2.3. Folate measurement2.3.1. Measu

2.3. Folate measurement

2.3.1. Measurement of folate by HPLC with fluorimetric detection after precolumn derivatisation

Folate measurement was carried out in principle according to Ndaw et al. (2001). 30 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7) with 10 mg/ml of ascorbic acid were added to 10 g of green beans or spinach powder. Then the mixture was boiled during 10 min at 100 °C. After cooling at room temperature during 15 min, the volume was adjusted in a conical flask to 50 ml; the extract was then centrifuged for 10 min at 5000g.

10 ml of the supernatant were recovered, to which 1 ml of chicken pancreas solution at 5 mg/ml was added. The incubation duration was increased to 120 min at 37 °C.

After incubation, 5 ml of phosphate buffer with 0.4 g/ml of ascorbic acid, 15 ml of Tris buffer (0.066 M, pH 7.8), 1 ml of 2-octanol and 10 ml of sodium borohydride (120 g/l) were added. After stirring, the solutions were allowed to stand during 10 min. The pH was adjusted to 7.4 with 5 M acetic acid and 80 μl of formaldehyde 37% was added. After stirring, a further 10 ml of sodium borohydride were added and the pH was immediately decreased to lower than 1 with hydrochloric acid 37% and the mixture was allowed to stand for 10 min. The pH value was then adjusted to 5 with 5 M sodium hydroxide and a further 10 ml of sodium borohydride was added. Solution was let stand during 20 min and the volume was adjusted to 100 ml with Tris buffer (0.066 M, pH 7.8).

Folate purification was carried out by affinity chromatography with Folate Binding Protein. Column conditioning was done by percolating 5 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7). 10 ml of sample (filtered beforehand with Millex-AA; 0.80 μm; 25 mm (Millipore, France)) were poured on the column. The column was washed with 10 ml of phosphate buffer (0.025 M, pH 7). Folates were eluted by percolating 8 ml of a solution of dl-dithiothreitol (0.02 M) and trifluoroacetic acid (0.02 M) through the column into a conical flask containing 200 μl of a 250 mg/ml ascorbic acid solution and 40 μl of NaOH (0.6 g/l). The volume was adjusted to 10 ml with the eluting solution.

Folate analysis was carried out on a HPLC equipped with fluorimetric detection (RF-10AXL, Shimadzu Inc., Kyoto, Japan). Fluorimetric detection was recorded at an excitation wavelength of 295 nm and an emission wavelength of 356 nm. A LiChrospher 100RP-18 (250 × 4.5 mm; 5 μm, Altech, France) equipped with a guard column LiChrospher RP-18 All Guard (7.5 × 4.6 mm; 5 μm, Altech, France) was used. The mobile phase used was a mixture of water with formic acid (10 ml/l) and acetonitrile HPLC grade. The elution gradient started at 5% of acetonitrile, increased linearly to 100% in 25 min, then 100% of acetonitrile for 10 min followed by linear decrease to 5% in 10 min and equilibration for 10 min. The flow rate of the mobile phase was 0.8 ml/min and the injection volume was 100 μl (Rychlik, 2004). Folate quantification was based on an external calibration against 5-CH3-H4folate monoglutamate and 5-CH3-H4folate diglutamate. Calibration curves were from 1.10−9 to 6.10−8 M for 5-CH3-H4folate monoglutamate (r2 = 0.996) and from 5.10−9 to 1.10−7 M for 5-CH3-H4folate diglutamate (r2 = 0.999).

Our method for folate quantification was confirmed by comparison with the authors of Ndaw et al. (2001) from Aérial (Illkirch, France). For this, both laboratories determined folates content in the same sample: green beans raw material of the batch B.

2.3.2. Folate determination by stable isotope dilution assay

10 ml of MES buffer (42.65 g/l MES hydrate, 20 g/l ascorbic acid, 13.95 ml/l β-mercaptoethanol, pH 5) was added to 1 g of ground samples (spinach and green beans) or to 2 g for green beans “Final products”. The mix of internal standards containing [2H42H4]-5-CH3-H4folate, [2H42H4]-5-HCO-H4folate, [2H42H4]-10-HCO-PteGlu and [2H42H4]-H4folate and [2H42H4]-PteGlu was added.

Samples were stirred for 15 min and boiled for 10 min at 100 °C. After cooling on ice for 10 min, 2 ml of chicken pancreas (0.16 mg/ml) and 150 μl of rat serum were added and incubated overnight at 37 °C in a shaking bath.

After deconjugase treatment, samples were heated for 10 min at 100 °C, cooled afterwards on ice and were centrifuged at 3000g during 20 min at 4 °C. The purification of folates was performed on SPE SAX cartridges 500 mg/3 ml; 55 μm; 70 Å (Phenomenex, Germany). Cartridges were conditioned with 2 volumes of hexane, 2 volumes of methanol and 2 volumes of phosphate buffer (pH 7, 0.01 M) with β-mercaptoethanol (2 ml/l). Then the supernatants of the samples were applied on the cartridges, washed with 3 bed volumes of phosphate buffer with β-mercaptoethanol and run dry. Folates were eluted with 2 ml of elution buffer, composed of 50 g/l NaCl, 13.6 g/l sodium acetate, 10 g/l ascorbic acid and 13.9 ml/l β-mercaptoethanol. Eluate was filtered on 0.22 μm PVDF filters (VWR, Germany) for HPLC analysis.

Folate analysis was carried out on an HPLC (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan) coupled with a triple quadrupole mass spectrometer (API 4000 Q-Trap, AB-Sciex, Foster City, CA, USA). A column Hyper Clone BDS C18 130 Å (150 × 3.2 mm; 3 μm, Phenomenex, Germany) was used. The mobile phase consisted of variable mixtures of 10 ml/l aqueous acetic acid (eluent A) and acetonitrile HPLC grade (eluent B) acidified with 10 ml/l of acetic acid, at a flow rate of 0.2 ml/min. Gradient elution started at 2% of eluent B for 2 min, and then increased to 10% B in 5 min. The gradient was held at 10% B for 3 min and increased linearly to 15% B in 8 min and to 100% B in another 2 min. The composition remained constant for 1 min before being reduced to 2% B in 2 min. Finally, the gradient was held at 2% B for 9 min. The injection volume was 10 μl.

During the first 5 min and the last 9 min of the gradient program, the column effluent was diverted to the waste reservoir. The spectrometer was operated in the positive electrospray ionisation mode using Multiple Reaction Monitoring (MRM). Ionisation voltage was set to 5500 V, nebuliser gas pressure was 75 Psi, auxiliary gas pressure 75 Psi and the curtain gas pressure 10 Psi. The temperature of the heater was set to 550 °C. Further compound dependent conditions are presented in Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การวัดโฟเลต2.3.1 การวัดของโฟเลตโดย HPLC กับ fluorimetric การตรวจสอบหลังจาก precolumn derivatisationวัดโฟถูกดำเนินในหลักการตาม Ndaw et al. (2001) 30 ml ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 7) กับ 10 mg/ml ของกรดแอสคอร์บิคได้เพิ่ม 10 กรัมผงผักโขมหรือถั่วเขียว แล้ว ส่วนผสมถูกต้มในช่วง 10 นาทีที่ 100 องศาเซลเซียส หลังจากทำความเย็นที่อุณหภูมิห้องในช่วง 15 นาที ไดรฟ์ข้อมูลถูกปรับปรุงในทรงกรวยหนาวไป 50 ml สารสกัดได้ centrifuged แล้วสำหรับ 10 นาทีที่ 5000g10 ml ของ supernatant ถูกกู้คืน ที่ถูกเพิ่มเข้ามา 1 ml ของตับอ่อนไก่ที่ 5 mg/ml ระยะเวลาฟักตัวขึ้นไป 120 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียสหลังจากบ่ม ml 5 บัฟเฟอร์ฟอสเฟตกับ 0.4 g/ml ของกรดแอสคอร์บิค มีเพิ่ม 15 มลตรีบัฟเฟอร์ (0.066 M, pH 7.8), 1 ml 2-octanol และ 10 ml ของโซเดียม borohydride (120 g/l) หลังจากกวน โซลูชั่นได้รับอนุญาตให้ยืนระหว่าง 10 นาที ปรับปรุง pH 7.4 กรดอะซิติก 5 เมตรและ μl 80 ของฟอร์มาลดีไฮด์เพิ่ม 37% หลังจากกวน ml 10 การเพิ่มเติมของโซเดียม borohydride เพิ่ม และ pH ได้ทันที ลดต่ำกว่า 1 ด้วยกรดไฮโดรคลอริก 37% และส่วนผสมได้รับอนุญาตให้ถึง 10 นาที ค่า pH ปรับปรุงแล้ว 5 กับ 5 M โซเดียมไฮดรอกไซด์ และเพิ่มเป็น ml 10 เพิ่มเติมของโซเดียม borohydride โซลูชันอนุญาตให้ยืนระหว่าง 20 นาที และไดรฟ์ข้อมูลถูกปรับ 100 มลกับทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ (0.066 M, pH 7.8)โฟเลตฟอกถูกดำเนิน โดย chromatography ความเกี่ยวข้องกับโปรตีนการผูกโฟ ปรับคอลัมน์ได้โดย percolating ml 5 ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 7) 10 มิลลิลิตรของตัวอย่าง (กรองไว้ล่วงหน้ากับ Millex-AA; 0.80 μm; 25 มม. (มาก ฝรั่งเศส)) มี poured บนคอลัมน์ มีล้างคอลัมน์ ด้วย 10 ml ของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.025 M, pH 7) Folates ได้ eluted โดย percolating 8 ml ของโซลูชันของ dl-dithiothreitol (0.02 M) และกรด trifluoroacetic (0.02 M) ผ่านคอลัมน์เป็นทรงกรวยหนาว μl 200 ของโซลูชันกรดแอสคอร์บิค 250 mg/ml และ μl 40 ของ NaOH (0.6 g/l) ไดรฟ์ข้อมูลถูกปรับปรุงให้ 10 มล.ด้วยโซลูชัน elutingวิเคราะห์โฟถูกดำเนินใน HPLC ที่เพียบพร้อมไป ด้วยการตรวจหา fluorimetric (RF 10AXL, Inc. Shimadzu เกียวโต ญี่ปุ่น) บันทึกตรวจ Fluorimetric ที่มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 295 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ 356 nm 18-100RP ที่ LiChrospher (250 × 4.5 มม. 5 μm, Altech ฝรั่งเศส) พร้อมคอลัมน์รักษาป้องกันทั้งหมด 18 LiChrospher RP (7.5 × 4.6 มม. 5 μm, Altech ฝรั่งเศส) ใช้ ระยะเคลื่อนที่ใช้เป็นส่วนผสมของน้ำกรด (10 ml/l) และเกรด HPLC acetonitrile การไล่ระดับสี elution เริ่มต้นที่ 5% ของ acetonitrile เพิ่มขึ้น 100% ในนาที 25, acetonitrile สำหรับ 10 นาทีตาม ด้วยเส้นลด 5% ใน 10 นาทีและ equilibration สำหรับ 10 นาทีแล้ว 100% เชิงเส้น อัตราการไหลของเฟสเคลื่อน 0.8 ml/min และปริมาณฉีดได้ 100 μl (Rychlik, 2004) โฟเลตนับเป็นไปตามการปรับเทียบภายนอก 5-CH3-H4folate monoglutamate และ diglutamate 5-CH3-H4folate เส้นโค้งเทียบได้จาก 1.10−9 6.10−8 M สำหรับ 5-CH3-H4folate monoglutamate (r2 = 0.996) จาก 5.10−9 เพื่อ 1.10−7 M สำหรับ 5-CH3-H4folate diglutamate (r2 = 0.999)วิธีการของเราสำหรับนับโฟได้รับการยืนยัน by comparison with ผู้เขียนของ Ndaw et al. (2001) จาก Aérial (Illkirch ฝรั่งเศส) สำหรับนี้ ห้องปฏิบัติการทั้งกำหนดเนื้อหา folates ในตัวอย่างเดียวกัน: ถั่วเขียวดิบชุดบี2.3.2. โฟกำหนด โดยวิเคราะห์ไอโซโทปเจือจาง10 ml ของบัฟเฟอร์ MES (42.65 บัญชี MES hydrate กรดแอสคอร์บิค 20 g/l, 13.95 ml/l β-mercaptoethanol, pH 5) มีเพิ่ม g 1 ตัวอย่างดิน (ผักโขมและถั่วเขียว) หรือ g 2 สำหรับถั่วเขียว "สินค้าสุดท้าย" ผสมผสานมาตรฐานภายในประกอบด้วย [2H42H4] -5-CH3-H4folate, [2H42H4] -5-HCO-H4folate, [2H42H4] -10-HCO-PteGlu [2H42H4] และ -H4folate [2H42H4] และ -PteGlu เพิ่มตัวอย่างกวนสำหรับ 15 นาที และต้มใน 10 นาทีที่ 100 องศาเซลเซียส หลังจากทำความเย็นในน้ำแข็ง 10 นาที 2 ml ของไก่ตับอ่อน (0.16 mg/ml) และ μl 150 ของหนู เซรั่มถูกเพิ่ม และ incubated ค้างคืนที่ 37 ° C ในอ่างงก ๆหลังการรักษา deconjugase ตัวอย่างถูกความร้อนใน 10 นาทีที่ 100 ° C ระบายความร้อนด้วยหลังบนน้ำแข็ง และ centrifuged ที่ 3000g ในช่วง 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ทำการฟอกของ folates ตามตลับหมึก SPE แซ็กซ์ มิลลิกรัม/3 ml 55 μm 70 Å (Phenomenex เยอรมนี) ตลับถูกปรับวอลุ่ม 2 ของเฮกเซน 2 ปริมาณของเมทานอลและปริมาณฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7, 0.01 M) 2 กับβ-mercaptoethanol (2 ml/l) แล้ว supernatants ตัวอย่างถูกใช้กับตลับหมึก ล้าง ด้วย 3 เตียงปริมาณฟอสเฟตบัฟเฟอร์ด้วยβ-mercaptoethanol และทำแห้ง Folates ได้ eluted กับ ml 2 elution บัฟเฟอร์ ประกอบด้วย 50 g/l NaCl, acetate โซเดียม 13.6 g/l กรดแอสคอร์บิค 10 g/l และ 13.9 ml/l β-mercaptoethanol Eluate เป็นกรองบน μm 0.22 PVDF กรอง (VWR เยอรมนี) สำหรับวิเคราะห์ HPLCFolate analysis was carried out on an HPLC (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan) coupled with a triple quadrupole mass spectrometer (API 4000 Q-Trap, AB-Sciex, Foster City, CA, USA). A column Hyper Clone BDS C18 130 Å (150 × 3.2 mm; 3 μm, Phenomenex, Germany) was used. The mobile phase consisted of variable mixtures of 10 ml/l aqueous acetic acid (eluent A) and acetonitrile HPLC grade (eluent B) acidified with 10 ml/l of acetic acid, at a flow rate of 0.2 ml/min. Gradient elution started at 2% of eluent B for 2 min, and then increased to 10% B in 5 min. The gradient was held at 10% B for 3 min and increased linearly to 15% B in 8 min and to 100% B in another 2 min. The composition remained constant for 1 min before being reduced to 2% B in 2 min. Finally, the gradient was held at 2% B for 9 min. The injection volume was 10 μl.During the first 5 min and the last 9 min of the gradient program, the column effluent was diverted to the waste reservoir. The spectrometer was operated in the positive electrospray ionisation mode using Multiple Reaction Monitoring (MRM). Ionisation voltage was set to 5500 V, nebuliser gas pressure was 75 Psi, auxiliary gas pressure 75 Psi and the curtain gas pressure 10 Psi. The temperature of the heater was set to 550 °C. Further compound dependent conditions are presented in Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 โฟเลตวัด2.3.1 วัดโฟเลตโดย HPLC มีการตรวจสอบหลังจาก fluorimetric precolumn derivatisation โฟเลตวัดได้ดำเนินการในหลักการตาม Ndaw et al, (2001) 30 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 เอ็มพีเอช 7) 10 mg / ml ของวิตามินซีที่ถูกเพิ่มเข้า 10 กรัมถั่วเขียวหรือผงผักโขม จากนั้นผสมต้มในช่วง 10 นาทีที่ 100 องศาเซลเซียส หลังจากที่การระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้องในช่วง 15 นาทีปริมาณการปรับในขวดรูปกรวยถึง 50 มล.; สารสกัดที่ถูกปั่นแล้วเป็นเวลา 10 นาทีที่ 5000g. 10 มิลลิลิตรใสหายที่ 1 มล. ไก่แก้ปัญหาตับอ่อนที่ 5 mg / ml ถูกเพิ่มเข้ามา ระยะเวลาการบ่มเพิ่มขึ้นเป็น 120 นาทีที่ 37 ° C. หลังจากการบ่ม 5 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.4 g / ml ของวิตามินซี 15 มล. ของบัฟเฟอร์ Tris (0.066 M ค่า pH 7.8) 1 มิลลิลิตรของ 2 ตานอลและ 10 มิลลิลิตร borohydride โซเดียม (120 g / l) มีการเพิ่ม หลังจากที่กวนโซลูชั่นได้รับอนุญาตให้ยืนในช่วง 10 นาที ค่า pH ปรับ 7.4 5 M กรดอะซิติกและ 80 ไมโครลิตรของไฮด์ 37% ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากที่กวนอีก 10 มิลลิลิตร borohydride โซเดียมและมีการเพิ่มค่า pH ลดลงทันทีที่ต่ำกว่า 1 กับกรดไฮโดรคลอ 37% และส่วนผสมที่ได้รับอนุญาตให้ยืนเป็นเวลา 10 นาที ค่าพีเอชมีการปรับไปแล้ว 5 5 M โซดาไฟและอีก 10 มิลลิลิตร borohydride โซเดียมถูกเพิ่มเข้ามา วิธีการแก้ปัญหาที่ถูกให้ยืนในช่วง 20 นาทีและปริมาณที่ถูกปรับถึง 100 มล. กับบัฟเฟอร์ Tris (0.066 M ค่า pH 7.8). ฟอกโฟเลตได้ดำเนินการโดยโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดกับโฟเลตโปรตีนผูกพัน คอลัมน์เครื่องทำโดยการแทรกซึม 5 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 เอ็มพีเอช 7) 10 มล. ของกลุ่มตัวอย่าง (กรองก่อนที่มี Millex-AA; 0.80 ไมโครเมตร 25 มิลลิเมตร (คฝรั่งเศส)) ถูกเทในคอลัมน์ คอลัมน์ถูกล้างด้วย 10 มล. ของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.025 เอ็มพีเอช 7) โฟเลตถูกชะโดยแทรกซึม 8 มล. ของการแก้ปัญหาของ DL-dithiothreitol (ที่ 0.02 M) และกรด TRIFLUOROACETIC (0.02 M) ผ่านคอลัมน์ลงในขวดรูปกรวยที่มี 200 ไมโครลิตรของ 250 mg / ml สารละลายกรดแอสคอบิและ 40 ไมโครลิตรของ NaOH ( 0.6 g / l) ปริมาณที่ได้รับการปรับถึง 10 มล. กับการแก้ปัญหา eluting ได้. วิเคราะห์โฟเลตได้ดำเนินการใน HPLC พร้อมตรวจ fluorimetric (RF-10AXL, Shimadzu อิงค์เกียวโตญี่ปุ่น) การตรวจสอบ fluorimetric เป็นบันทึกที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 295 นาโนเมตรและปล่อยความยาวคลื่น 356 นาโนเมตร LiChrospher 100RP-18 (250 × 4.5 มม 5 ไมโครเมตร Altech ฝรั่งเศส) พร้อมกับคอลัมน์ยาม LiChrospher RP-18 ทั้งหมดยาม (7.5 × 4.6 มม 5 ไมโครเมตร Altech ฝรั่งเศส) ถูกนำมาใช้ ขั้นตอนการใช้โทรศัพท์มือถือเป็นส่วนผสมของน้ำที่มีกรด (10 มล. / ลิตร) และ acetonitrile เกรด HPLC ลาดชะเริ่มต้นที่ 5% ของ acetonitrile เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงถึง 100% ใน 25 นาทีแล้ว 100% ของ acetonitrile เป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยการเชิงเส้นลดลงถึง 5% ในเวลา 10 นาทีและสมดุลเป็นเวลา 10 นาที อัตราการไหลของเฟสเคลื่อนที่คือ 0.8 มล. / นาทีและปริมาณการฉีด 100 ไมโครลิตร (Rychlik, 2004) ปริมาณโฟเลตอยู่บนพื้นฐานของการสอบเทียบภายนอกกับ 5-CH3 H4folate monoglutamate และ 5 CH3-H4folate diglutamate เส้นโค้งการสอบเทียบเป็น 1.10-9 เพื่อ 6.10-8 เมตรสำหรับ 5 CH3-H4folate monoglutamate (r2 = 0.996) และการ 5.10-9 1.10-7 เมตรสำหรับ 5 CH3-H4folate diglutamate (r2 = 0.999). วิธีการของเรา ปริมาณโฟเลตได้รับการยืนยันโดยการเปรียบเทียบกับผู้เขียนของ Ndaw et al, (2001) จากทางอากาศ (Illkirch ฝรั่งเศส) สำหรับวันนี้ทางห้องปฏิบัติการทั้งกำหนดเนื้อหาโฟเลตในตัวอย่างเดียวกัน: ถั่วเขียววัตถุดิบชุดบี2.3.2 ความมุ่งมั่นของโฟเลตด้วยวิธีการลดสัดส่วนไอโซโทป10 มล. ของบัฟเฟอร์ MES (42.65 กรัม / ลิตร MES ไฮเดรต 20 กรัม / ลิตรวิตามินซี 13.95 มล. / ลิตรβ-mercaptoethanol ค่า pH 5) ถูกบันทึกอยู่ใน 1 กรัมของตัวอย่างพื้นดิน (ผักขมและสีเขียว ถั่ว) หรือ 2 กรัมสำหรับถั่วเขียว "ผลิตภัณฑ์สุดท้าย" ผสมของมาตรฐานภายในมี [2H42H4] -5-CH3-H4folate [2H42H4] -5-HCO-H4folate [2H42H4] -10-HCO-PteGlu และ [2H42H4] -H4folate และ [2H42H4] -PteGlu ถูกเพิ่มเข้ามาตัวอย่างกวนเป็นเวลา 15 นาทีและต้มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส หลังจากที่ระบายความร้อนบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที, 2 มิลลิลิตรไก่ตับอ่อน (0.16 mg / ml) และ 150 ไมโครลิตรของซีรั่มหนูถูกเพิ่มและบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในอ่างสั่น. หลังจากการรักษา deconjugase ตัวอย่างถูกความร้อนเป็นเวลา 10 นาทีที่ 100 องศาเซลเซียสหลังจากนั้นเย็นบนน้ำแข็งและหมุนเหวี่ยงที่ 3000G ในช่วง 20 นาทีที่ 4 ° C การทำให้บริสุทธิ์ของโฟเลตที่ได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับเอสพีอีตลับแซ็กโซโฟน 500 มก. / 3 มล.; 55 ไมครอน; 70 (Phenomenex, เยอรมนี) หมึกถูกปรับอากาศมี 2 เล่มของเฮกเซน 2 เล่มของเมทานอลและ 2 เล่มของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7 0.01 M) กับβ-mercaptoethanol (2 มล. / ลิตร) จากนั้น supernatants ของกลุ่มตัวอย่างที่ถูกนำมาใช้ในตลับหมึกที่ล้างด้วยเล่ม 3 เตียงของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มีβ-mercaptoethanol และแห้ง โฟเลตถูกชะ 2 มล. ของบัฟเฟอร์ชะประกอบด้วย 50 g / l โซเดียมคลอไรด์, 13.6 g / l acetate โซเดียม 10 กรัม / วิตามินซีลิตรและ 13.9 มล. / ลิตรβ-mercaptoethanol Eluate ถูกกรองบน ​​0.22 ไมครอนกรอง PVDF (VWR, เยอรมนี) สำหรับการวิเคราะห์ HPLC. วิเคราะห์โฟเลตได้ดำเนินการบน HPLC (Shimadzu อิงค์เกียวโตญี่ปุ่น) ควบคู่ไปกับการวิเคราะห์มวล quadrupole สาม (API 4000 Q-ดัก AB- Sciex, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) คอลัมน์ไฮเปอร์โคลน BDS C18 130 (150 × 3.2 มม 3 ไมโครเมตร Phenomenex, เยอรมนี) ถูกนำมาใช้ เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวแปรผสม 10 มล. / ลิตรน้ำกรดอะซิติก (ชะ A) และ acetonitrile HPLC เกรด (ชะ B) กรดที่มี 10 มล. / ลิตรของกรดอะซิติกที่อัตราการไหล 0.2 มล. / นาที ชะไล่โทนสีเริ่มต้นที่ 2% ของตัวชะ B เป็นเวลา 2 นาทีและจากนั้นเพิ่มขึ้นถึง 10% B ใน 5 นาที ลาดถูกจัดขึ้นที่ B 10% เป็นเวลา 3 นาทีและเพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรง 15% B 8 นาทีและ 100% B ในอีก 2 นาที องค์ประกอบคงที่เป็นเวลา 1 นาทีก่อนที่จะถูกลดลงไป 2% B ใน 2 นาที ในที่สุดการไล่ระดับสีที่จัดขึ้นที่ 2% B 9 นาที ปริมาณการฉีดได้ 10 ไมโครลิตร. ในช่วงแรก 5 นาทีและสุดท้าย 9 นาทีของโปรแกรมการไล่ระดับสีน้ำทิ้งคอลัมน์ถูกเบี่ยงเบนไปอ่างเก็บน้ำเสีย สเปกโตรมิเตอร์ที่ได้รับการดำเนินการในโหมด Ionisation electrospray บวกโดยใช้การตรวจสอบปฏิกิริยาหลาย (MRM) แรงดันไฟฟ้า Ionisation ถูกกำหนดให้ 5500 V ความดันก๊าซ Nebuliser 75 ตารางนิ้วความดันก๊าซเสริม 75 ปอนด์และความดันก๊าซม่าน 10 Psi อุณหภูมิของเครื่องทำความร้อนที่ได้รับการตั้งค่าให้ 550 ° C นอกจากนี้สารประกอบขึ้นอยู่กับเงื่อนไขที่ถูกนำเสนอในตารางที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3

วัดโฟเลต 2.3.1 . การวัดโดยวิธี HPLC ที่มีโฟเลต fluorimetric ตรวจจับหลังจาก precolumn derivatisation

โฟเลตวัดได้ดําเนินการในหลักการตาม ndaw et al . ( 2001 ) 30 มล. ( 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7 ) 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรของกรดแอสคอร์บิค ( เพิ่ม 10 กรัม ถั่วเขียว หรือผักโขมผง แล้วส่วนผสมจะถูกต้มใน 10 นาทีที่ 100 องศาหลังจากเย็นที่อุณหภูมิห้องในช่วงเวลา 15 นาที เสียงก็ปรับในขวดรูปกรวย 50 ml ; แยกเป็นระดับ 10 นาทีที่ 5000g

10 ml ของน่านที่พบ ซึ่ง 1 มิลลิลิตรของสารละลายตับอ่อนไก่ 5 mg / ml เป็นเพิ่ม ระยะเวลาบ่มเพิ่มขึ้นเป็น 120 นาทีที่ 37 ° C .

หลังจากบ่ม 5 มิลลิลิตร ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 0.4 กรัม / มิลลิลิตรของกรดแอสคอร์บิค15 มิลลิลิตร หรือบัฟเฟอร์ ( 0.066 M pH 7.8 ) 1 มิลลิลิตร และ 2-octanol 10 ml ของโซเดียมบอโรไฮไดรด์ ( 120 g / L ) มีการเพิ่ม หลังจากกวนโซลูชั่นได้รับอนุญาตให้ยืนระหว่าง 10 นาทีที่ pH 7.4 กับปรับ 5 M กรดอะซิติกและ 80 μ l 37% ฟอร์มัลดีไฮด์เป็นเพิ่ม หลังจากกวนต่อ 10 ml ของโซเดียมบอโรไฮไดรด์เพิ่มขึ้นและ pH ลดลงทันทีกว่า 1 กับกรดเกลือ 37% และส่วนผสมที่ได้รับอนุญาตให้ยืนเป็นเวลา 10 นาที ค่า pH แล้วปรับ 5 กับ 5 M โซเดียมไฮดรอกไซด์และอีก 10 ml ของโซเดียมบอโรไฮไดรด์เป็นเพิ่ม วิธีแก้ปัญหาคือให้ยืนในช่วง 20 นาทีและปริมาณ 100 มิลลิลิตรกับทริสปรับบัฟเฟอร์ ( 0.066 Mพีเอช 7.8 ) .

โฟเลตบริสุทธิ์กระทำโดยขี้รังแคที่มีโฟเลตผูกพันโปรตีน ปรับคอลัมน์ ทำได้โดย percolating 5 มิลลิลิตร ( 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7 ) ตัวอย่าง 10 มิลลิลิตร ( กรองก่อนด้วย millex AA ; 0.80 μ M ; 25 มม. ( มิลลิ , ฝรั่งเศส ) ถูกเทบนคอลัมน์ คอลัมน์ซัก 10 มิลลิลิตร ( 0.025 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7 )โฟเลตเป็นตัวอย่าง โดย percolating 8 มิลลิลิตรของสารละลาย DL บัตรแข็ง ( 0.02 ม. ) และกรดไตรฟลูออโรอะซิติก ( 0.02 ม. ) ผ่านคอลัมน์ในขวดรูปกรวยที่มีμ 200 ลิตร 250 มิลลิลิตรสารละลาย กรดแอสคอร์บิก 40 μลิตร NaOH มก. ( 0.6 กรัม / ลิตร ) ระดับเสียงปรับ 10 ml ด้วยสารละลาย hexane

โฟเลตวิเคราะห์ใน HPLC พร้อมกับ fluorimetric ( rf-10axl ตรวจจับ ,Shimadzu อิงค์ , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) fluorimetric ตรวจสอบบันทึกที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 295 nm และปล่อยความยาวคลื่น 365 นาโนเมตร เป็น lichrospher 100rp-18 ( 250 × 4.5 มม. 5 μ M , altech , ฝรั่งเศส ) พร้อมการ์ดคอลัมน์ lichrospher rp-18 ทุกยาม ( 7.5 × 4.6 มิลลิเมตร ; 5 μ M , altech , ฝรั่งเศส ) คือใช้เฟสเคลื่อนที่ที่ใช้เป็นส่วนผสมของน้ำที่มีกรด ( 10 ml / l ) และไน HPLC เกรด การใช้สีเริ่มต้นที่ 5% ของไนเพิ่มน้ำหนักถึง 100% ใน 25 นาทีแล้ว 100% ของไน 10 นาที ตามด้วยเส้นจะลดลง 5% ใน 10 นาที equilibration เป็นเวลา 10 นาทีและอัตราการไหลของเฟสเคลื่อนที่เป็น 0.8 มิลลิลิตรต่อนาทีและปริมาณการฉีด 100 μ L ( rychlik ,2004 ) โฟเลตปริมาณก็ขึ้นอยู่กับการสอบเทียบกับภายนอกและ monoglutamate 5-ch3-h4folate 5-ch3-h4folate diglutamate . เส้นโค้งสอบเทียบจาก 1.10 − 9 ถึง 6.10 − 8 M สำหรับ 5-ch3-h4folate monoglutamate ( R2 = โดย ) และจาก 5.10 − 9 ถึง 1.10 − 7 M สำหรับ 5-ch3-h4folate diglutamate ( R2 =

)วิธีของเรา สำหรับปริมาณโฟเลตที่ได้รับการยืนยันโดยการเปรียบเทียบกับผู้เขียน ndaw et al . ( 2001 ) จากบริษัทเรียล ( illkirch , ฝรั่งเศส ) สำหรับเรื่องนี้ ทั้งห้องปฏิบัติการกำหนดเนื้อหาโฟเลตในตัวอย่างเดียวกัน : ถั่วเขียวเป็นวัตถุดิบของชุด B .

2.3.2 . โฟเลตปริมาณไอโซโทปเสถียร dilution assay โดย

10 มิลลิลิตร นอกจากนี้ บัฟเฟอร์ ( ชาติอื่น กรัมต่อลิตร นอกจากนี้น้ำ 20 กรัม / ลิตร วิตามินซี , 1395 มล. / ล. บีตา - mercaptoethanol pH 5 ) คือเพิ่ม 1 กรัมของตัวอย่างดิน ( ผักโขม ถั่วเขียว ) หรือถั่ว 2 g " สีเขียว " ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย ส่วนผสมของมาตรฐานภายใน ประกอบด้วย [ 2h42h4 5-ch3-h4folate ] - [ ] - 2h42h4 5-hco-h4folate [ 2h42h4 ] - 10 HCO pteglu และ [ 2h42h4 ] - [ ] - pteglu และ h4folate 2h42h4 เพิ่ม ตัวอย่าง

เป็นคนเป็นเวลา 15 นาที และต้มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 100 องศาหลังจากเย็นบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที , 2 ml ของตับอ่อนไก่ ( 0.16 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ) และ 150 μผมของหนูเซรั่มเพิ่มบ่มค้างคืนที่ 37 ° C ในสั่นบาท

หลังจาก deconjugase รักษาจำนวนอุ่นสำหรับ 10 นาทีที่ 100 องศา C เย็นหลังจากนั้นบนน้ำแข็งและไฟฟ้าในช่วงนาทีที่ 4 3000g 20 องศา ผลิตสารโฟเลตมีการแซกตลับ 500 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร 55 μ m ; 3 ;70 กริพเพน ( phenomenex , เยอรมัน ) ตลับหมึกเป็นปรับอากาศ มี 2 เล่ม เฮกเซน , 2 ปริมาณเมทานอลและ 2 ปริมาณของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7 , 0.01 M ) กับบีตา - mercaptoethanol ( 2 ml / l ) แล้ว supernatants กลุ่มตัวอย่างที่ใช้กับตลับหมึก ล้าง มี 3 เตียงปริมาณฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มีบีตา - mercaptoethanol และเรียกใช้บริการ . โฟเลตเป็นตัวอย่างกับ 2 ml ของสารประกอบบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 50 กรัมต่อลิตร เกลือ , 13.6 กรัม / ลิตรโซเดียมอะซิเตต , 10 กรัม / ลิตร กรดแอสคอร์บิคและ 25.4 มล. / ล. บีตา - mercaptoethanol . สารละลาย ( eluate ) มีกรองในตัวกรอง ( 0.22 μ M PVDF อนาคีเมีย , เยอรมนี ) สำหรับการวิเคราะห์ HPLC .

โฟเลตวิเคราะห์ใน HPLC ( Shimadzu ) , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) คู่กับสามสี่ขั้วแมสสเปกโตรมิเตอร์ ( API 4000 q-trap , AB sciex ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกาเป็น• c18 130 คอลัมน์ไฮเปอร์โคลนให้ ( 150 × 3.2 มม. 3 μ M , phenomenex , เยอรมนี ) คือใช้ เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวแปรผสมสารละลายกรดอะซิติก 10 ml / l ( อี ) และไน HPLC Grade ( ตัว B ) 10 ml / l ปรับของกรดอะซิติก ที่อัตราการไหล 2 มล. / นาที ไล่ระดับ ( เริ่มต้นที่ 2 % ของตัว B 2 นาทีและจากนั้นเพิ่มขึ้นถึง 10 % B ใน 5 นาทีการไล่ระดับสีจัดขึ้น ณ 10 % B 3 นาทีและเพิ่มน้ำหนักถึง 15 % B ใน 8 นาที และ 100 % B ในอีก 2 นาที องค์ประกอบคงที่สำหรับ 1 นาทีก่อนที่จะถูกลดลงเหลือ 2 % B ใน 2 นาที สุดท้าย การไล่ระดับสีจัดขึ้น ณ 2 % B 9 นาที ปริมาณที่ฉีด 10 μ L .

ช่วงก่อน 5 นาที และเมื่อ 9 นาทีโปรแกรมลาด ,คอลัมน์น้ำถูกเบี่ยงเบนไปทิ้งอ่างเก็บน้ำ สเปกโตรมิเตอร์ ดำเนินการใน บวก วิธีพ่นละอองไฟฟ้า ionisation โหมดโดยใช้ปฏิกิริยาหลายการตรวจสอบ ( mrm ) ionisation แรงดันตั้งไว้ที่ 5500 V Nebuliser ความดันก๊าซ 75 psi , เสริมแรงดันแก๊ส 75 PSI และม่านก๊าซความดัน 10 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว . อุณหภูมิของฮีทเตอร์ตั้งไว้ถึง 550 องศาเพิ่มเติมสารขึ้นอยู่กับเงื่อนไขจะแสดงในตารางที่ 1