RNA can be extracted from cells gro

RNA can be extracted from cells grown in culture or from
fresh tissue (Ref. 3). Before RNA extraction, cultured cells
should be pelleted and washed once in ice-cold phosphatebuffered saline; adherent cells should be washed in situ. The
cell pellet is lysed in ice-cold GTC buffer (4 M guanidinium
isothiocyanate, 25 mM sodium citrate pH 7.0, 0.5% Sarkosyl, and 0.1 M β-mercaptoethanol) using 100 µl GTC per
106 cells or 1 mg of tissue. Adherent cells can be lysed directly in the culture dish and removed by gentle scraping
with a rubber policeman. Freshly isolated tissue should be
homogenised directly in GTC solution. Shearing cell lysates
(from cultured cells) six times through a 21 gauge needle
will improve the RNA yield. To the lysate is added 0.1 volume of 2 M sodium acetate (pH 4.0), 1 volume of phenol and 0.3 volume of chloroform:isoamylalcohol (49:1),
in succession. The mixture should be vortexed after each
addition and for at least 10 seconds after the final step. The
emulsion is incubated on ice for 15 minutes and then centrifuged at 12,000 rpm (in a J2-21M/E (Beckman) centrifuge
or the equivalent) for 30 minutes at 4◦C. The aqueous (top)
phase is carefully removed, taking care not to touch the
interface, added to an equal volume of isopropanol, mixed
and precipitated at −20◦C for 2 hours. The crude RNA pellet
is recovered by centrifugation at 12,000 rpm for 20 minutes
at 4◦C, after which the supernatant is removed and the precipitate is resuspended in 0.3 × the initial starting volume
of GTC. An equal volume of isopropanol is added to this
resuspension and mixed well. Reprecipitation is at −20◦C
for 1 hour and the RNA pellet is recovered by centrifugation at 13,000 rpm for 20 minutes at 4◦C. The pellet is then
washed by resuspending in 75% ethanol and the RNA is recovered by centrifugation at 6000 rpm for 5 minutes at
4◦C. The isopropanol is carefully removed from the pellet,
which will appear ‘milky white’. The pellet can be dried
in air, or under a vacuum, but care must be taken not to
over dry; it should appear slightly opaque. The dried pellet
is resuspended in sterile distilled water and left on ice for
about five minutes, with occasional vortexing to help get
the RNA into solution. The resulting concentration of RNA
is determined by measuring the absorbance at 260 nm. The
ratio of A260:A280 should be >2.0 and an absorbance reading of 1.0 at 260 nm represents an RNA concentration of
40 µg/ml.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อาร์เอ็นเอสามารถถูกแยกจากเซลล์ที่เติบโต ในวัฒนธรรม หรือจากสดเนื้อเยื่อ (อ้างอิง 3) ก่อนแยกอาร์เอ็นเอ อ่างเซลล์ควรเป็นน้ำเกลือ pelleted และซักแล้วหนึ่งครั้งในฉ่ำ phosphatebuffered นฤมลเซลล์ควรจะล้างใน situ ที่เม็ดเซลล์เป็น lysed ในบัฟเฟอร์ GTC ฉ่ำ (guanidinium 4 Misothiocyanate, 25 มม.โซเดียมซิเตรต pH 7.0, 0.5% Sarkosyl และ 0.1 M β-mercaptoethanol) ใช้ 100 µl GTC ต่อ106 เซลล์หรือเนื้อเยื่อ 1 มก. นฤมลเซลล์สามารถ lysed ในจานวัฒนธรรม และเอาออก โดย scraping อ่อนโยนมีตำรวจยาง เนื้อเยื่อสดแยกควรhomogenised ในโซลูชัน GTC ตัดเซลล์ lysates(จากเซลล์อ่าง) 6 ครั้งผ่าน 21 การวัดเข็มจะปรับปรุงผลผลิตอาร์เอ็นเอ การที่ lysate เพิ่มปริมาตร 0.1 2 M โซเดียม acetate (pH 4.0), วาง 1 ปริมาณและปริมาตร 0.3 ของคลอโรฟอร์ม: isoamylalcohol (49:1),อย่างต่อเนื่อง ส่วนผสมควรจะ vortexed หลังจากแต่ละนอกจากนี้และอย่างน้อย 10 วินาทีหลังจากขั้นตอนสุดท้าย ที่อิมัลชันเป็น incubated บนน้ำแข็ง 15 นาที และ centrifuged แล้ว ที่ 12000 รอบต่อนาที (ในเครื่องหมุนเหวี่ยง J2-21M/E (Beckman)หรือเทียบเท่า) 30 นาทีที่ 4◦C อควี (ด้านบน)ขั้นตอนอย่างระมัดระวังเอาออก การดูแลไม่ให้สัมผัสอินเตอร์เฟซ เพิ่มปริมาตรการเท่ากันของ isopropanol ผสมและตะกอนที่ −20◦C 2 ชั่วโมง เม็ดอาร์เอ็นเอน้ำมันกู้ โดย centrifugation ที่ 12000 รอบต่อนาที 20 นาทีใน 4◦C ที่ supernatant ถูกเอาออก และ precipitate เป็น resuspended ใน 0.3 ×ปริมาตรเริ่มต้นของ GTC เพิ่มปริมาตรการเท่ากันของ isopropanol นี้resuspension ตะกอน และผสมกัน Reprecipitation เป็น −20◦C1 ชั่วโมงและเม็ดอาร์เอ็นเอจะกู้ โดย centrifugation ที่ 13000 rpm สำหรับ 20 นาทีที่ 4◦C เม็ดอยู่แล้วเครื่องซักผ้า โดย resuspending ในเอทานอล 75% และอาร์เอ็นเอที่ควบคุม โดย centrifugation ที่ 6000 rpm 5 นาทีที่4◦C. isopropanol ถูกเอาออกจากเม็ด ระมัดระวังซึ่งจะปรากฏ 'สีขาวน้ำนม' สามารถแห้งเม็ดอากาศ หรือภาย ใต้ สุญญากาศ แต่การดูแลต้องดำเนินการไม่กว่าแห้ง มันจะปรากฏทึบเล็กน้อย เม็ดแห้งresuspended ในน้ำกลั่นที่ฆ่าเชื้อ และทิ้งน้ำแข็งประมาณห้านาที กับ vortexing เป็นครั้งคราวเพื่อช่วยให้ได้รับอาร์เอ็นเอเป็นโซลูชั่น ความเข้มข้นผลของอาร์เอ็นเอกำหนด โดยการวัด absorbance ที่ 260 nm ที่อัตราส่วนของ A260:A280 ควร > การอ่าน absorbance ที่ 260 nm แสดงเป็นอาร์เอ็นเอเข้มข้น 1.0 และ 2.040 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง/มล.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

RNA
สามารถสกัดได้จากเซลล์ที่ปลูกในวัฒนธรรมหรือจากเนื้อเยื่อสด(Ref. 3) ก่อนที่จะสกัด RNA
เซลล์เพาะเลี้ยงควรจะเม็ดและล้างครั้งเดียวในน้ำเกลือphosphatebuffered เย็น; เซลล์สานุศิษย์ควรล้างในแหล่งกำเนิด
ตะกอนเซลล์ถูก lysed ในบัฟเฟอร์ GTC เย็น (4 M Guanidinium
isothiocyanate 25 มิลลิค่า pH โซเดียมซิเตรท 7.0, 0.5% Sarkosyl และ 0.1 M β-mercaptoethanol) โดยใช้ GTC 100 ไมโครลิตรต่อ
106 เซลล์หรือ 1 มิลลิกรัมของเนื้อเยื่อ เซลล์สานุศิษย์สามารถ lysed
โดยตรงในจานวัฒนธรรมและลบออกได้โดยการขูดอ่อนโยนกับตำรวจยาง สดเนื้อเยื่อที่แยกควรจะ
homogenised โดยตรงในการแก้ปัญหา GTC ตัด lysates เซลล์
(จากเซลล์เพาะเลี้ยง) หกครั้งผ่านเข็มวัด 21
จะช่วยเพิ่มผลผลิตอาร์เอ็นเอ เพื่อ lysate จะมีการเพิ่มปริมาณของ 0.1 M 2 โซเดียมอะซิเตท (pH 4.0) 1 ปริมาณของฟีนอลและ 0.3 ปริมาณของคลอโรฟอร์ม: isoamylalcohol (49: 1)
อย่างต่อเนื่อง ส่วนผสมที่ควรจะได้รับการ vortex
หลังจากแต่ละนอกจากนี้และอย่างน้อย10 วินาทีหลังจากที่ขั้นตอนสุดท้าย
อิมัลชันถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 15 นาทีและจากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาที (ใน J2-21M / E (Beckman)
แปะหรือเทียบเท่า) เป็นเวลา 30 นาทีที่4◦C น้ำ (บน)
ขั้นตอนจะถูกลบออกอย่างระมัดระวังดูแลไม่ให้สัมผัสกับอินเตอร์เฟซที่เพิ่มเข้ามาในปริมาณที่เท่ากันของ isopropanol ผสมและตกตะกอนที่-20◦C 2 ชั่วโมง เม็ดอาร์เอ็นเอน้ำมันดิบมีการกู้คืนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีที่4◦Cหลังจากที่ใสออกและตะกอนที่มีresuspended ใน 0.3 ×ปริมาณการเริ่มต้นครั้งแรกของGTC ปริมาณที่เท่ากันของ isopropanol จะถูกเพิ่มเข้าไปนี้ทับถมและการสลายเข้ากันดี Reprecipitation ที่-20◦Cเป็นเวลา1 ชั่วโมงและเม็ดอาร์เอ็นเอที่มีการกู้คืนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีที่4◦C เม็ดจากนั้นล้างด้วย resuspending ในเอทานอล 75% และ RNA มีการกู้คืนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 6000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีที่4◦C isopropanol จะถูกลบออกอย่างระมัดระวังจากเม็ด, ซึ่งจะปรากฏ 'สีขาว' เม็ดสามารถแห้งในอากาศหรือภายใต้สูญญากาศแต่ต้องระมัดระวังไม่ให้เกินแห้ง; มันควรจะปรากฏสีขาวขุ่นเล็กน้อย เม็ดแห้งถูก resuspended ในน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อและทิ้งไว้บนน้ำแข็งประมาณห้านาทีด้วยvortexing เป็นครั้งคราวจะช่วยให้อาร์เอ็นเอเข้าไปในการแก้ปัญหา ความเข้มข้นที่เกิดจากอาร์เอ็นเอจะถูกกำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร อัตราส่วนของ A260: A280 ควรจะ> 2.0 และการอ่านการดูดกลืนแสง 1.0 ที่ 260 นาโนเมตรแสดงให้เห็นถึงความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอของ40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ซึ่งสามารถสกัดได้จากเซลล์เพาะจากเนื้อเยื่อสด (
) 3 ) ก่อนการสกัด DNA เพาะเลี้ยงเซลล์ ,
ควรอัดเม็ด และล้างอีกครั้งในเย็น phosphatebuffered ดินเค็ม พลพรรคเซลล์ควรล้างในแหล่งกำเนิด
เซลล์เม็ด เป็น lysed ในเย็น GTC บัฟเฟอร์ ( 4 M guanidinium
isothiocyanate , ซิเตรตโซเดียม 25 มม. pH 7.0 , sarkosyl 0.5 % และ 01 M บีตา - mercaptoethanol ) ใช้ 100 L
µ GTC ต่อ 106 หรือ 1 มิลลิกรัมของ เซลล์เนื้อเยื่อ พลพรรคเซลล์สามารถ lysed โดยตรงในวัฒนธรรมอาหารและลบออกโดยอ่อนโยนขูด
ยางกับตำรวจ สดแยกเนื้อเยื่อควร
homogenised GTC โดยตรงในการแก้ปัญหา ตัดเซลล์ lysates
( จากการเพาะเซลล์ ) 6 ครั้ง ผ่าน 21 เข็มวัด
จะปรับปรุงประสิทธิภาพผลผลิต การ lysate เป็น 01 เล่ม 2 ม. โซเดียมอะซิเตต ( pH 4.0 ) , 1 ปริมาณของฟีนอลและ 0.3 ปริมาณคลอโรฟอร์ม : isoamylalcohol ( 49:1 ) ,
ในการทดแทน ส่วนผสมควรจะ vortexed หลังจากที่แต่ละ
เพิ่มอย่างน้อย 10 วินาทีหลังจากขั้นตอนสุดท้าย
อิมัลชันคือบ่มแข็งเป็นเวลา 15 นาที และระดับที่ 12 , 000 รอบต่อนาที ( ใน j2-21m / E ( แบคแมน
) หรือเทียบเท่า ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ◦ Cละลายน้ำ ( บน )
เฟสลบออกอย่างระมัดระวัง ระวังอย่าให้สัมผัส
interface เพิ่มปริมาณเท่ากันของไอโซโพรพานอล ผสมและตกตะกอน
ที่ 20 −◦ C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง สกัด RNA เม็ด
ได้โดยการเหวี่ยงแยกที่ 8 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาที
ที่ 4 ◦ C หลังจากที่นำออกและทำให้การ resuspended ใน 0.3 ×เริ่มต้นการเริ่มต้นปริมาณ
ของ GTC .ปริมาณเท่ากันของไอโซโพรพานอลเพิ่มนี้
resuspension และผสมดี reprecipitation เป็น− 20 ◦ C
1 ชั่วโมงและ RNA เม็ดได้โดยการเหวี่ยงแยกที่ 10 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ◦ C เม็ดอยู่แล้ว
ล้างโดยเจริญในเอทานอล 75% และ RNA ได้โดยการเหวี่ยงแยกที่ 6 , 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที ที่◦
4 C . ไอโซโพรพานอลถูกลบออกอย่างระมัดระวัง
จากเม็ดซึ่งจะปรากฏคราบขาว ' ' เม็ดสามารถแห้ง
ในอากาศ หรือภายใต้สุญญากาศ แต่ต้องระวังไม่ให้
แห้งเกินไป มันควรจะปรากฏขึ้นเล็กน้อยที่ทึบแสง แห้งเป็นเม็ด
resuspended เป็นหมันในน้ำกลั่นและซ้ายบนน้ำแข็ง
ประมาณห้านาที กับ vortexing เป็นครั้งคราวเพื่อช่วยให้ได้รับ
rna ในสารละลาย ส่งผลให้ปริมาณ RNA
จะถูกกำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร
อัตราส่วนของ a260 : a280 ควรจะ > 2.0 และค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตร อ่าน สำหรับเป็นอาร์เอ็นเอ ความเข้มข้นของµ
40 g / ml