DNA isolation and transcriptome ana

DNA isolation and transcriptome analysis. Transcriptome analysis was performed in duplicate immediately before (t = 0) and after exposure to 8% (volwol) ethanol in MRS for 10 min, 30 min, and 24 h. RNA extraction, reverse transcription, labeling, hybridization, and data analysis were performed a described previously (41). In short, following quenching, RNA was phenol-chloroform extracted and purified using the High Pure RNA isolation kit (Ruche Diagnostics, Mannheim Germany). The quality of the RNA obtained was measured with the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies. Waldbronn. Germany) using the Agilent RNA 6000 Nano kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) and samples with a 23S/16S RNA ratio equal to or higher than 1.6 were taken for cDNA synthesis, cDNA was synthesized using the Superscript TMIIl reverse transcriptase (RT) enzyme (Invitrogen, Carlsbad, CA), purified with the CyScribe GFX purification kit (GE Healthcare, Buckinghamshire. United Kingdom), and labeled differentially using cyanine 3 or cyanine 5 labels (Amersham: Dyc postlabeling reactive dye pack: GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom After a second purification with the CySeribe GFX purification kit (GE Healthcare. Buckinghamshire, United Kingdom), L. plantarum WCFSL cDNA was hybridized to oligonucleotide DNA microarrays for this strain (Agi- lent Technologies, Santa Clara, CA). L. plantarum WCFS1 DNA microarrays were hybridized according to a modified loop design which included comparisons of all conditions within three steps (see Fig. S1 in the supplemental material The transcript data w tormalized by local fitting of an M-A plul applying the Loess algorithm (63), using the Limma package (48) in R (http://www.R-project org) as previously described (41), and genes with false discovery rate(FDR)- adjusted P values less than 0.05 were considered to be significantly differently expressed. To analyze the results, heat maps of gene expression levels were constructed for the transcript profiles using the Genesis platform (54). Blastn analysis was performed using http://hlast.nebi.nlm.nih.gov/Blast.egi.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์แยกและ transcriptome ดีเอ็นเอ Transcriptome วิเคราะห์ทำสำเนาทันทีก่อน (t = 0) และหลังจากสัมผัสกับเอทานอล 8% (volwol) ใน MRS สำหรับ 10 นาที 30 นาที และสกัด 24 h. RNA ย้อนกลับถอด ฉลาก hybridization และการ วิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (41) ในระยะสั้น ต่อชุบ อาร์เอ็นเอเป็นฟีนอลคลอโรฟอร์มสกัด และบริสุทธิ์โดยใช้ชุดแยกอาร์เอ็นเอบริสุทธิ์สูง (Ruche วินิจฉัย มานไฮม์เยอรมนี) คุณภาพของอาร์เอ็นเอได้ถูกวัด ด้วย Bioanalyzer 2100 (Agilent เทคโนโลยี Waldbronn เยอรมนี) ใช้ชุดนาโน Agilent RNA 6000 (Agilent เทคโนโลยี ซานตาคลารา CA) และตัวอย่าง 23S/16S RNA อัตราส่วนเท่ากับ หรือสูงกว่า 1.6 ถ่ายสำหรับการสังเคราะห์ cDNA, cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้การ TMIIl ตัวยกปเทส (RT) เอนไซม์ (Invitrogen คาร์ลบาด CA), บริสุทธิ์กับชุดฟอก CyScribe GFX (GE สุขภาพ บักกิงแฮมเชอร์ สหราชอาณาจักร), และระบุว่างูใช้ cyanine 3 หรือ cyanine 5 ป้าย (Amersham: Dyc postlabeling ปฏิกิริยาย้อมชุด: ดูแลสุขภาพ GE บักกิงแฮมเชอร์ สหราชอาณาจักรหลังจากฟอกที่สองด้วยชุดฟอก CySeribe GFX (GE สุขภาพ บักกิงแฮมเชอร์ สหราชอาณาจักร), L. บาซิลลัส WCFSL cDNA ถูกไฮบริดเพื่อ oligonucleotide microarrays DNA สำหรับสายพันธุ์นี้ (Agi - ยืมเทคโนโลยี ซานตาคลารา CA) L. บาซิลลัส WCFS1 DNA microarrays ถูกไฮบริดตามแบบห่วงแก้ไขซึ่งเงื่อนไขทั้งหมดภายใน 3 ขั้นตอน (ดูรูปเปรียบเทียบ S1 ใน tormalized วัสดุเสริม w เสียงบรรยายข้อมูลโดยเฉพาะของ plul M A การใช้อัลกอริธึมดินเหลือง (63), โดยใช้แพคเกจ Limma (48) ใน R (http://www.R-project องค์กร) ตามที่เคยอธิบายไว้ (41), และพิจารณาว่ายีนกับค้นพบ false rate(FDR) ปรับ P ค่าน้อยกว่า 0.05 อย่างมีนัยสำคัญแตกต่างกันแสดง การวิเคราะห์ผล ความร้อนแผนที่แสดงออกของยีนระดับถูกสร้างขึ้นสำหรับโปรไฟล์เสียงบรรยายที่ใช้แพลตฟอร์มปฐมกาล (54) Blastn วิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ http://hlast.nebi.nlm.nih.gov/Blast.egi

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกดีเอ็นเอและการวิเคราะห์ยีน การวิเคราะห์ยีนที่ได้ดำเนินการในทันทีก่อนที่จะซ้ำกัน (t = 0) และหลังจากที่สัมผัสกับ 8% (volwol) เอทานอลใน MRS เป็นเวลา 10 นาที, 30 นาทีและ 24 ชั่วโมง สกัด RNA ถอดความย้อนกลับการติดฉลากการผสมพันธุ์และการวิเคราะห์ข้อมูลที่ได้ดำเนินการอธิบายไว้ก่อนหน้า (41) ในระยะสั้นดับต่อไปนี้เป็นอาร์เอ็นเอฟีนอลคลอโรฟอร์มสกัดโดยใช้ชุด RNA แยกบริสุทธิ์สูง (Ruche วินิจฉัย Mannheim เยอรมนี) คุณภาพของ RNA ที่ได้รับการวัดที่มี 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies. Waldbronn. เยอรมนี) โดยใช้ชุด Agilent RNA 6000 นาโน (Agilent Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย) และกลุ่มตัวอย่างที่มีอัตราส่วน 23S / 16S RNA เท่ากับหรือสูงกว่า 1.6 ถูกนำสำหรับการสังเคราะห์ยีน, ยีนสังเคราะห์ใช้ยก TMIIl transcriptase ย้อนกลับ (RT) เอนไซม์ (Invitrogen, Carlsbad, CA) บริสุทธิ์กับชุดฟอก CyScribe GFX (GE Healthcare, Buckinghamshire. สหราชอาณาจักร) และติดป้ายที่แตกต่างกันโดยใช้ cyanine 3 หรือ 5 cyanine ป้าย (Amersham: DYC postlabeling แพ็คสีย้อม:. GE Healthcare, Buckinghamshire, สหราชอาณาจักรหลังจากที่บริสุทธิ์ที่สองกับการทำให้บริสุทธิ์ชุด CySeribe GFX (GE Healthcare Buckinghamshire, สหราชอาณาจักร), L. plantarum WCFSL cDNA ถูกไฮบริดที่จะ oligonucleotide ดีเอ็นเอ microarrays สำหรับสายพันธุ์นี้ (Agi- ยืม Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย). L. plantarum WCFS1 ดีเอ็นเอ microarrays ถูกไฮบริดตามการออกแบบห่วงการแก้ไขซึ่งรวมถึงการเปรียบเทียบของเงื่อนไขทั้งหมดที่อยู่ในขั้นตอนที่สาม (ดูรูป S1 ในวัสดุเสริมข้อมูลหลักฐาน W tormalized โดยการปรับท้องถิ่นของ plul MA ใช้อัลกอริทึมเหลือง (63) โดยใช้แพคเกจ Limma (48) ในการวิจัย (http: //www.R-project org) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 41) และยีนที่มีอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) - ปรับค่า P น้อยกว่า 0.05 ได้รับการพิจารณาที่จะแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญแสดง การวิเคราะห์ผลการค้นหาในแผนที่ความร้อนของระดับการแสดงออกของยีนที่ถูกสร้างขึ้นสำหรับโปรไฟล์หลักฐานที่ใช้แพลตฟอร์มปฐมกาล (54) การวิเคราะห์ดังกล่าวหาได้ดำเนินการโดยใช้ http://hlast.nebi.nlm.nih.gov/Blast.egi