3.2. Conformational changes of BSA

3.2. Conformational changes of BSA investigated by UV–vis
UV–vis absorption spectroscopy is a simple but effective method,
which is often applied to explore the structural changes of protein and ligand–protein complex formation. BSA has two main
absorption bands (Fig. 3). The strong absorption band at around
220 nm is mainly due to the peptide bond p ? p⁄ electronic
transitions of the peptide backbone (Scopes, 1974). The weak
absorption band around 280 nm is mainly attributed to the absorption
of tryptophan and tyrosine (Pace et al., 1995). The absorption
spectrum of BSA shows a hypochromic effect around 220 nm with
concomitant bathochromic shift as the concentration of chrysoidine
increased. The reason for this phenomenon is that the energy
required for p ? p⁄ transition decreased when the polar of the BSA
solution increased with increasing added chrysoidine concentration.
No detectable change was observed in BSA absorption spectra
at around 280 nm in the presence of chrysoidine. The results indicate
that the binding of chrysoidine to BSA does not drastically
change the conformation of BSA.
3.3. Fluorescence quenching of BSA by chrysoidine
Three aromatic amino acid residues (tryptophan, tyrosine, and
phenylalanine) contribute to the intrinsic fluorescence of BSA.
When the excitation wavelength is set to 280 nm, the emission
fluorescence from BSA is dominated by tryptophan and tyrosine,
while when excitation is selected at 295 nm, it minimizes the
emission from tyrosine residues and is known to selectively excite
tryptophan residues (Prasad et al., 1986). As shown in
Fig. 4a, when the BSA was excited at 280 nm, the chrysoidine
quenched the fluorescence emission spectrum of BSA. BSA contains
2 tryptophan residues: Trp-134 in domain I and Trp-213
in domain II. Trp-213 is located in a hydrophobic binding pocket,
whereas Trp-134 is more exposed to solvent and it is located on
the surface of molecule (Mallick et al., 2005). The fluorescence
properties of tryptophan residues are exceptionally sensitive to
the local environment, making it an ideal choice for the detection
of conformational alterations in proteins (Lynch and
Dawson, 2008). Fig. 4b shows the fluorescence quenching of
BSA by chrysoidine when excitation was set to 295 nm. The
maximum emission wavelength of BSA had no significant shift
with the addition of chrysoidine, which suggested that chrysoidine
had a slight impact on the conformation of the protein
(Berger et al., 1998).
Synchronous fluorescence spectroscopy is a useful method for
the evaluation of protein conformational changes, which gives
the information about the microenvironments around the fluorophore
functional groups by simultaneous scanning of the excitation
and emission monochromators with a constant wavelength
interval. When the wavelength interval (Dk) is set to 60 nm or
15 nm, synchronous fluorescence spectra give the characteristic
information of tryptophan residues or tyrosine residues, respectively
(Liu and Liu, 2012). As seen in Fig. 4c and d, the intensity
of the synchronous fluorescence of BSA at Dk = 60 nm and
Dk = 15 nm progressively reduced with gradual addition of chrysoidine.
No obvious shift in the emission maximum upon quenching
was observed, indicating that the interaction of chrysoidine
with BSA does not perturb the polarity around these residues
significantly.
3.4. Fluorescence quenching mechanism
The mechanisms of fluorescence quenching are usually classi-
fied into dynamic quenching and static quenching (Xie et al.,
2010). During dynamic quenching, the quencher interacts with
the excited state of the fluorophore leading to a change of the fluorescence
lifetime. By contrast, during the static quenching, the formation
of ground-state complex between the fluorophores and the
quencher inhibits the excited state formation of the fluorophore,
without affecting the fluorescence lifetime (van de Weert and
Stella, 2011). Consequently, the most definitive method to distinguish
static and dynamic quenching is to measure the fluorescence
lifetimes in the presence and absence of quencher (Gauthier et al.,
1986). The data obtained from fluorescence lifetime experiments
were found to fit well to a single-exponential decay with a v2
values approached 1.00. The lifetime (s) of BSA was decreased from
6.20 to 5.08 ns with the increasing concentration of chrysoidine
(Table 2), indicating that the quenching mechanism was a dynamic
quenching. For the dynamic quenching, it often involves collisional
quenching, photoinduced electron transfer (PET), radiative energy
transfer and Förster resonance energy transfer (FRET), which do
not require a direct contact of the quencher with fluorophore. In
collisional quenching, higher temperatures result in faster diffusion,
and hence the quenching constants will increase with the
temperature. The fluorescence quenching data of chrysoidine-BSA
binding at different temperatures are analyzed by the Stern–Volmer
equation:
F0=F ¼ 1 þ KSV½Q ð2Þ
where F0 and F are the steady-state fluorescence intensities in
the absence and presence of quencher, respectively; Ksv is the
Stern–Volmer quenching constant; and [Q] is the concentration
of the quencher (chrysoidine). The Stern–Volmer plots are shown
in Fig. 5 and the Ksv values calculated from the Stern–Volmer equation
are presented in Table 3. The results show the Ksv values decrease
with increasing temperature, indicating that the
quenching is not initiated from collisions. Since the interactions
of chrysoidine with BSA induce no discernible change in the protein
(results obtained from UV–vis spectra experiments), and the
fluorescence emission spectrum of BSA overlaps with the UV
absorption spectrum of chrysoidine (see Fig. 6), we inferred that
the quenching of the BSA fluorescence caused by chrysoidine was
attributable to FRET. The reason why the fluorescence of BSA is
quenched to a greater extent at higher temperatures is due to
the chrysoidine-BSA diffusion during the excited-state lifetime.
Lakowicz also observed this phenomenon in the study of FRET
between TMA and TU2D (Lakowicz et al., 1994).
According to the Förster’s non-radiative energy transfer theory,
the parameters related to energy transfer can be calculated based
on the equation as follows:
where E is the efficiency of energy transfer; s0 and s are the relative
lifetimes of the donor, in the absence (s0) and presence (s) of
acceptor; r is the distance between the acceptor and the donor, R0
is the distance at which transfer efficiency equals 50%, which can
be calculated using the following equation:
R6
0 ¼ 8:79  1025K2
n4/J ð4Þ
where K2 is the spatial orientation factor of the dipole, n is the
refractive index of the medium, U is the fluorescence quantum yield
of the donor, and J is the overlap integral of the fluorescence emission
spectrum of the donor and the absorption spectrum of the
acceptor:
J ¼
R 1
0 FðkÞeðkÞk4
dk
R 1
0 FðkÞdk ð5Þ
where F(k) is the fluorescence intensity of the fluorescence donor at
wavelength k, and e(k) is the molar absorption coefficient of the
acceptor at wavelength k. It has been reported for BSA, that
K2 = 2/3, U = 0.15 and n = 1.36 (Deepa and Mishra, 2005; Kandagal
et al., 2006). Thus according to the above equations it is calculated
that J = 3.78  1014 cm3 L mol1
, R0 = 3.21 nm. Values of the r and
E corresponding to the different concentration of chrysoidine are
summarized in Table 4. With the concentration of chrysoidine
increasing, the Förster distance (r) reduces from 5.76 to 4.05, and
accompanied with the increase of transfer efficiency.
According to Förster’s theory, the distance between the acceptor
and donor should be smaller than 10 nm. r, the distance between
chrysoidine and Trp residues of BSA, is in the range of 4–6 nm
and 0.5R0 < r < 2R0, indicating the results are in accordance with
the conditions of FRET and the energy transfer from BSA to chrysoidine
occurs with high probability.
3.5. Conformational changes of BSA monitored by circular dichroism
spectroscopy
To gain a better understanding of the effects of chrysoidine on
the conformational change of BSA, CD spectroscopy were employed
in the present study. Far UV-CD studies revealed that there
were no significant changes in the ellipticity values at 208 or
222 nm, which is characteristic of an a-helical structure of the protein
(Xu et al., 2012; Zhao et al., 2009) (Fig. S1, Supplementary
material). Similarly, the content of secondary structural elements
in BSA was nearly unchanged with increasing the concentration
of chrysoidine (Table 5) indicated that the binding of chrysoidine
to BSA does not lead to an apparent alteration of the secondary
structure of BSA, which is consistent with the results from
UV–vis spectroscopy studies.
3.6. Molecular docking
To predict the binding sites of chrysoidine on BSA, molecular
docking simulations were run with Autodock program (version
4.2), which is available free of charge from The Scripps Research
Institute (http://autodock.scripps.edu/) (Morris et al., 1998). The
structure of chrysoidine was optimization using Gaussian 03 package.
During the docking simulation, 10 conformations were obtained
(Table S1, Supplementary material), and the lowest energy
solution structure of chrysoidine–BSA are shown in Fig. 7. Chrysoidine
binds to BSA at a cavity close to Sudlow site I in domain IIA,
where small organic compounds, including many drugs, were
found to bind to serum albumin (Perry et al., 2006; Saquib et al.,
2011). The distance between tryptophan (the donor) and chrysoidine
(the acceptor) obtained from the docking simulation is less
than 10 nm, which satisfied the condition of FRET (Gadella, 2009;Lakowicz, 2006) and verified the conclusion obtained from fluorescence
quenching analysis. Calculation of the binding energy from
docking simulations revealed that van der Waals and hydrogen
bonding interactions (chrysoidine with Arg 256) play a major role
in the binding of chrysoidine to BSA, in agreement wi

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2. การเปลี่ยนแปลงของบีเอสเอในการสอบสวน โดย UV – vis conformationalกดูดซึม UV – vis เป็นวิธีง่าย ๆ แต่มีประสิทธิภาพซึ่งมักจะใช้การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของโปรตีนและลิแกนด์ – โปรตีนก่อซับซ้อน บีเอสเอมีสองหลักวงดูดซึม (Fig. 3) แถบดูดซับแรงที่รอบ220 nm เป็นส่วนใหญ่เนื่องจากเพปไทด์ p p⁄ อิเล็กทรอนิกส์ช่วงการเปลี่ยนภาพของแกนหลักของเพปไทด์ (ขอบเขต 1974) อ่อนแอดูดซึมวงประมาณ 280 nm เป็นส่วนใหญ่เกิดจากการดูดซึมทริปโตเฟนและ tyrosine (ก้าวและ al., 1995) การดูดซึมสเปกตรัมของบีเอสเอแสดงผล hypochromic ประมาณ 220 nm มีbathochromic มั่นใจกะเป็นความเข้มข้นของ chrysoidineเพิ่มขึ้น สาเหตุของปรากฏการณ์นี้คือพลังงานต้องการ p เปลี่ยน p⁄ ลดลงเมื่อขั้วโลกบีเอสเอโซลูชันเพิ่มขึ้นกับความเข้มข้น chrysoidine เพิ่มมากขึ้นไม่เปลี่ยนแปลงสามารถถูกตรวจสอบในแรมสเป็คตราการดูดซึมของบีเอสเอที่ประมาณ 280 nm ในต่อหน้าของ chrysoidine ระบุผลลัพธ์ที่รวมของบีเอสเอ chrysoidine ไม่ไม่อย่างรวดเร็วเปลี่ยน conformation ของบีเอสเอ3.3. fluorescence ชุบของบีเอสเอ โดย chrysoidineตกค้างสามหอมกรดอะมิโน (tyrosine ทริปโตเฟน และphenylalanine) ช่วยการ fluorescence intrinsic ของบีเอสเอเมื่อการตั้งค่าความยาวคลื่นในการกระตุ้นเป็น 280 nm การปล่อยก๊าซfluorescence จากบีเอสเอที่ถูกครอบงำ ด้วยทริปโตเฟนและ tyrosineในขณะที่เมื่อเลือกในการกระตุ้นที่ 295 nm ลดการเล็ดรอดจากการตกค้างของ tyrosine และรู้จักเลือกที่จะกระตุ้นตกทริปโตเฟน (โกอี et al., 1986) ดังแสดงในFig. 4a เมื่อบีเอสเอที่ตื่นเต้นที่ 280 nm, chrysoidinequenched สเปกตรัมมลพิษ fluorescence ของบีเอสเอ บีเอสเอประกอบด้วยตกทริปโตเฟน 2: Trp-134 ในโดเมนผมและ Trp-213ในโดเมนที่สอง ห้อง Trp-213 hydrophobic ผูกกระเป๋าใน ขณะที่ Trp 134 มีสัมผัสกับตัวทำละลายอยู่ในพื้นผิวของโมเลกุล (Mallick et al., 2005) Fluorescence ที่คุณสมบัติของทริปโตเฟนตกมีล้ำความไวต่อสภาพแวดล้อมท้องถิ่น ทำให้ทางการตรวจพบของเปลี่ยนแปลง conformational ในโปรตีน (Lynch และดอว์สัน 2008) Fig. 4b แสดงชุบ fluorescence ของบีเอสเอ ด้วย chrysoidine เมื่อมีการตั้งค่าในการกระตุ้นเป็น 295 nm ที่ความยาวคลื่นปล่อยก๊าซสูงสุดของบีเอสเอมีกะไม่สำคัญแห่ง chrysoidine ที่แนะนำที่ chrysoidineมีผลกระทบเล็กน้อย conformation ของโปรตีน(เบอร์เกอร์และ al., 1998)ก fluorescence แบบซิงโครนัสจะเป็นเป็นการประเมินผลของโปรตีนเปลี่ยนแปลง conformational ซึ่งช่วยให้ข้อมูลเกี่ยวกับ microenvironments สถาน fluorophoreกลุ่ม functional โดยการสแกนในการกระตุ้นที่พร้อมmonochromators มลพิษกับความยาวคลื่นคงและช่วง เมื่อช่วงความยาวคลื่น (Dk) ถูกตั้งค่าเป็น 60 nm หรือ15 nm ซิงโครนัส fluorescence ลักษณะให้แรมสเป็คตราข้อมูลของทริปโตเฟนตกหรือตก tyrosine ตามลำดับ(เล่าแล้วเล่า 2012) เห็นใน Fig. 4c และ d ความรุนแรงfluorescence แบบซิงโครนัสของบีเอสเอที่ Dk = 60 nm และDk = 15 nm ความก้าวหน้าลดลง ด้วยสมดุลแห่ง chrysoidineปล่อยก๊าซสูงสุดเมื่อชุบกะไม่ชัดเจนสังเกต ที่บ่งชี้ว่า การโต้ตอบของ chrysoidineกับบีเอสเอไม่ perturb ขั้วรอบตกค้างเหล่านี้อย่างมีนัยสำคัญ3.4. fluorescence ชุบด้วยกลไกกลไกของการชุบ fluorescence มัก classi-ฟองเป็นการชุบแบบไดนามิกและการชุบคง (เจีย et al.,2010. ในระหว่างการชุบแบบไดนามิก quencher จะโต้ตอบกับรัฐ fluorophore ที่นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงของ fluorescence ที่ตื่นเต้นอายุการใช้งาน โดยคมชัด ในระหว่างคงชุบ การก่อตัวของเชิงล่างรัฐระหว่าง fluorophores การและquencher ยับยั้งรัฐตื่นเต้นของ fluorophoreสภาพชีวิต fluorescence (van de Weert และสเตลล่า 2011) ดังนั้น วิธีการทั่วไปมากที่สุดเพื่อแยกการชุบแบบสแตติก และไดนามิกจะวัด fluorescence ที่อายุการใช้งานในสถานะการขาดงานของ quencher (เอมม่า et al.,1986) รับข้อมูลจาก fluorescence อายุการใช้งานทดลองพบให้พอดีกับผุเดียวเนนกับ v2 เป็นอย่างดีค่าเวลา 1.00 อายุการใช้งาน (s) ของบีเอสเอลดลงจาก6.20-5.08 ns ด้วยเพิ่มความเข้มข้นของ chrysoidine(ตาราง 2), ระบุว่า กลไก quenching มีก็ชุบ สำหรับแบบไดนามิกการชุบ มักจะเกี่ยวข้องกับ collisionalการชุบ โอนย้ายอิเล็กตรอน photoinduced (PET), พลังงาน radiativeโอนย้ายและการโอนย้ายพลังงานการสั่นพ้องของ Förster (ไม่สบายใจ), ซึ่งทำไม่ต้องติดต่อโดยตรงของ quencher กับ fluorophore ในcollisional ชุบ ผลอุณหภูมิสูงแพร่เร็วและคง quenching จะเพิ่มขึ้นด้วยดังนั้น การอุณหภูมิ Fluorescence ชุบของบีเอสเอ chrysoidineลักษณะรวมที่อุณหภูมิแตกต่างกัน โดยสเติร์น-Volmerสมการ:F0 = F ¼ 1 þ KSV½Q ð2ÞF0 และ F ปลดปล่อยก๊าซท่อน fluorescence ในการขาดงานและสถานะของ quencher ตามลำดับ Ksv เป็นสเติร์น-Volmer ชุบคง [Q] เป็น ความเข้มข้นของ quencher (chrysoidine) แสดงผืนสเติร์น-VolmerFig. 5 และค่า Ksv คำนวณจากสมการสเติร์น-Volmerแสดงในตาราง 3 แสดงผลค่า Ksv ลดด้วยการเพิ่มอุณหภูมิ ระบุที่ไม่เริ่มต้นการชุบจากตาม นับตั้งแต่การโต้ตอบของ chrysoidine กับบีเอสเอ discernible เปลี่ยนแปลงโปรตีนที่ก่อให้เกิด(ผลได้จากการทดลองของแรมสเป็คตรา UV – vis), และfluorescence มลพิษสเปกตรัมของบีเอสเอที่ทับซ้อนกับ UVสเปกตรัมการดูดซึมของ chrysoidine (ดู Fig. 6), เราสรุปที่ชุบ fluorescence บีเอสเอที่เกิดจาก chrysoidine ได้รวมถึงไม่สบายใจ เหตุผลที่ทำไม fluorescence ของบีเอสเอเป็นquenched เพื่อขอบเขตมากขึ้นที่อุณหภูมิสูงกว่าจะครบกำหนดแพร่ chrysoidine-บีเอสเอในระหว่างอายุการใช้งานรัฐตื่นเต้นLakowicz นอกจากนี้ยังพบปรากฏการณ์นี้ในการศึกษาไม่สบายใจTMA และ TU2D (Lakowicz et al., 1994)ตามทฤษฎีของ Förster พลังงานไม่ใช่ radiative โอนย้ายพารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับพลังงานโอนสามารถคำนวณได้ตามในสมการเป็นดังนี้:โดยที่ E คือ ประสิทธิภาพของพลังงานโอน s0 และ s มีญาติอายุการใช้งานของผู้บริจาค การขาดงาน (s0) และสถานะ (s) ของacceptor r คือ ระยะห่างระหว่าง acceptor การบริจาค R0คือระยะห่างที่โอนย้ายมีประสิทธิภาพเท่ากับ 50% ซึ่งสามารถสามารถคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:R60 ¼ 8:79 1025 K 2n4/J ð4ÞK2 เป็น ตัววางแนวพื้นที่ของ dipole, n คือการดรรชนีหักเหของตัวกลาง U เป็นผลตอบแทนควอนตัม fluorescenceของผู้บริจาค และ J ทิกรัลจำกัดเขตทับซ้อนของมลพิษ fluorescenceสเปกตรัมของการบริจาคและสเปกตรัมการดูดซึมของตัวacceptor:เจ¼R 10 FðkÞeðkÞk4dkR 10 FðkÞdk ð5Þโดยที่ F(k) คือ ความเข้ม fluorescence ของผู้บริจาค fluorescence ที่ความยาวคลื่น k และ e(k) เป็นค่าสัมประสิทธิ์การดูดซึมการสบของacceptor ที่ k ความยาวคลื่น มีการรายงานสำหรับบีเอสเอ ที่K2 = 2/3, U = 0.15 และ n = 1.36 (Deepa และมิชราเกส์ 2005 Kandagalและ al., 2006) ดังนั้น ตามสมการข้างต้น จะถูกคำนวณthat J = 3.78  1014 cm3 L mol1, R0 = 3.21 nm. Values of the r andE corresponding to the different concentration of chrysoidine aresummarized in Table 4. With the concentration of chrysoidineincreasing, the Förster distance (r) reduces from 5.76 to 4.05, andaccompanied with the increase of transfer efficiency.According to Förster’s theory, the distance between the acceptorand donor should be smaller than 10 nm. r, the distance betweenchrysoidine and Trp residues of BSA, is in the range of 4–6 nmand 0.5R0 < r < 2R0, indicating the results are in accordance withthe conditions of FRET and the energy transfer from BSA to chrysoidineoccurs with high probability.3.5. Conformational changes of BSA monitored by circular dichroismspectroscopyTo gain a better understanding of the effects of chrysoidine onthe conformational change of BSA, CD spectroscopy were employedin the present study. Far UV-CD studies revealed that therewere no significant changes in the ellipticity values at 208 or222 nm, which is characteristic of an a-helical structure of the protein(Xu et al., 2012; Zhao et al., 2009) (Fig. S1, Supplementarymaterial). Similarly, the content of secondary structural elementsin BSA was nearly unchanged with increasing the concentrationof chrysoidine (Table 5) indicated that the binding of chrysoidineto BSA does not lead to an apparent alteration of the secondarystructure of BSA, which is consistent with the results fromการศึกษาก UV – vis3.6. โมเลกุลเทียบเพื่อทำนายอเมริการวมของ chrysoidine บนบีเอสเอ โมเลกุลเทียบจำลองถูกรัน ด้วยโปรแกรม Autodock (รุ่น4.2), ซึ่งได้ฟรีจากงานวิจัย Scrippsสถาบัน (http://autodock.scripps.edu/) (มอร์ริสและ al., 1998) ที่โครงสร้างของ chrysoidine ถูกปรับใช้แพคเกจ Gaussian 03ในระหว่างการจำลองเทียบ 10 conformations ได้รับ(ตาราง S1 วัสดุเสริม), และพลังงานต่ำมีแสดงโครงสร้างโซลูชันของ chrysoidine – บีเอสเอใน Fig. 7 Chrysoidinebinds บีเอสเอในโพรงใกล้กับไซต์ Sudlow ฉันในโดเมน IIAที่มีสารอินทรีย์ขนาดเล็ก รวมทั้งยาเสพติดจำนวนมากพบการผูกกับ serum albumin (Perry et al., 2006 Saquib et al.,2011) ด้วยระยะห่างระหว่าง chrysoidine และทริปโตเฟน (ผู้บริจาค)(acceptor) ได้จากการจำลองเทียบน้อยกว่า 10 nm ซึ่งพอใจเงื่อนไขของความไม่สบายใจ (Gadella, 2009 Lakowicz, 2006) และตรวจสอบข้อสรุปที่ได้จาก fluorescenceชุบด้วยการวิเคราะห์ คำนวณพลังงานรวมจากเทียบจำลองเปิดเผยที่ van der Waals และไฮโดรเจนงานโต้ตอบ (chrysoidine ด้วยอาร์กิวเมนต์ของค่า 256) มีบทบาทสำคัญในรวม chrysoidine บีเอสเอ ในข้อตกลงการให้บริการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2 การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของบีเอสเอตรวจสอบโดย UV-Vis
สเปกโทรสโกดูดซึมรังสียูวีพิพาทเป็นวิธีที่ง่าย
แต่มีประสิทธิภาพซึ่งมักจะถูกนำไปใช้ในการสำรวจการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของโปรตีนและลิแกนด์โปรตีนเชิงซ้อน บีเอสเอมีสองหลักแถบการดูดกลืน (รูปที่. 3)
วงดนตรีการดูดซึมที่แข็งแกร่งที่ประมาณ
220 นาโนเมตรเป็นส่วนใหญ่เนื่องจากพีพันธบัตรเปปไทด์หรือไม่ อิเล็กทรอนิกส์ p/
เปลี่ยนของกระดูกสันหลังเปปไทด์ (ขอบเขต, 1974) อ่อนแอวงดูดซึมประมาณ 280 นาโนเมตรเป็นส่วนใหญ่ประกอบกับการดูดซึมของโพรไบโอและซายน์(Pace et al., 1995) การดูดซึมสเปกตรัมของบีเอสเอแสดงให้เห็นถึงผลกระทบ hypochromic ประมาณ 220 นาโนเมตรที่มีการเปลี่ยนแปลงbathochromic ด้วยกันเป็นความเข้มข้นของ chrysoidine เพิ่มขึ้น เหตุผลสำหรับปรากฏการณ์นี้คือพลังงานที่จำเป็นสำหรับพี? การเปลี่ยนแปลง p/ ลดลงเมื่อขั้วของบีเอสเอโซลูชั่นที่เพิ่มขึ้นด้วยการเพิ่มความเข้มข้นเพิ่มchrysoidine. ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ตรวจพบพบว่าในสเปกตรัมการดูดซึมบีเอสเอที่ประมาณ 280 นาโนเมตรในการปรากฏตัวของ chrysoidine ผลการศึกษาพบว่าผลผูกพันของบีเอสเอ chrysoidine ไปไม่ได้อย่างรุนแรงเปลี่ยนโครงสร้างของบีเอสเอได้. 3.3 ดับเรืองแสงของบีเอสเอโดย chrysoidine สามกรดอะมิโนที่มีกลิ่นหอม (โพรไบโอซายน์และphenylalanine) มีส่วนร่วมในการเรืองแสงที่แท้จริงของบีเอสเอ. เมื่อความยาวคลื่นกระตุ้นถูกตั้งไว้ที่ 280 นาโนเมตรปล่อยแสงจากบีเอสเอที่ถูกครอบงำด้วยโพรไบโอและซายน์, ในขณะที่ เมื่อมีการเลือกการกระตุ้นที่ 295 นาโนเมตรก็ช่วยลดการปล่อยก๊าซจากสารตกค้างซายน์และเป็นที่รู้จักที่จะเลือกตื่นเต้นตกค้างโพรไบโอ(ปรา et al., 1986) ดังแสดงในรูปที่ 4a เมื่อ BSA รู้สึกตื่นเต้นที่ 280 นาโนเมตรที่ chrysoidine ดับสเปกตรัมการปล่อยแสงของบีเอสเอ บีเอสเอมี2 ตกค้างโพรไบโอ: Trp-134 ในโดเมน I และ Trp-213 ในครั้งที่สองโดเมน Trp-213 ตั้งอยู่ในกระเป๋าที่มีผลผูกพันชอบน้ำขณะTrp-134 เป็นสัมผัสมากขึ้นในการทำละลายและเป็นที่ตั้งอยู่บนพื้นผิวของโมเลกุล(Mallick et al., 2005) เรืองแสงคุณสมบัติของสารตกค้างโพรไบโอเป็นพิเศษมีความไวต่อสภาพแวดล้อมในท้องถิ่นทำให้มันเป็นตัวเลือกที่เหมาะสำหรับการตรวจสอบของการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างโปรตีน(ลินช์และดอว์สัน, 2008) รูป 4b แสดงให้เห็นถึงการดับแสงของบีเอสเอโดยchrysoidine เมื่อกระตุ้นถูกกำหนดให้ 295 นาโนเมตร ความยาวคลื่นการปล่อยก๊าซสูงสุดของบีเอสเอไม่ได้มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญด้วยนอกเหนือจาก chrysoidine ซึ่งชี้ให้เห็นว่า chrysoidine มีผลกระทบเล็กน้อยบนโครงสร้างของโปรตีน(เบอร์เกอร์ et al., 1998). สเปคโทรเรืองแสง Synchronous เป็นวิธีที่มีประโยชน์สำหรับการประเมินผลของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโปรตีนซึ่งจะช่วยให้ข้อมูลเกี่ยวกับ microenvironments รอบสารเรืองแสงกลุ่มทำงานโดยการสแกนพร้อมกันของการกระตุ้นและmonochromators การปล่อยก๊าซที่มีความยาวคลื่นคงที่ช่วงเวลา เมื่อช่วงความยาวคลื่น (Dk) ถูกตั้งไว้ที่ 60 นาโนเมตรหรือ15 นาโนเมตรสเปกตรัมแสงซิงโครให้ลักษณะข้อมูลของสารตกค้างหรือสารตกค้างโพรไบโอซายน์ตามลำดับ(หลิวหลิวและ 2012) เท่าที่เห็นในรูป 4c และ d, ความเข้มของแสงซิงโครของบีเอสเอที่Dk = 60 นาโนเมตรและDk = 15 นาโนเมตรลดลงมีความก้าวหน้าด้วยการเพิ่มทีละน้อยของ chrysoidine. ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่เห็นได้ชัดในสูงสุดการปล่อยก๊าซเมื่อดับพบว่าแสดงให้เห็นว่าการทำงานร่วมกันของ chrysoidine กับบีเอสเอ ไม่รบกวนขั้วรอบตกค้างเหล่านี้อย่างมีนัยสำคัญ. 3.4 กลไกการเรืองแสงดับกลไกของการดับสีเรืองแสงมักจะ classi- กระแสไฟดับลงในแบบไดนามิกและการดับคงที่ (Xie et al., 2010) ในระหว่างการดับแบบไดนามิกดับโต้ตอบกับรัฐตื่นเต้นของสารเรืองแสงที่นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงของการเรืองแสงอายุการใช้งาน ในทางตรงกันข้ามในช่วงดับคงก่อตัวของพื้นดินที่มีความซับซ้อนของรัฐระหว่าง fluorophores และดับยับยั้งการก่อตัวของสภาพคล่องสารเรืองแสงที่โดยไม่ต้องมีผลกระทบต่อชีวิตของเรืองแสง(แวนเดอ Weert และสเตลล่า2011) ดังนั้นวิธีการที่ชัดเจนที่สุดที่จะแยกแยะความแตกต่างดับแบบคงที่และแบบไดนามิกในการวัดการเรืองแสงอายุการใช้งานในการแสดงตนและการขาดการดับ(เทียร์ et al., 1986) ข้อมูลที่ได้จากการทดลองการเรืองแสงอายุการใช้งานพบว่าเหมาะสมดีที่จะสลายตัวเดียวกับที่ชี้แจง v2 ค่าเข้าหา 1.00 อายุการใช้งาน (s) ของบีเอสเอลดลงจาก6.20 5.08 ns การที่จะมีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ chrysoidine (ตารางที่ 2) แสดงให้เห็นว่ากลไกการดับเป็นแบบไดนามิกดับ สำหรับดับแบบไดนามิกก็มักจะเกี่ยวข้องกับ collisional ดับโอนอิเล็กตรอน photoinduced (PET), พลังงานรังสีการถ่ายโอนและการถ่ายโอนพลังงานเสียงสะท้อนForster (ฉลุ) ซึ่งไม่จำเป็นต้องมีการติดต่อโดยตรงจากการดับด้วยสารเรืองแสง ในการดับ collisional อุณหภูมิที่สูงขึ้นส่งผลให้เกิดการแพร่กระจายได้เร็วขึ้นและด้วยเหตุนี้คงดับจะเพิ่มขึ้นกับอุณหภูมิ ข้อมูลที่ดับแสงของ chrysoidine-BSA ผูกพันที่อุณหภูมิที่แตกต่างกันมีการวิเคราะห์จากสเติร์น-Volmer สม: F0 = F 1 ¼þKSV½Q? ð2Þที่ F0 และ F มีการเรืองแสงที่มั่นคงของรัฐความเข้มในกรณีที่ไม่มีและการปรากฏตัวของดับตามลำดับ; KSV เป็นสเติร์น-Volmer ดับคงที่ และ [Q] คือความเข้มข้นของการดับ(ที่ chrysoidine) สเติร์นแปลง-Volmer จะแสดงในรูปที่ 5 และค่า KSV คำนวณจากสมการสเติร์น-Volmer ถูกนำเสนอในตารางที่ 3 ผลการศึกษาพบค่า KSV ลดอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่าดับไม่ได้เริ่มต้นจากการชนกัน ตั้งแต่การมีปฏิสัมพันธ์ของ chrysoidine กับบีเอสเอทำให้เกิดไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มองเห็นได้ในโปรตีน (ผลที่ได้รับจากสเปกตรัม UV-Vis ทดลอง) และสเปกตรัมการปล่อยแสงของบีเอสเอคาบเกี่ยวกับรังสียูวีสเปกตรัมการดูดซึมของchrysoidine (ดูรูปที่. 6) เราเหมาเอาว่าดับของบีเอสเอเรืองแสงที่เกิดจากการ chrysoidine เป็นส่วนที่ทำให้ไม่สบายใจ เหตุผลที่ว่าทำไมการเรืองแสงของบีเอสเอจะดับในระดับสูงที่อุณหภูมิสูงเกิดจากการแพร่chrysoidine-บีเอสเอในช่วงอายุการใช้งานของรัฐที่ตื่นเต้น. Lakowicz ยังสังเกตเห็นปรากฏการณ์นี้ในการศึกษาทำให้ไม่สบายใจระหว่างTMA และ TU2D (Lakowicz et al, , 1994). ตามทฤษฎีการถ่ายโอนพลังงานของFörsterที่ไม่ใช่รังสี, พารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนพลังงานที่สามารถคำนวณจากสมการดังต่อไปนี้ที่E คือประสิทธิภาพของการถ่ายโอนพลังงาน; s0 และ s เป็นญาติอายุการใช้งานของผู้บริจาคในกรณีที่ไม่มี(s0) และการปรากฏตัว (s) ของใบเสร็จ; r คือระยะห่างระหว่างตัวรับและผู้บริจาคที่ R0 เป็นระยะทางที่มีประสิทธิภาพการถ่ายโอนเท่ากับ 50% ซึ่งสามารถคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้: R6 0 ¼ 8:79? 1025K2 N4 / J ð4Þที่K2 เป็นปัจจัยอวกาศปฐมนิเทศของไดโพล, n เป็นดัชนีหักเหของกลางU เป็นอัตราควอนตัมเรืองแสงของผู้บริจาคและJ เป็นที่ทับซ้อนกันหนึ่งของการปล่อยก๊าซเรืองแสงสเปกตรัมของผู้ให้และสเปกตรัมการดูดซึมของใบเสร็จ: J ¼ R 1 0 FðkÞeðkÞk4 DK R 1 0 FðkÞdkð5Þที่f (k) คือความเข้มแสงของผู้บริจาคเรืองแสงที่มีความยาวคลื่นk, และ e (k) เป็นค่าสัมประสิทธิ์การดูดซึมกรามของตัวรับที่ความยาวคลื่น k มันได้รับรายงานสำหรับบีเอสเอที่K2 = 2/3, U = 0.15 และ n = 1.36 (Deepa และ Mishra, 2005; Kandagal. et al, 2006) ดังนั้นตามสมการข้างต้นจะคำนวณว่า J = 3.78? 1014 cm3 L mol1, R0 = 3.21 นาโนเมตร ค่าของ R และE ที่สอดคล้องกับความเข้มข้นแตกต่างกันของ chrysoidine จะสรุปใน4 ของตารางที่มีความเข้มข้นของ chrysoidine เพิ่มขึ้นระยะทาง Forster (R) ช่วยลด 5.76-4.05 และมาพร้อมกับการเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายโอน. ตามที่ฟอสเตอร์ ทฤษฎีระยะห่างระหว่างตัวรับและผู้บริจาคควรจะมีขนาดเล็กกว่า10 นาโนเมตร R, ระยะห่างระหว่างchrysoidine และสารตกค้าง Trp ของบีเอสเออยู่ในช่วงของ 4-6 นาโนเมตรและ0.5R0 <อาร์ <2R0 แสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่เป็นไปตามเงื่อนไขของการฉลุและการถ่ายโอนพลังงานจากบีเอสเอจะchrysoidine เกิดขึ้นกับ น่าจะเป็นสูง. 3.5 การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของบีเอสเอตรวจสอบโดย dichroism วงกลมสเปกโทรสโกเพื่อให้ได้รับความเข้าใจที่ดีขึ้นของผลกระทบของchrysoidine ในการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของบีเอสเอ, สเปกโทรสโกซีดีที่ถูกว่าจ้างในการศึกษาในปัจจุบัน การศึกษาฟารังสียูวีซีดีพบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในค่า ellipticity ที่ 208 หรือ 222 นาโนเมตรซึ่งเป็นลักษณะของโครงสร้าง-ขดลวดของโปรตีน(Xu et al, 2012;.. Zhao et al, 2009) ( รูปที่. S1, เสริมวัสดุ) ในทำนองเดียวกันเนื้อหาขององค์ประกอบโครงสร้างทุติยภูมิในบีเอสเอได้เกือบไม่เปลี่ยนแปลงด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของchrysoidine (ตารางที่ 5) ชี้ให้เห็นว่าผลผูกพันของ chrysoidine เพื่อ BSA ไม่ได้นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงที่เห็นได้ชัดของรองโครงสร้างของบีเอสเอซึ่งมีความสอดคล้องกับผลลัพธ์ที่ได้จากUV-Vis ศึกษาสเปคโทร. 3.6 เชื่อมต่อโมเลกุลเพื่อทำนายเว็บไซต์ที่มีผลผูกพันของบีเอสเอ chrysoidine ในโมเลกุลจำลองวิ่งเชื่อมต่อกับโปรแกรมAutodock (เวอร์ชั่น4.2) ซึ่งเป็นบริการฟรีจากดีบุกวิจัยสถาบัน(http://autodock.scripps.edu/) (มอร์ริส et al., 1998) โครงสร้างของ chrysoidine คือการเพิ่มประสิทธิภาพการใช้ Gaussian 03 แพคเกจ. ในระหว่างการจำลองการเชื่อมต่อ 10 conformations ที่ได้รับ(ตารางที่ S1 วัสดุเสริม) และพลังงานต่ำสุดโครงสร้างการแก้ปัญหาของchrysoidine-BSA จะแสดงในรูป 7. chrysoidine ผูกกับบีเอสเอที่โพรงใกล้กับเว็บไซต์ Sudlow ฉันในไอไอเอโดเมนที่สารอินทรีย์ขนาดเล็กรวมทั้งยาเสพติดจำนวนมากถูกพบเชื่อมโยงกับอัลบูมิซีรั่ม(เ