3.4. Detection of EGFP expression i

3.4. Detection of EGFP expression in transformed cells by fluorescence
microscopy
EGFP expression in transformed cellswas visualized by fluorescence
microscopy,withwild type (WT) cells as a control. As readily seen from
results in Fig. 5a, by using a narrow band filter, positive transformed
cells introduced with EGFP reporter gene exhibited green fluorescence
as dots scattered in cytoplasm.WhereasWT cells, as expected, exhibited
no green fluorescence of EGFP (Fig. 5b) under the same excitation condition,
except with little background fluorescence derived from chloroplast
autofluorescence (visualized as slightly orange). This indicated
that the EGFP gene had been successfully expressed in transformed
cells. Although transformed cells also exhibited little background fluorescence,
green fluorescence fromEGFPwas strong enough to be distinguished
fromthe chlorophyll autofluorescence in live transformed cells.
We noticed that about half of the transformants showed GFP fluorescence.
As the fluorescence ofmicroscopic figures of those transformants
appeared very similar,we just showed one representative transformant
in Fig. 5.
3.5. Stability of EGFP gene in C. vulgaris
The stability of integrated DNAis an important criterion in the development
of a stable genetic system. After 16 consecutive subcultures (~8
months) subjected to alternating G418+/G418− selection pressure, the
EGFP was also detectable in transformants by both PCR analysis (data
not shown) and fluorescence microscopy (Fig. 5c), indicative of a good
genetic stability compared with other stable Chlorella genetic systems
[23,28,41]. This result, together with above characterization data, demonstrated
that a stable genetic transformation system was successfully
established in C. vulgaris for the transgene expression.
4. Discussion
There is currently expanding interest in the use of C. vulgaris for CO2
biomitigation. Nevertheless, the genetic toolbox for this alga is not well
developed due to the lack of a stable and efficient transformation system,
which to a large extent hampers the exploration of metabolic networks
for strain improvement by genetic engineering. It is therefore of
urgent necessity to develop a stable genetic system for C. vulgaris.
Prior to establishing a genetic system, a dominant selectable marker
is required to ensure the screening of transgenic cells from nontransformed
ones [40]. It is based on the sensitivity of organism to an
antibiotic and a resistant gene that confers the resistance to this antibiotic.
The natural resistance of Chlorella to many commonly used antibiotics
underscores the difficulties in developing proper selectable
markers for genetic transformation [28,37]. In the present study,
C. vulgaris proved to be insensitive to kanamycin even at high concentrations
(Table 1). However, in contrast to our result, Talebi et al. [23]
found that C. vulgaris was highly sensitive to kanamycin which was

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.4 การตรวจ EGFP นิพจน์ในเซลล์แปรโดย fluorescencemicroscopyEGFP cellswas แปร visualized โดย fluorescence นิพจน์microscopy, withwild พิมพ์เซลล์ (WT) เป็นตัวควบคุม ที่ชัดเจนจากผลของ 5a Fig. โดยวงแคบตัว แปลงบวกเซลล์ที่มียีน EGFP โปรแกรมรายงานจัดแสดง fluorescence สีเขียวเป็นจุดกระจายอยู่ในไซโทพลาซึม WhereasWT เซลล์ คาด จัดแสดงไม่มี fluorescence สีเขียวของ EGFP (Fig. 5b) ภายใต้เงื่อนไขในการกระตุ้นเดียวกันยกเว้น มีน้อยพื้น fluorescence จากคลอโรพลาสต์autofluorescence (visualized เป็นสีส้มเล็กน้อย) นี้ระบุว่า ยีน EGFP ได้รับเรียบร้อยแล้วแสดงในแปลงเซลล์ แม้ว่าเซลล์แปรรูปยังจัดแสดงน้อยพื้น fluorescencefromEGFPwas fluorescence สีเขียวแข็งแรงพอที่จะแตกต่างจาก autofluorescence คลอโรฟิลล์ในสดแปรรูปเซลล์เราพบว่า ประมาณครึ่งหนึ่งของ transformants แสดงให้เห็นว่า GFP fluorescenceเป็นตัวเลข ofmicroscopic fluorescence ของเหล่า transformantsปรากฏคล้าย เพียงดังที่พนักงาน transformant หนึ่งใน Fig. 53.5. เสถียรภาพของยีน EGFP ใน C. vulgarisความมั่นคงของ DNAis รวมเป็นเกณฑ์สำคัญในการพัฒนาพันธุกรรมระบบมีเสถียรภาพ หลังจาก subcultures ต่อเนื่อง 16 (~ 8เดือน) ต้องสลับ G418 + /mts G418− เลือกความดัน การนอกจากนี้ยังสามารถตรวจสอบได้ใน transformants โดยวิเคราะห์ทั้ง PCR (ข้อมูล EGFP ถูกไม่แสดง) และ fluorescence microscopy (Fig. 5 c), ตัวชี้ให้เห็นของดีเมื่อเทียบกับระบบอื่น ๆ พันธุ Chlorella เสถียรภาพความมั่นคงทางพันธุกรรม[23,28,41] แสดงผลลัพธ์นี้ ร่วมกันกับข้างต้นจำแนกข้อมูลว่า ระบบมีเสถียรภาพการแปลงพันธุกรรมไม่สำเร็จก่อตั้งขึ้นในราว vulgaris สำหรับนิพจน์ transgene4. สนทนามีกำลังขยายสนใจในการใช้ C. vulgaris สำหรับ CO2biomitigation อย่างไรก็ตาม เครื่องมือทางพันธุกรรมสำหรับ alga นี้ไม่ดีพัฒนาเนื่องจากขาดระบบการแปลงที่มีเสถียรภาพ และมีประสิทธิภาพซึ่งขอบเขตขนาดใหญ่ hampers สำรวจเครือข่ายที่มีการเผาผลาญต้องใช้การปรับปรุงโดยพันธุวิศวกรรม ดังนั้นของความจำเป็นเร่งด่วนเพื่อพัฒนาระบบพันธุกรรมมีเสถียรภาพสำหรับ C. vulgarisก่อนที่จะสร้างระบบพันธุกรรม การทำเครื่องหมายเลือกหลักต้องการให้คัดกรองเซลล์ถั่วเหลืองจาก nontransformedคน [40] มันขึ้นอยู่กับระดับความสำคัญของสิ่งมีชีวิตเพื่อการยาปฏิชีวนะและยีนทนที่ confers ที่ทนทานต่อยาปฏิชีวนะนี้ต้านทานทางธรรมชาติของ Chlorella กับยาปฏิชีวนะที่ใช้กันทั่วไปunderscores ความยากลำบากในการพัฒนาเฉพาะที่เลือกเครื่องหมายสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม [28,37] ในการศึกษาปัจจุบันC. vulgaris พิสูจน์ให้ซ้อนกับกานามัยซินแม้ที่ความเข้มข้นสูง(ตาราง 1) อย่างไรก็ตาม ตรงข้ามผลของเรา Talebi et al. [23]พบว่า vulgaris C. มีความไวสูงให้กานามัยซินซึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.4 การตรวจหาการแสดงออกในเซลล์ EGFP
เปลี่ยนโดยการเรืองแสงกล้องจุลทรรศน์แสดงออก
EGFP ใน cellswas
เปลี่ยนเรืองแสงมองเห็นโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ชนิดwithwild (น้ำหนัก) เซลล์เป็นตัวควบคุม
เท่าที่เห็นได้อย่างง่ายดายจากผลในรูป 5a
โดยใช้ตัวกรองวงแคบบวกเปลี่ยนเซลล์นำมาใช้กับยีนEGFP
นักข่าวแสดงการเรืองแสงสีเขียวเป็นจุดกระจายอยู่ในเซลล์cytoplasm.WhereasWT
เป็นไปตามคาดแสดงไม่มีการเรืองแสงสีเขียวของEGFP (รูป. 5b)
ภายใต้เงื่อนไขการกระตุ้นเดียวกันยกเว้นที่มีการเรืองแสงพื้นหลังเล็ก ๆ น้อย ๆ ที่ได้มาจากคลอโรพลา
Autofluorescence (มองเห็นเป็นสีส้มเล็กน้อย) แสดงให้เห็นว่ายีน EGFP ได้รับการแสดงที่ประสบความสำเร็จในการเปลี่ยนเซลล์ แม้ว่าเซลล์เปลี่ยนยังแสดงการเรืองแสงพื้นหลังเล็ก ๆ น้อย ๆfromEGFPwas เรืองแสงสีเขียวแข็งแรงพอที่จะประสบความสำเร็จfromthe Autofluorescence คลอโรฟิลในเซลล์เปลี่ยนสด. เราพบว่าประมาณครึ่งหนึ่งของ transformants แสดงให้เห็นการเรืองแสง GFP. ในฐานะที่เป็นเรืองแสง ofmicroscopic ร่างของ transformants เหล่านั้นปรากฏคล้ายกันมากเราพบเพียงหนึ่ง transformant ตัวแทนในรูป 5. 3.5 เสถียรภาพของยีน EGFP ใน C. vulgaris ความมั่นคงของบูรณาการ DNAis เกณฑ์สำคัญในการพัฒนาของระบบทางพันธุกรรมที่มีเสถียรภาพ หลังจากวันที่ 16 วัฒนธรรมติดต่อกัน (~ 8 เดือน) ภายใต้การสลับ G418 + / G418- ดันเลือกที่EGFP ก็ยังตรวจพบใน transformants ทั้งการวิเคราะห์ PCR (ข้อมูลไม่แสดง) และกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (รูป. 5c) บ่งบอกถึงความดีความมั่นคงทางพันธุกรรมเมื่อเทียบกับระบบที่มีเสถียรภาพทางพันธุกรรม Chlorella อื่น ๆ[23,28,41] ผลที่ได้นี้ร่วมกับข้อมูลลักษณะข้างต้นแสดงให้เห็นว่าระบบการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่มั่นคงประสบความสำเร็จได้รับการก่อตั้งขึ้นในvulgaris ซีสำหรับการแสดงออกยีน. 4 การอภิปรายขณะนี้การขยายตัวที่น่าสนใจในการใช้งานของซีจะ vulgaris สำหรับ CO2 biomitigation อย่างไรก็ตามทางพันธุกรรมกล่องเครื่องมือสำหรับสาหร่ายนี้จะไม่ดีการพัฒนาอันเนื่องมาจากการขาดระบบการเปลี่ยนแปลงมั่นคงและมีประสิทธิภาพ, ซึ่งในระดับใหญ่ hampers การสำรวจของเครือข่ายการเผาผลาญในการปรับปรุงสายพันธุ์โดยพันธุวิศวกรรม ดังนั้นจึงเป็นเรื่องของความจำเป็นเร่งด่วนที่จะพัฒนาระบบทางพันธุกรรมที่มั่นคงสำหรับ vulgaris ซี. ก่อนที่จะมีการสร้างระบบทางพันธุกรรมเครื่องหมายเลือกที่โดดเด่นจะต้องเพื่อให้แน่ใจว่าการตรวจคัดกรองของเซลล์ยีนจาก nontransformed คน [40] มันขึ้นอยู่กับความไวของสิ่งมีชีวิตที่จะได้ยาปฏิชีวนะและยีนที่ทนฟาโรห์ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะนี้. ความต้านทานตามธรรมชาติของคลอเรลล่าไปหลายยาปฏิชีวนะที่ใช้กันทั่วไปขีดความยากลำบากในการพัฒนาเลือกที่เหมาะสมเครื่องหมายสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม[28,37] ในการศึกษาปัจจุบันซี ขิงพิสูจน์แล้วว่าเป็นความรู้สึกที่กานามัยซินแม้ในความเข้มข้นสูง(ตารางที่ 1) แต่ในทางตรงกันข้ามกับผลของเรา Talebi et al, [23] พบว่าซีขิงก็มีความไวสูงเพื่อกานามัยซินซึ่งเป็น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.4 . การตรวจหาการแสดงออกในเซลล์ โดยการเปลี่ยน egfp
/
egfp การแสดงออกในแปลง cellswas มองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
, ประเภท withwild ( WT ) เซลล์เป็นตัวควบคุม พร้อมเห็นจาก
ผลลัพธ์ในรูปที่หลากหลาย โดยการใช้ตัวกรอง วงแคบ บวกแปลง
เซลล์แนะนำกับนักข่าวจีน egfp มีสีเขียวเรืองแสง
เป็นจุดกระจายอยู่ใน cytoplasmwhereaswt เซลล์ , ตามที่คาดไว้ , การจัดแสดง
ไม่มีสีเขียวเรืองแสงของ egfp ( มะเดื่อ 5B ) ภายใต้เงื่อนไขแบบเดียวกัน ยกเว้นพื้นหลังเรืองแสงเล็กน้อย

autofluorescence ( มองเห็นได้จากคลอโรพลาสต์เป็นเล็กน้อยสีส้ม ) โดย
ที่ egfp ยีนได้เรียบร้อยแล้วโดยเปลี่ยน
เซลล์ แม้ว่าแปลงเซลล์ยังจัดแสดงเรืองพื้นหลังน้อย
fromegfpwas เรืองแสงสีเขียวที่แข็งแกร่งพอ จะแตกต่างจากในไลฟ์คลอโรฟิลล์ autofluorescence

เปลี่ยนเซลล์ เราสังเกตว่าประมาณครึ่งหนึ่งของพลาสมิดพบ GFP เรืองแสง .
เป็นเรือง ofmicroscopic ตัวเลขของ transformants ที่
ปรากฏคล้ายกันมาก เราพบว่าหนึ่งในรูปตัวแทน /
5
3 . เสถียรภาพของยีน egfp vulgaris
C .ความมั่นคงแบบบูรณาการ dnais เกณฑ์สำคัญในการพัฒนา
ของระบบพันธุกรรมคงที่ หลังจาก 16 subcultures ติดต่อกัน ( ~ 8
เดือน ) ต้องสลับ g418 / g418 −เลือกความดัน ,
egfp ยังตรวจพบในพลาสมิดทั้งเทคนิคการวิเคราะห์ ( ข้อมูล
ไม่แสดง ) และกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ( รูปที่ 5 ) ซึ่งดี
เสถียรภาพทางพันธุกรรมเมื่อเทียบกับ [ ระบบพันธุกรรมสาหร่าย
คงที่อื่น ๆ 23,28,41 ] ผลนี้ , พร้อมกับข้อมูลคุณสมบัติข้างต้น พบว่าระบบการถ่ายยีนมั่นคง

ได้ก่อตั้งขึ้นใน C . vulgaris สำหรับยีนการแสดงออก .
4 ขณะนี้มีการอภิปราย
สนใจใช้ C แบบ CO2
biomitigation . อย่างไรก็ตามกล่องเครื่องมือทางพันธุกรรมสำหรับสาหร่ายไม่สบาย
พัฒนาเนื่องจากขาดเสถียรภาพและมีประสิทธิภาพระบบการเปลี่ยนแปลง
ที่ขอบเขตขนาดใหญ่ hampers สำรวจสลายเครือข่าย
สำหรับการปรับปรุงสายพันธุ์โดยวิธีทางพันธุวิศวกรรม มันจึงเป็นความจำเป็นเร่งด่วนของ
เพื่อพัฒนาระบบพันธุกรรมคงที่ C . vulgaris .
ก่อนที่จะสร้างระบบทางพันธุกรรม ,
เครื่องหมายเลือกเด่นจะต้องมั่นใจในการคัดกรองพันธุกรรมเซลล์จาก nontransformed
คน [ 40 ] มันขึ้นอยู่กับความไวของสิ่งมีชีวิตที่มียีนที่ต้านทานยาปฏิชีวนะ
และที่เกี่ยวข้องกับความต้านทานยาปฏิชีวนะ .
ต้านทานธรรมชาติของสาหร่ายมากนิยมใช้ยาปฏิชีวนะ
ขีดความยากในการพัฒนาเครื่องหมายเลือก
ที่เหมาะสมสำหรับการถ่ายทอดทางพันธุกรรม [ 28,37 ]ในการศึกษา
C . vulgaris พิสูจน์ด้านชา kanamycin แม้ที่ความเข้มข้นสูง
( ตารางที่ 1 ) แต่ในทางตรงกันข้ามผลของเรา talebi et al . [ 23 ]
พบว่า C . vulgaris คือความไวสูงซึ่งเป็นปัจจัย