 ◦Cความชื้นในบรรยากาศ CO2 ที่มี 5% การเจริญเติบโตของกลางถูกแทนที่ด้วย 200 L สดขนาดกลางที่มีโพลีเมอ FA-SLICS ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, และ 50 กรัม / มิลลิลิตร เซลล์ที่ถูกบ่มแล้ว 24-72 ชั่วโมงก่อนที่จะ 10 ลิตร MTT (5.0 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส) ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละที่ดีที่จะวัดความมีชีวิตเซลล์ [20] หลังจากฟักอีก 4 ชั่วโมงที่ 37 ◦Cกลางการเจริญเติบโตก็ถูกแทนที่ด้วย 150 ลิตร dimethyl sulfoxide (DMSO) เพื่อให้แน่ใจว่าการละลายที่สมบูรณ์ของผลึกที่เกิดขึ้น formazan ในที่สุดการดูดกลืนแสงที่ถูกกำหนดโดยใช้ Biotek อ่านไมโคร (Biotek สหรัฐอเมริกา) ที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตร [21]. 2.2.12 การดูดซึมในเซลล์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ confocal เลเซอร์สแกน (CLSM) HeLa และเซลล์ HepG2 ที่ความเข้มข้น 2 × 105 เซลล์ / ดีมาเลี้ยงในจานเดียว 6 เต็มไปด้วยสไลด์ฝาครอบแก้วเป็นเวลา 24 ชั่วโมง 4 กรัม YOYO-1 ที่มีข้อความ pDNA (YOYO-1 ที่มีข้อความ pDNA ถูกจัดทำขึ้นตามคำสั่งจากชีวิตเทคโนโลยี) ถูกโหลดไปยังผู้ให้บริการของยีนที่แตกต่างกัน (ไคโตซาน, L-PEI, SLICS-2 และ FA-SLICS-2) ที่อัตราส่วนค่าใช้จ่ายต่างๆ (ยังไม่มีข้อความ / P) 10.0, 5.0, 10.0 และ 10.0 ตามลำดับในรูปแบบลิเมอร์ / pDNA polyplexes เซลล์ที่ถูกบ่มกับลิเมอร์ / pDNA polyplexes อีก 4 ชั่วโมงแล้ว polyplexes ถูกถอดออกโดยการล้างเซลล์ที่มีพีบีเอสสามครั้งก่อนที่จะแก้ไขด้วยดีไฮด์ 4% เยื่อหุ้มนิวเคลียสของเซลล์และมีการย้อมโดยแยก 100 ลิตร Alexa Fluor 594 (5.0 กรัม / มิลลิลิตร) และ Hoechst 33258 (2 M) เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37 ◦C เซลล์ที่ถูกล้างต่อด้วยพีบีเอสสามครั้งและบ่ม 500 L พีบีเอสและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องสำหรับการวิเคราะห์ต่อ ภาพเรืองแสงถูกตั้งข้อสังเกตจากกล้องจุลทรรศน์ confocal เลเซอร์สแกน (Leica Confocal 1P / FCS) พร้อมกับ 405 นาโนเมตรเลเซอร์ไดโอดสำหรับ Hoechst33258, ไอออนอาร์กอน 488 นาโนเมตรเลเซอร์สำหรับ YOYO-1 และไดโอดเลเซอร์ 561 สำหรับ Alexa Fluor 594. สูง ขยายภาพที่ได้รับโดยมีวัตถุประสงค์× 100 ส่วนออปติคอลได้รับเฉลี่ย 4 ครั้งเพื่อลดเสียงรบกวนและภาพที่ถูกประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ Leica Confocal [22]. 2.2.13 ยีน transfection HeLa และเซลล์ HepG2 เมล็ดในแผ่น 24 หลุมและเพาะเลี้ยงใน DMEM สมบูรณ์เสริมด้วย 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) ที่ 37 ◦Cในศูนย์บ่มเพาะความชื้นในการปรากฏตัวของ CO2 5% หลังจาก 24 ชั่วโมงเพาะเลี้ยงร้อยละไหลมารวมกันของวัฒนธรรมการเพาะเลี้ยงเซลล์เซลล์ถึง 80% สื่อที่ถูกแทนที่ด้วยวัฒนธรรมสดขนาดกลาง 200 ลิตรในกรณีที่ไม่มี FBS ในขณะที่ลิเมอร์ / pDNA polyplexes ซึ่งถูกจัดทำขึ้นโดยฟัก FASLICS หรือโพลีเมอ SLICS และ pDNA ที่อัตราส่วนต่างๆไม่มีข้อความ / P ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาทีถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละดี หลังจากบ่ม 6 ชั่วโมงสื่อเลี้ยงก็ถูกแทนที่ด้วย 1 มิลลิลิตรกลางสดวัฒนธรรมที่สมบูรณ์แบบด้วย FBS 10% และเซลล์ถูกบ่มต่อไปอีก 42 ชั่วโมง [23]. 2.2.14 การแสดงออก GFP โดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและการไหลภูมิคุ้มกันโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) ระดับการแสดงออกสามารถประเมินโดยการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง สั้น ๆ , เซลล์ที่มีชีวิตได้รับการล้าง 3 ครั้งโดย 1 ×พีบีเอสและมองเห็นในแหล่งกำเนิดโดยการตรวจสอบภายใต้ EPI-เรืองแสงกล้องจุลทรรศน์หลายโฟตอน (Nikon) เชื่อมต่อกับกล้อง CCD (ที่อาร์เอส Photometrics) ผ่านวงกรอง (BP 485/20) เป็นทางเลือกสำหรับการกระตุ้นและ 520 นาโนเมตรยาวผ่านตัวกรองที่ใช้สำหรับการปล่อยก๊าซเรือนกระจกเป็นตัวกรองอุปสรรคในการดูการปล่อยก๊าซ การถ่ายภาพดิจิตอลที่ถูกจัดเก็บและวิเคราะห์โดยใช้ระบบการแสดงผล Bio-Rad Radiance 2000MP ความเข้มของแสงสีเขียวนอกจากนี้ยังตรวจพบโดยตรงจากการไหล cytometer FACSCalibur (Becton ดิกคินสัน) และประสิทธิภาพ transfection ถูกคำนวณจากอัตราร้อยละของเซลล์ในเชิงบวกโดยใช้เซลล์ที่ไม่ transfection (เซลล์จำลอง) ในขณะที่การควบคุมเชิงลบ สั้น ๆ เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวจากการย่อยอาหาร trypsin 42 ชั่วโมงหลังจากที่โพสต์ transfection หนึ่งล้านเซลล์ถูกล้างด้วย 2% บัฟเฟอร์ FCS / พีบีเอสและหมุนเหวี่ยงที่ 1,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที เซลล์มีการย้อมโดยไอโอไดด์ propidium (400 ลิตร, 0.5 กรัม / มิลลิลิตร) ใน 1 ×พีบีเอส ประมาณ 1-2 × 104 เซลล์วิเคราะห์ atthe อัตรา 200-600 เซลล์ต่อวินาที ซอฟแวร์ CellQuest3.3 ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล [24]. 2.2.15 ข้อมูลการวิเคราะห์ทางสถิติที่ได้จากการทดลองของเราจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SE (ข้อผิดพลาดมาตรฐาน) การวิเคราะห์ทางสถิติของตัวแปรตัวเลขที่ถูกดำเนินการโดยใช้สองตัวอย่างสองด้าน t-test ค่าของพี <0.05 ถือว่าเป็นที่สำคัญ [25] 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2.8 . ขนาดอนุภาคและซีตาศักยภาพของ fa-slics / pdna polyplexes อนุภาคขนาด และซีตาศักยภาพของ polyplexes fa-slics / pdna แตกต่างกันถูกวัดโดย Malvern เซตาไซเซอร์ ( Malvern สถาบันจำกัด สหราชอาณาจักร ) ที่ pH 7.2 พร้อมกับสี่เคลียร์คิวเวตต์ หรือ เซท 1 เซลล์ที่อุณหภูมิห้อง [ 16 ] ความเข้มข้นของ pdna ถูกเก็บไว้ที่ 5 g / ml polyplexes เหล่านี้ การวิเคราะห์ขนาดอนุภาควิธี cumulant ถูกใช้เพื่อแปลงความเข้มความเข้มและข้อมูลฟังก์ชั่นขนาดอนุภาคที่ปรากฏตามความสัมพันธ์ [ สโต–ไอน์สไตน์ 17 ] การ smuloschowski แบบใช้แปลงตัวอย่างวันนี้ซีตาศักยภาพ สิบคู่ขนาน พบว่าในแต่ละวัด และข้อมูลสุดท้ายที่ได้มาจากการวิเคราะห์ทางสถิติ

2.2.9 .ทิเดียมโบรไมด์ ( etbr ) ยกเว้นวิธีที่ pdna การควบแน่นเป็นวัดโดยวิธี etbr การยกเว้น [ 18 ] สั้น ๆ , pdna 4 กรัม ผสมกับ ค่อยๆ เพิ่มปริมาณของ fa-slics เป็นเล่มสุดท้ายของ 280 ลิตร 58 บ. ซือ et al . / คอลลอยด์และพื้นผิว B : biointerfaces 119 ( 2014 ) 55 - 65 ที่แตกต่างกัน n / p อัตราส่วนและ pH 7.2 . หลังจากบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 20 ล. 01 mg / ml ในสารละลาย etbr เพิ่มโซลูชั่นของพอลิเมอร์ / pdna polyplexes ผสมอย่างเข้มข้น การใช้แผ่นบันทึกการอ่าน ( มี 50 B ; เพอร์กินเอลเมอร์ jugesheim รอดเกา , เยอรมนี ) 518 nm ไทเทเนียมปล่อยความยาวคลื่น 605 nm . ผลการศึกษาที่ถูกนำเสนอเป็นญาติเรืองแสงเข้มค่าที่ 1 เป็นเรืองของเปลือยดีเอ็นเอกับ etbr และไม่มี polycation และ 0 หมายถึงการเรืองแสงของที่เหลือ nonintercalating etbr .

2.2.10 . pdna รุ่น EX ตัวที่ fa-slics / pdna polyplexes เตรียมไว้ที่ N / P เท่ากับ 5 , 10 และ 20 ถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสที่ pH 7.2 ◦ dmem เป็นเวลา 30 นาที โซลูชั่นที่ 5 ของ fa-slics / pdna polyplexes กำลังปรับ 7 , 6 และ 5ตามลำดับ ในแต่ละพีเอช ช่วงล่างที่เป็นระดับที่ 20 , 000 × G สำหรับ 30 นาทีและมีปริมาณสูง เพื่อ pdna เนื้อหาโดย spectrofluorimetry หลังจากเติม Hoechst 33258 ( 20 ลิตร 1 mmol / L ) [ 19 ] .


2.2.11 .ความเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็งและเซลล์ปกติถึงมะเร็งตับ ) และ ( โช ) เพาะเลี้ยงใน dmem ขนาดกลางมาพร้อมกับ 10% FBS ใน 96 ดีแผ่น ( 200 ลิตร ) ที่ความหนาแน่นเซลล์ 1.0 × 105 เซลล์ / มิลลิลิตรหลังการฉีดวัคซีน , เซลล์ให้ยึดติด ค้างคืนที่ 37 ◦ C ใน humidified 5% CO2 ที่มีบรรยากาศสื่อการเจริญเติบโตถูกแทนที่ด้วยอาหารที่มี fa-slics สด 200 ลิตรและที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 , 1 , 3 , 5 , 10 , 20 , 30 และ 50 กรัม / มล. เซลล์แล้วบ่มเป็นเวลา 24 และ 72 ชั่วโมงก่อน 10 ลิตรของ MTT ( 5.0 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรใน PBS ) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละอย่างดี วัดเซลล์ [ 20 ] หลังจากไข่อีก 4 ชั่วโมง 37 ◦ Cสื่อการเจริญเติบโตถูกแทนที่ด้วย 150 ลิตรเต๊ะ ( DMSO ) เพื่อให้แน่ใจว่าขณะที่สมบูรณ์ของรูปแบบเหลือเชื่อ . ในที่สุด ก็ตัดสินใจใช้ biotek นพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน biotek สหรัฐอเมริกา ) ที่ความยาวคลื่น 570 nm [ 21 ]

2.2.12 .การสแกนด้วยเลเซอร์เซลล์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ( clsm ) และเซลล์มะเร็งตับถึงความเข้มข้น 2 × 105 เซลล์ / ดีเพาะเลี้ยงในจาน 6-well โหลด ด้วยกระจกสไลด์ 24 ชั่วโมง ครอบคลุม 4 g yoyo-1 ป้าย pdna ( yoyo-1 ป้าย pdna เตรียมตามคำแนะนำจาก เทคโนโลยีกับชีวิต ) ถูกโหลดไปยังผู้ให้บริการยีนที่แตกต่างกัน ( ไคโตซาน l-pei , ,slics-2 fa-slics-2 ) และอัตราส่วนค่าใช้จ่ายต่างๆ ( N / P ) 10.0 , 5.0 และ 10.0 10.0 ตามลำดับในรูปพอลิเมอร์ / pdna polyplexes . เซลล์ที่ถูกบ่มด้วยพอลิเมอร์ / pdna polyplexes อีก 4 ชั่วโมง แล้ว polyplexes ถูกเอาออกโดยการล้างเซลล์กับ PBS 3 ครั้ง ก่อนการแก้ไขกับ 4% ฟอร์มาลดีไฮด์ เยื่อหุ้มเซลล์และนิวเคลียสถูกแยกคราบ 100 ลิตร Alexa Fluor 594 ( 50 กรัม / มิลลิลิตร ) และ Hoechst 33258 ( 2 เมตร ) สำหรับ 15 นาทีที่ 37 ◦ C เซลล์ได้ 3 ครั้ง และทำการล้างด้วย pbs 500 ลิตร พีบีเอส และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเพื่อการวิเคราะห์ต่อไป เรืองแสงได้ด้วยเลเซอร์ ภาพจากกล้องจุลทรรศน์ ( Leica ด้วย 1P / FCS ) พร้อมสำหรับ hoechst33258 405 นาโนเมตรเลเซอร์ไดโอด ,เป็นไอออนอาร์กอนเลเซอร์สำหรับ yoyo-1 488 นาโนเมตรและ 561 เลเซอร์ไดโอดสำหรับ Alexa Fluor 174 . ภาพที่ขยายสูงได้มีเป็น 100 × . แสงบางส่วนถูกเฉลี่ย 4 ครั้ง เพื่อลดเสียงและภาพที่ถูกประมวลผลที่ใช้ Leica ด้วยซอฟต์แวร์ [ 22 ]

2.2.13 .ยีนและเซลล์มะเร็งตับสำหรับ Hela ถูก seeded ในจานเพาะเลี้ยง dmem 24 ดีและสมบูรณ์เสริม 10% fetal bovine serum ( FBS ) ที่อุณหภูมิ 37 ◦ C ใน humidified incubator ในการแสดงตนของคาร์บอนไดออกไซด์ 5% หลังจากเพาะเลี้ยง 24 ชั่วโมงร้อยละกระจู๋กระจี๋ของเซลล์เซลล์ถึง 80% สื่อถูกแทนที่ด้วยสด 200 ลิตรสื่อวัฒนธรรมในการขาดงานของ FBS ในขณะเดียวกันพอลิเมอร์ / pdna polyplexes ซึ่งเตรียมโดยการแช่ faslics หรือ slics โพลิเมอร์ และที่ต่าง ๆ pdna N / P อัตราส่วนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที มีการเพิ่มแต่ละครั้งได้อีกด้วย หลังจาก 6 ชั่วโมงบ่ม , เพาะเลี้ยงขนาดกลางถูกแทนที่ด้วย 1 ml สดสมบูรณ์สื่อวัฒนธรรมกับ FBS 10 % และเซลล์ได้ บ่มอีก 42 H [ 23 ]

2.2.14 .การแสดงออกของ GFP โดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและการไหล ( โปรตีนเรืองแสงสีเขียว ( GFP ) ระดับการแสดงออกจะถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงด้วย สั้น ๆ เซลล์ที่มีชีวิตถูกล้าง 3 ครั้ง โดย 1 × PBS และภาพปรากฏการณ์ใน situ โดยการตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงหลายโฟตอน Adrenaline ( Nikon ) เชื่อมต่อกับกล้อง CCD ( RS photometrics )วงดนตรีที่ผ่านตัวกรอง ( BP 485 / 20 ) ถูกเลือกเพื่อความตื่นเต้นและ 520 nm นานผ่านกรองใช้สำหรับการกั้นกรองในการดูที่ค่า จบภาพที่ถูกเก็บไว้ และวิเคราะห์ข้อมูลโดย ใช้ไบโอ ราดครีม 2000mp แสดงผลระบบ ความเข้มฟลูออเรสเซนต์สีเขียวถูกตรวจพบโดยตรงโดยการใช้โมโน facscalibur ( เบคตอน Dickinson )และสำหรับประสิทธิภาพถูกคำนวณโดยจำนวนเซลล์ไม่บวก ใช้สำหรับเซลล์ ( เลียนแบบเซลล์ ) เป็นตัวควบคุมลบ สั้น ๆ , เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวจากการย่อยอาหารเอนไซม์หลัง 42 ชั่วโมงหลังค . หนึ่งล้านเซลล์มีการล้างด้วย 2% FCS / PBS buffer , ไฟฟ้าที่ 1000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีเซลล์ก็เปื้อน propidium ไอโอไดด์ ( 400 ล. 0.5 กรัมต่อมิลลิลิตร ) ใน 1 × PBSประมาณ 1 – 2 × 104 เซลล์มาวิเคราะห์ในอัตรา 200 – 600 เซลล์ต่อวินาที cellquest3.3 ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ข้อมูล [ 24 ]

2.2.15 . การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติที่ได้จากการทดลองของเราจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SE ( Standard error ) การวิเคราะห์ทางสถิติของตัวแปรเชิงตัวเลขแสดงโดยใช้กลุ่มตัวอย่าง 2 , สองหาง ) ค่า p < 005 ถือว่าสําคัญ [ 25 ] 3