We investigated the interacting ami

We investigated the interacting amino acids critical for the stability and ATP binding of Mycobacterium tuberculosis PII protein through a series of site specific mutagenesis experiments. We assessed the effect of mutants using glutaraldehyde crosslinking and size exclusion chromatography and isothermal titration calorimetry. Mutations in the amino acid pair R60–E62 affecting central electrostatic interaction resulted in insoluble proteins. Multiple sequence alignment of PII orthologs displayed a conserved pattern of charged residues at these positions. Mutation of amino acid D97 to a neutral residue was tolerated whereas positive charge was not acceptable. Mutation of R107 alone had no effect on trimer formation. However, the combination of neutral residues both at positions 97 and 107 was not acceptable even with the pair at 60–62 intact. Reversal of charge polarity could partially restore the interaction. The residues including K90, R101 and R103 with potential to form H-bonds to ATP are conserved throughout across numerous orthologs of PII but when mutated to Alanine, they did not show significant differences in the total free energy change of the interaction as examined through isothermal titration calorimetry. The ATP binding pattern showed anti-cooperativity using three-site binding model. We observed compensatory effect in enthalpy and entropy changes and these may represent structural adjustments to accommodate ATP in the cavity even in absence of some interactions to perform the requisite function. In this respect these small differences between the PII orthologs may have evolved to suite species specific physiological niches.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราตรวจสอบกรดอะมิโน interacting สำคัญเสถียรภาพและ ATP รวมของมัยโคแบคทีเรียวัณโรค PII โปรตีนผ่านชุดของการทดลอง mutagenesis เฉพาะไซต์ เราประเมินผลของสายพันธุ์ที่ใช้ glutaraldehyde crosslinking และ chromatography แยกขนาด และการไทเทรต isothermal calorimetry กลายพันธุ์ในคู่กรดอะมิโน R60–E62 ผลโต้ตอบงานเซ็นทรัลให้โปรตีนไม่ละลายน้ำ หลายตำแหน่งลำดับของ PII orthologs แสดงรูปแบบการนำของตกค้างชำระในตำแหน่งเหล่านี้ การกลายพันธุ์ของ D97 กรดอะมิโนให้สารตกค้างที่เป็นกลางถูกสมในขณะที่ค่าบวกไม่ยอมรับ การกลายพันธุ์ของ R107 เดียว trimer ก่อผลไม่ได้ อย่างไรก็ตาม การรวมกันของกลางตกค้างทั้งที่ตำแหน่ง 97 และ 107 ไม่ยอมรับแม้จะ มีคู่ที่ 60–62 เหมือนเดิม กลับขั้วค่าธรรมเนียมบางส่วนสามารถคืนค่าการโต้ตอบ ตกค้างรวมถึง K90, R101 และ R103 มีศักยภาพที่จะฟอร์ม H-พันธบัตรการ ATP มีอยู่ตลอดทั้งหลาย orthologs PII แต่ เมื่อกลายไปอะลานีน พวกเขาไม่ได้แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการเปลี่ยนแปลงพลังงานเสรีของการโต้ตอบเป็นการตรวจสอบ โดยการไทเทรต isothermal calorimetry รูปผูก ATP พบ cooperativity ป้องกันใช้สามเว็บไซต์รวมโมเดล เราสังเกตผลชดเชยในความร้อนแฝงและเอนโทรปีการเปลี่ยนแปลง และเหล่านี้อาจแสดงถึงการปรับปรุงโครงสร้างเพื่อรองรับ ATP ในโพรงแม้ในของบางโต้ตอบเพื่อดำเนินการฟังก์ชันจำเป็น ในนี้ อาจมีพัฒนาแตก PII orthologs เหล่านี้เล็กไปห้องพันธุ์เฉพาะสรีรวิทยาตรงไหน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราตรวจสอบกรดอะมิโนมีปฏิสัมพันธ์ที่สำคัญสำหรับเสถียรภาพและเอทีพีผูกพันของโปรตีนเชื้อวัณโรค PII ผ่านชุดของการทดลองฉับเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจง เราประเมินผลกระทบของการกลายพันธุ์โดยใช้การเชื่อมขวาง glutaraldehyde และการยกเว้นขนาดและความร้อนโคไตเตรท isothermal การกลายพันธุ์ในคู่กรดอะมิโน R60-E62 มีผลกระทบต่อการทำงานร่วมกันไฟฟ้าสถิตกลางส่งผลให้โปรตีนที่ไม่ละลายน้ำ ลำดับการจัดเรียงหลาย orthologs PII แสดงรูปแบบการอนุรักษ์ตกค้างเรียกเก็บที่ตำแหน่งเหล่านี้ การกลายพันธุ์ของอะมิโน D97 กรดเป็นกลางที่เหลือได้รับการยอมรับในขณะที่ประจุบวกเป็นที่ยอมรับไม่ได้ การกลายพันธุ์ของ R107 คนเดียวมีผลต่อการก่อตัว trimer ไม่มี แต่การรวมกันของสารตกค้างที่เป็นกลางทั้งในตำแหน่ง 97 และ 107 เป็นที่ยอมรับไม่ได้แม้จะมีคู่ที่ 60-62 เหมือนเดิม กลับรายการค่าใช้จ่ายบางส่วนขั้วสามารถเรียกคืนการทำงานร่วมกัน ตกค้างรวมทั้ง K90, R101 และ R103 ที่มีศักยภาพในรูปแบบ H-พันธบัตรเอทีพีป่าสงวนตลอดทั่ว orthologs หลาย PII แต่เมื่อกลายพันธุ์ไป Alanine พวกเขาไม่ได้แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการเปลี่ยนแปลงพลังงานทั้งหมดฟรีของการมีปฏิสัมพันธ์กับการตรวจสอบผ่าน isothermal ไตเตรทความร้อน รูปแบบที่แสดงให้เห็นว่าเอทีพีผูกพันป้องกัน cooperativity ใช้สามรูปแบบเว็บไซต์ที่มีผลผูกพัน เราสังเกตผลการชดเชยในการเปลี่ยนแปลงเอนทัลปีและเอนโทรปีและสิ่งเหล่านี้อาจเป็นตัวแทนของการปรับโครงสร้างเพื่อรองรับเอทีพีในโพรงแม้ในกรณีที่ไม่มีการสื่อสารที่จะดำเนินการฟังก์ชั่นที่จำเป็น ในแง่นี้ความแตกต่างเล็ก ๆ เหล่านี้ระหว่าง orthologs PII อาจมีการพัฒนาสายพันธุ์ที่เหมาะกับช่องทางสรีรวิทยาที่เฉพาะเจาะจง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราทำการโต้ตอบกรดอะมิโนที่สำคัญต่อเสถียรภาพและ ATP ผูกพันของเชื้อวัณโรคที่ใช้โปรตีนผ่านชุดของเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงของการทดลอง เราประเมิน ผลกระทบของการกลายพันธุ์โดยใช้กลูตาราลดีไฮด์ และสารทำปฏิกิริยา ยกเว้นขนาดและความร้อนที่มีอุณหภูมิคงที่การกลายพันธุ์ในกรดอะมิโนคู่บวมน้ำ– e62 มีผลต่อไฟฟ้าสถิต ทำให้กลางปฏิสัมพันธ์โปรตีนละลายน้ำ หลายลำดับการใช้ orthologs แสดงรูปแบบของเสียตกค้างอนุรักษ์ในตำแหน่งเหล่านี้ การกลายพันธุ์ของกรดอะมิโน d97 กับสารตกค้างเป็นกลางคือทนในขณะที่ประจุบวกยังไม่เป็นที่ยอมรับ การกลายพันธุ์ของ r107 เพียงอย่างเดียวไม่มีผลต่อการเกิดไตรเมอร์ .อย่างไรก็ตาม การรวมกันของตกค้างที่เป็นกลาง ทั้งในตำแหน่ง 97 และ 107 ยังไม่เป็นที่ยอมรับ แม้แต่คู่ที่ 60 - 62 เหมือนเดิม การพลิกกลับขั้วของประจุสามารถเรียกคืนบางส่วนของปฏิสัมพันธ์ สารพิษตกค้าง รวมทั้ง k90 r101 , r103 ที่มีศักยภาพและฟอร์มการ h-bonds เอทีพีอนุรักษ์ตลอดทั่วมากมาย orthologs ของภาคเอกชน แต่เมื่อกลายพันธุ์กับอะลานีนพวกเขาไม่ได้แสดงความแตกต่างในทั้งหมดฟรีพลังงานเปลี่ยนปฏิสัมพันธ์โดยตรวจสอบผ่านความร้อนที่มีอุณหภูมิคงที่ เอทีพีผูกลายพบ anti cooperativity โดยใช้แบบจำลองมัดเว็บไซต์ 3เราพบชดเชยผลกระทบและการเปลี่ยนแปลงเอนทาลปีเอนโทรปีในและเหล่านี้อาจเป็นตัวแทนของการปรับเปลี่ยนโครงสร้างเพื่อรองรับ ATP ในโพรง แม้ในกรณีที่ไม่มีของการโต้ตอบแสดงฟังก์ชันที่จำเป็น ในความเคารพนี้เหล่านี้ความแตกต่างเล็กระหว่างภาคเอกชน orthologs อาจจะมีการพัฒนาชุดเฉพาะพืชชนิดน