- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
SH-SY5Y neuronal cells weregrown to
SH-SY5Y neuronal cells were
grown to confluence in a-MEM. Media was aspirated and the cells were washed twice with 1
mL of ice cold HBSS. HBSS was aspirated and 0.6 mL ice cold dH2O was added to the cells.
The cells were scraped from the flask/dish and suspended in dH2O. The cell suspension was
sonicated for 15 s on ice and 100 pL of the suspension was used to determine the protein
content. The remaining lysate was added to a microcentrifuge tube and an equal volume of
0.4 N perchloric acid was added, followed by incubation on ice for 5 min. Samples were centrifuged at 5,000 x g and the supernatant transferred to new microcentrifuge tubes. 100 pL of each sample was added to a conical micro-autosampler vial and kept at 4 °C in
5 the autosampler cooling tray. 10 pL of each of these samples was injected into the HPLC
system.
The separation of redox and เมธิเลชัน pathway metabolites was accomplished
using an Agilent Eclipse XDB-C8 analytical column (3 x 150 mm; 3.5 pm) and an Agilent
Eclipse XDB-C8 (4.6 x 12.5 mm; 5 pm) guard column. Two mobile phases were used.
10 Mobile Phase A: 0% acetonitrile, 25 mM sodium phosphate, 1.4 mM 1-octanesulfonic acid,
adjusted to pH 2.65 with phosphoric acid. Mobile Phase B: 50% acetonitrile. The flow rate was initially set at 0.6 mL/min and a step gradient was used: 0-9 min 0% B, 9-19 min 50% B, 19-30 min 50% B. The column was then equilibrated with 5% B for 12 min prior to the
next run. Temperature was maintained at 27 °C. The electrochemical detector used is an 15 ESA CoulArray with BDD Analytical cell Model 5040 and the operating potential was set at
1500 mV. Sample concentrations were determined from the peak areas of metabolites using
standard calibration curves and ESA-supplied HPLC software. Sample concentrations were
normalised against protein content. In some cases samples were diluted in mobile phase as
needed or up to 50 pl of sample was injected to assure that thiol levels were within the
20 range of the standard curve. The results are shown in รูป 7.
Example 7: Effect of BCM-7 on DNA เมธิเลชัน levels
Global DNA เมธิเลชัน levels induced by BCM-7 were investigated using methyl-
CpG binding domain (MBD) protein-enriched genome sequencing (MBD-seq) as described
25 previously (Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014), whereas mRNA translation microarray data
was obtained using Agilent V3 microarray chip, from non-treated control SH-SY5Y cells and cells treated for 4 hours with 1 pM BCM-7.
Genomic DNA was extracted from samples with the Easy DNA kit (Invitrogen K1800-
01) using the appropriate protocol for cell lines. Fragmentation was performed on Covaris 30 S2 with the following settings: duty cycle 10%, intensity 5, 200 cycles per burst during 200
sec. Fragments were obtained having an average length of 200 bp. The power mode is
frequency sweeping, temperature 6-8 °C, water level 12. A maximum of 5 pg was loaded in
130 pl Tris- EDTA in a microtube with AFA intensifier. For samples with less DNA input
(down to 500 ng) the DNA was diluted 1:5 in TrisEDTA. DNA with an input from 5-3 pg was
35 analysed on the Agilent 2100 using a DNA 1000 chip. DNA with an input lower than 3 pg
was concentrated in a rotary evaporator to 25 pl and the fragment distribution was checked
on a high sensitivity DNA chip. Methylated DNA was captured using the MethylCap kit
(Diagenode, Belgium). The yield was typically between 0.5 and 8 ng of total captured DNA.
Fragments were subsequently sequenced using an Illumina Genome Analyzer II. The
concentrations of fragmented and captured DNA were determined on a Fluostar Optima plate reader with the Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) at 480/520nm.
To prepare the DNA library, a DNA Sample Prep Master Mix Set 1 (NEB E6040) was 5 used in combination with a Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit (96 samples, Illumina
PE-400-1001). The entire fragmented DNA was utilised and followed the NEB protocols, using the multiplexing sequencing adapters provided in the Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit. Size selection of the library was carried out on a 2% agarose gel (Low Range Ultra Agarose Biorad 161-3107). A 1Kb Plus ladder (Invitrogen 10787-018) was used and a
10 gel was run at 120 V for 2 hrs. A fragment of 300 bps +/- 50bps was excised and eluted on
a Qiagen Gel Extraction Kit column (Qiagen 28704) and eluted in 23 pl EB.
The Illumina library amplification index protocol was used with the following
alterations: 22 pl DNA was used and performed 21 cycles run. The sample was purified on
a Qiaquick PCR Purification column (Qiagen 28101) and eluted in 50 pl EB, 1:5 diluted, and
15 concentrated in a rotary evaporator to 10 pl. 1 pl was applied to a Agilent 2100 HS DNA
chip and the concentration was determined by smear analysis on the Agilent 2100. The
samples were diluted to 10 nM. After denaturation with NaOH the samples were diluted to
16 pM. The Paired-End flow cell was prepared according to the Cluster Station User Guide.
Sequencing was performed according to the HiSeq user guide (performing a Multiplexed PE
20 Run), with 2 x 51 cycles for the paired end runs.
Whole genome DNA MBD-seq revealed differentially methylated transcripts (DMTs),
as defined by false discovery rate (FDR)
grown to confluence in a-MEM. Media was aspirated and the cells were washed twice with 1
mL of ice cold HBSS. HBSS was aspirated and 0.6 mL ice cold dH2O was added to the cells.
The cells were scraped from the flask/dish and suspended in dH2O. The cell suspension was
sonicated for 15 s on ice and 100 pL of the suspension was used to determine the protein
content. The remaining lysate was added to a microcentrifuge tube and an equal volume of
0.4 N perchloric acid was added, followed by incubation on ice for 5 min. Samples were centrifuged at 5,000 x g and the supernatant transferred to new microcentrifuge tubes. 100 pL of each sample was added to a conical micro-autosampler vial and kept at 4 °C in
5 the autosampler cooling tray. 10 pL of each of these samples was injected into the HPLC
system.
The separation of redox and เมธิเลชัน pathway metabolites was accomplished
using an Agilent Eclipse XDB-C8 analytical column (3 x 150 mm; 3.5 pm) and an Agilent
Eclipse XDB-C8 (4.6 x 12.5 mm; 5 pm) guard column. Two mobile phases were used.
10 Mobile Phase A: 0% acetonitrile, 25 mM sodium phosphate, 1.4 mM 1-octanesulfonic acid,
adjusted to pH 2.65 with phosphoric acid. Mobile Phase B: 50% acetonitrile. The flow rate was initially set at 0.6 mL/min and a step gradient was used: 0-9 min 0% B, 9-19 min 50% B, 19-30 min 50% B. The column was then equilibrated with 5% B for 12 min prior to the
next run. Temperature was maintained at 27 °C. The electrochemical detector used is an 15 ESA CoulArray with BDD Analytical cell Model 5040 and the operating potential was set at
1500 mV. Sample concentrations were determined from the peak areas of metabolites using
standard calibration curves and ESA-supplied HPLC software. Sample concentrations were
normalised against protein content. In some cases samples were diluted in mobile phase as
needed or up to 50 pl of sample was injected to assure that thiol levels were within the
20 range of the standard curve. The results are shown in รูป 7.
Example 7: Effect of BCM-7 on DNA เมธิเลชัน levels
Global DNA เมธิเลชัน levels induced by BCM-7 were investigated using methyl-
CpG binding domain (MBD) protein-enriched genome sequencing (MBD-seq) as described
25 previously (Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014), whereas mRNA translation microarray data
was obtained using Agilent V3 microarray chip, from non-treated control SH-SY5Y cells and cells treated for 4 hours with 1 pM BCM-7.
Genomic DNA was extracted from samples with the Easy DNA kit (Invitrogen K1800-
01) using the appropriate protocol for cell lines. Fragmentation was performed on Covaris 30 S2 with the following settings: duty cycle 10%, intensity 5, 200 cycles per burst during 200
sec. Fragments were obtained having an average length of 200 bp. The power mode is
frequency sweeping, temperature 6-8 °C, water level 12. A maximum of 5 pg was loaded in
130 pl Tris- EDTA in a microtube with AFA intensifier. For samples with less DNA input
(down to 500 ng) the DNA was diluted 1:5 in TrisEDTA. DNA with an input from 5-3 pg was
35 analysed on the Agilent 2100 using a DNA 1000 chip. DNA with an input lower than 3 pg
was concentrated in a rotary evaporator to 25 pl and the fragment distribution was checked
on a high sensitivity DNA chip. Methylated DNA was captured using the MethylCap kit
(Diagenode, Belgium). The yield was typically between 0.5 and 8 ng of total captured DNA.
Fragments were subsequently sequenced using an Illumina Genome Analyzer II. The
concentrations of fragmented and captured DNA were determined on a Fluostar Optima plate reader with the Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) at 480/520nm.
To prepare the DNA library, a DNA Sample Prep Master Mix Set 1 (NEB E6040) was 5 used in combination with a Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit (96 samples, Illumina
PE-400-1001). The entire fragmented DNA was utilised and followed the NEB protocols, using the multiplexing sequencing adapters provided in the Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit. Size selection of the library was carried out on a 2% agarose gel (Low Range Ultra Agarose Biorad 161-3107). A 1Kb Plus ladder (Invitrogen 10787-018) was used and a
10 gel was run at 120 V for 2 hrs. A fragment of 300 bps +/- 50bps was excised and eluted on
a Qiagen Gel Extraction Kit column (Qiagen 28704) and eluted in 23 pl EB.
The Illumina library amplification index protocol was used with the following
alterations: 22 pl DNA was used and performed 21 cycles run. The sample was purified on
a Qiaquick PCR Purification column (Qiagen 28101) and eluted in 50 pl EB, 1:5 diluted, and
15 concentrated in a rotary evaporator to 10 pl. 1 pl was applied to a Agilent 2100 HS DNA
chip and the concentration was determined by smear analysis on the Agilent 2100. The
samples were diluted to 10 nM. After denaturation with NaOH the samples were diluted to
16 pM. The Paired-End flow cell was prepared according to the Cluster Station User Guide.
Sequencing was performed according to the HiSeq user guide (performing a Multiplexed PE
20 Run), with 2 x 51 cycles for the paired end runs.
Whole genome DNA MBD-seq revealed differentially methylated transcripts (DMTs),
as defined by false discovery rate (FDR)
0/5000
SH SY5Y neuronal เซลล์ได้เติบโตขึ้นไปบรรจบในการหน่วยความจำ สื่อถูก aspirated และเซลล์ถูกล้างสองครั้ง ด้วย 1mL ของน้ำแข็งเย็น HBSS HBSS ถูก aspirated และ 0.6 mL น้ำแข็งเย็น dH2O ถูกเพิ่มไปยังเซลล์เซลล์ที่ขูดจากหนาว/จาน และถูกระงับใน dH2O การระงับเซลล์ถูกsonicated 15 s บนน้ำแข็งและ 100 ใช้ pL ของการระงับการตรวจสอบโปรตีนเนื้อหา เหลือ lysate เพิ่มหลอด microcentrifuge และปริมาณเท่ากัน0.4 กรด perchloric N เพิ่ม ตาม ด้วยฟักตัวบนน้ำแข็งสำหรับตัวอย่าง 5 นาทีได้ centrifuged ที่ 5000 x g และ supernatant โอนย้ายไปที่ใหม่ microcentrifuge หลอด 100 เพิ่มคอนแทคไมโคร autosampler ทรงกรวย และเก็บที่ 4 ° C ใน pL ของแต่ละอย่าง5 autosampler เย็นถาด 10 pL ของแต่ละอย่างเหล่านี้ถูกฉีดเข้าไปในการ HPLCระบบแยกของ metabolites ทางเดิน redox และเมธิเลชันได้สำเร็จใช้ Agilent Agilent คราส XDB-C8 วิเคราะห์คอลัมน์ตัว (3 x 150 มม. 15.00 17.00 น.)คราสคอลัมน์ยาม XDB-C8 (4.6 x 12.5 mm, 17.00 น) ระยะการเคลื่อนที่สองถูกใช้Acetonitrile 0% a:ระยะการเคลื่อนที่ 10, 25 มม.โซเดียมฟอสเฟต กรด 1.4 มม. 1 octanesulfonicปรับ pH 2.65 มีกรดฟอสฟอริก B:ระยะการเคลื่อนที่ 50% acetonitrile อัตราการไหลตั้งค่าเริ่มต้นที่ 0.6 mL/min และใช้ไล่ขั้นตอน: 0-9 นาที 0% B, 9-19 นาที 50% B, 19 นาที 50% เกิด คอลัมน์ถูกแล้ว equilibrated 5% B สำหรับ 12 นาทีก่อนทำงานต่อไป มีรักษาอุณหภูมิที่ 27 องศาเซลเซียส ตรวจจับไฟฟ้าที่ใช้คือ การ CoulArray ประเทศ 15 กับ BDD วิเคราะห์เซลล์ 5040 รุ่น และศักยภาพการปฏิบัติงานถูกตั้งค่าที่ 1500 mV มีกำหนดความเข้มข้นของตัวอย่างจากพื้นที่สูงสุดของ metabolites ที่ใช้ เส้นโค้งการปรับเทียบมาตรฐานและซอฟต์แวร์ HPLC ให้ประเทศ มีความเข้มข้นของตัวอย่าง normalised กับโปรตีน ในบางกรณี ตัวอย่างถูกทำให้เจือจางในเฟสเคลื่อนที่เป็น จำเป็น หรือถึง 50 pl ของอย่างถูกฉีดเพื่อให้มั่นใจว่า ระดับ thiol ได้ภายในการช่วง 20 เส้นโค้งมาตรฐาน ผลลัพธ์จะแสดงในรูป 7ตัวอย่างที่ 7: ผลของ BCM-7 ระดับเมธิเลชันดีเอ็นเอระดับเมธิเลชันดีเอ็นเอระดับโลกเกิดจาก BCM-7 ถูกสอบสวนใช้ methyl-ประเภทวัสดุสิ้นเปลืองรวมโดเมน (MBD) อุดมไปโปรตีนจีโนมลำดับ (MBD-ลำดับ) ดังที่25 ก่อนหน้านี้ (Trivedi เมตร et al., Mol. Pharm. 2014), ในขณะที่ข้อมูล microarray แปลของ mRNAไม่ได้ใช้ชิป microarray Agilent V3 ควบคุมไม่ได้ถือว่าดี SY5Y เซลล์และเซลล์ที่รับการรักษา 4 ชั่วโมง 13.00 น. BCM-7Genomic DNA ที่สกัดจากตัวอย่างที่มีชุดง่ายดีเอ็นเอ (Invitrogen K1800- 01) ใช้โพรโทคอลที่เหมาะสมสำหรับบรรทัดของเซลล์ การกระจายตัวของทำตาม Covaris 30 S2 กับการตั้งค่าต่อไปนี้: ภาษีรอบ 10% ความเข้ม 5, 200 รอบต่อระเบิดระหว่าง 200 บางส่วนของวิได้รับมีความยาวเฉลี่ย 200 bp เป็นโหมดการใช้พลังงาน ความถี่กวาด อุณหภูมิ 6-8 ° C น้ำระดับ 12 สูงสุด 5 ถูกโหลดใน pg 130 pl ตรี - EDTA ใน microtube กับ AFA intensifier สำหรับตัวอย่างที่มีดีเอ็นเอน้อยเข้า (ลงไป 500 ng) ดีเอ็นเอถูกแตกออก 1:5 ใน TrisEDTA มีดีเอ็นเอกับอินพุตจาก pg 5-335 analysed บน 2100 Agilent ที่ใช้ชิป 1000 ดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอกับอินพุตต่ำกว่า 3 pgเข้มข้นใน evaporator โรตารี่กับ 25 pl และจำหน่ายส่วนตรวจสอบในความไวสูงดีเอ็นเอชิ ดีเอ็นเอ methylated ถูกจับใช้ชุด MethylCap(Diagenode เบลเยียม) ผลตอบแทนได้โดยทั่วไประหว่าง 0.5 และ 8 ng ของดีเอ็นเอจับรวมกระจายตัวได้ในเวลาต่อมาเรียงลำดับใช้ II การวิเคราะห์จีโนม Illumina การ ที่ความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่มีการกระจายตัว และจับถูกกำหนดบนเครื่องอ่านแผ่นพติ Fluostar กับ dsDNA มัน Quant PicoGreen Assay Kit (Invitrogen P7589) ที่ 480/520nmเตรียมรีดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอตัวอย่างเตรียมหลักผสมตั้ง 1 (NEB E6040) ถูกใช้ร่วมกับมัลติเพล็กซ์แบบตัวอย่างเตรียม Oligo ชุด 5 (96 ตัวอย่าง IlluminaPE-400-1001) ดีเอ็นเอที่มีการกระจายตัวทั้งหมดถูกใช้ และตามโพรโทคอลที่ NEB ใช้อะแดปเตอร์ลำดับ multiplexing ที่ให้ในการมัลติเพล็กซ์แบบตัวอย่างเตรียม Oligo ชุด เลือกขนาดของไลบรารีถูกดำเนินบน 2% agarose เจ (ต่ำช่วง Ultra Agarose Biorad 161-3107) ฐานที่ 1 บวกใช้บันได (10787-018 Invitrogen) และรันที่ 120 V 2 เจล 10 ชั่วโมง Excised และ eluted ในส่วนของ bps 300 +/-50bpsคอลัมน์ Qiagen เจแยกชุด (Qiagen 28704) และ eluted ใน 23 pl EB ด้วยใช้โพรโทคอดัชนีขยายไลบรารี Illumina กับต่อไปนี้เปลี่ยนแปลง: 22 pl DNA ถูกใช้ และดำเนินการ 21 รอบการทำงาน ตัวอย่างที่บริสุทธิ์ในคอลัมน์ Qiaquick PCR ฟอก (Qiagen 28101) และ 50 eluted ใน pl EB, 1:5 ผสม และเข้มข้น 15 ใน evaporator โรตารี่ 10 pl. 1 pl ถูกใช้กับดีเอ็นเอในการ HS Agilent 2100ชิพและความเข้มข้นที่ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์การเลอะเปื้อน Agilent 2100 ที่ตัวอย่างถูกทำให้เจือจาง 10 nM หลัง denaturation กับ NaOH ตัวอย่างถูกทำให้เจือจางเพื่อ16 pM เซลล์ไหลสิ้น Paired ได้เตรียมตามคู่มือการใช้สถานีของคลัสเตอร์ทำตามคำแนะนำผู้ใช้ HiSeq (PE ที่ Multiplexed ทำลำดับเรียกใช้ 20), มี 2 x 51 รอบการทำงานสิ้นสุดจัดเป็นคู่ทั้งจีโนม MBD-ลำดับดีเอ็นเอเปิดเผย differentially methylated ใบแสดงผล (DMTs),ตามที่กำหนดไว้ตามอัตราการค้นพบเท็จ (FDR) < 0.1 และการวิเคราะห์ความแปรปรวนตามแบบเฉพาะกิจลงนักเรียนทีทดสอบ (p < 0.05) ใบแสดงผลรวมทั้งยีนและ RNAs ไม่ใช่รหัสที่ differentiallymethylated/ทับ ศัพท์ เหนือพันธุกรรมเปลี่ยนแปลงเป็นการเปลี่ยนแปลงการ transcription25 ที่เหนี่ยวนำ โดย BCM-7 ในเฉพาะหลักชีวภาพ หรือฟังก์ชันที่เกี่ยวข้องได้ประเมินโดยใช้การวิเคราะห์การประดิษฐ์คิดค้นทางเดิน (IPA) ระบุเครื่องมือและหลักอย่างมีระดับผลกระทบสูงสุด มีแสดงผลในตาราง 4 การเปลี่ยนแปลงในสถานะเหนือพันธุกรรมของยีนสำหรับเผาผลาญแล็กโทสแล็กโทสสังเคราะห์ยังมีรายงานการเปลี่ยนแปลงภายใต้ BCM7 ดังที่แสดงในรูปที่ 8 และ 9ตาราง 4: รายการของ Differentially Methylated ใบแสดงผลภายใต้อิทธิพลของ BCM-7ภววิทยาหน้าที่ / ภววิทยายีนแล็กโทสย่อยอาหารเผาผลาญทางเดิน Biosynthetic ย่อยแลคโตส กาแล็กโทสกรดในกระเพาะอาหารเผาผลาญหลั่งตัวอย่างที่ 8: ผลของ BCM-7 ระดับแลคเตสในลำไส้เล็กหนูพยักหน้า 20 (ชาย และหญิง) ได้เริ่มดำเนินการในอาหารที่อุดมไปในเบต้าเคซีนอัลหรือโปรตีนนม A2 จาก weaning อาหารเหล่านี้ทำ โดยพิเศษเนื้อหาสรุปเนชั่ลแนล จำกัด(ออสเตรเลีย) ให้เพียงพอองค์ประกอบและคุณค่าทางโภชนาการ Cohorts ของหนู (n = 10) จากแต่ละเพศและอาหารที่ถูก euthanased ในสัปดาห์ที่ 10 หรือสัปดาห์ที่ 20 เวลาชำแหละตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกรวบรวม และจัดเก็บไว้ที่-80 ° C ใน RNAlaterm หนูพยักหน้า 40 ได้25 ตามในการศึกษานี้: 10 สำหรับแต่ละกลุ่ม (ชาย/หญิง: อัล/A2)อาร์เอ็นเอจากเซลล์วัฒนธรรมสำหรับการวิเคราะห์เสียงของราชบัณฑิตยสถานอาร์เอ็นเอที่แยกโดยใช้ชุด RNAqueous ®-4PCR จาก Ambion (Austin, TX) ขั้นตอนเหมือนกันตามที่อธิบายไว้ โดยโปรโตคอลของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอที่แยกได้รักษา ด้วย DNase บริสุทธิ์อาร์เอ็นเอตามนับอาร์เอ็นเอโดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่างเป็น ND-1000 NanoDrop cDNA ถูก30 synthesised ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยใช้การสังเคราะห์ cDNA สแตรนด์แรกจากโรช(อินเดียนาโพลิส IN) อาร์เอ็นเอ (มก. 1), dNTP ผสม (1 mM), ไพรเมอร์ hexamer สุ่ม (60 mM), มีพออณูชีววิทยาเกรดเอท 20 เพิ่มเพื่อให้ได้ปริมาณตัวอย่างสุดท้ายของ 13มล ตัวอย่างแต่ละ denatured 5 นาทีที่ 65 ° C และจากนั้น วางบนน้ำแข็งTranscriptor RT (20 หน่วย/rill) (Roche), สารยับยั้งป้องกัน RNase (40 Wm') (Roche), 535 ชั้นบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาย้อนกลับ Transcriptase Transcriptor (Roche), และชีวโมเลกุลเอท 20 เพิ่ม และปรับปริมาตรสุดท้ายได้ 20 ml นี้ถูกตาม ด้วยการบ่มเพาะวิสาหกิจใน Thermocycler การ PTC (วิจัย MJ, St. Bruno, QC แคนาดา) ได้ที่ 25 ° C 10 นาที และ 55 องศาเซลเซียส 30 นาที สุดท้ายนี้ เอ็นไซม์ transcriptase กลับถูกห้าม โดยบ่มที่ 85 ° C 5 นาทีทำการทดสอบ qRT PCR ตามตัวอย่าง triplicate ที่ใช้ LightCycler 480เครื่อง qRT PCR จากโรช (Trivedi et al., Mol. Pharmcol. 2014) qRT PCR ได้ใช้ 5 ml ของ cDNA ต้นแบบ ความรู้สึก 10 มม. และ antisense ไพร เมอร์ 10 ml SYBRสีเขียวผมหลักจาก Roche ตลอดจน dH2O ในปริมาตรสุดท้ายของ 20 ml ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ5 วัตถุประสงค์นี้ได้ส่งต่อ 5'-GGAGTGTCACCCACAGACAG-3' และ 5' ย้อนกลับ-GAACACAAGCTACACGGGGA-3' ตัวอย่างการใส่ผ่านโพรโทคอลต่อไปนี้:คณะทันตแพทยศาสตร์ 5 นาทีที่ 95 ° C แล้ว 45 รอบ 95 องศาเซลเซียส 10 วินาที 60 ° C สำหรับ 20ตาม ด้วยรอบเดียว 95 ° C 5 วินาที วินาที และ 72 ° C เวลา 30 วินาที1 นาทีที่ 65 ° C และ 97 ° C สำหรับเส้นโค้งละลาย ตาม ด้วยการระบายความร้อนที่ 40 ° C สำหรับ10 90 วินาที ไม่ควบคุมต้นแบบ (NTC) ถูกเรียกใช้บนแผ่น เส้นโค้ง dissociationสร้างขึ้นเพื่อกำหนดผลิตภัณฑ์เจาะจง และนี้ถูก normalised เพื่อหลีกเลี่ยงการขยายใด ๆ ไม่เฉพาะเจาะจง ข้อมูลที่ได้วิเคราะห์โดยใช้วิธีการนับโร D(DCt) และได้ normalised ระดับแอกตินเบต้า ผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 1015 แม้ว่าการประดิษฐ์ได้ถูกอธิบายโดยใช้ตัวอย่าง ก็ควรชื่นชมว่ารูปแบบและแก้ไขอาจทำได้โดยไม่ต้องออกจากขอบเขตของการประดิษฐ์ตามที่กำหนดไว้ในการเรียกร้อง นอกจากนี้ ที่รู้จักเทียบเท่าที่มีอยู่กับคุณลักษณะเฉพาะ เทียบเท่าดังกล่าวจะรวมว่าโดยเฉพาะที่อ้างอิงในข้อกำหนดนี้
การแปล กรุณารอสักครู่..
SH-SY5Y
เซลล์ประสาทได้รับการเติบโตขึ้นไปบรรจบในMEM- สื่อได้รับการสำลักและเซลล์ถูกล้างครั้งที่สอง 1
มิลลิลิตรของน้ำแข็งเย็น HBSS HBSS ถูกสำลักและ 0.6 มิลลิลิตรน้ำแข็งเย็น dH2O ถูกบันทึกอยู่ในเซลล์.
เซลล์ที่ถูกคัดลอกมาจากขวดจาน / และระงับใน dH2O ระงับเซลล์
sonicated สำหรับ 15 วินาทีบนน้ำแข็งและ 100 PL
ของการระงับถูกใช้ในการตรวจสอบโปรตีนเนื้อหา lysate ที่เหลือถูกบันทึกอยู่ในหลอดไมโครและปริมาณที่เท่ากันของ
0.4 ยังไม่มีกรดเปอร์คลอริกที่เพิ่มขึ้นตามมาด้วยการบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่างหมุนเหวี่ยงที่ 5,000 XG ใสและถ่ายโอนไปยังหลอดไมโครใหม่ 100 PL ของแต่ละตัวอย่างถูกบันทึกอยู่ในขวดขนาดเล็กฉีดตัวอย่างอัตโนมัติกรวยและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสใน
5 ถาดระบายความร้อนฉีดตัวอย่างอัตโนมัติ 10 PL ของแต่ละตัวอย่างเหล่านี้ได้รับการฉีดเข้าไปใน HPLC
ได้ระบบ.
การแยกของรีดอกซ์และเมธิเลชันสารทางเดินก็ประสบความสำเร็จโดยใช้ Agilent คราส XDB-C8 คอลัมน์วิเคราะห์ (3 x 150 มม; 03:05) และ Agilent คราส XDB -C8 (4.6 x 12.5 มม; 05:00) คอลัมน์ยาม สองขั้นตอนมือถือถูกใช้. 10 เฟสมือถือ: 0% acetonitrile, โซเดียมฟอสเฟต 25 มิลลิ 1.4 มิลลิกรด 1 octanesulfonic, ปรับค่าพีเอช 2.65 ด้วยกรดฟอสฟ เฟสมือถือ B: 50% acetonitrile อัตราการไหลที่ได้รับการตั้งค่าเริ่มต้นที่ 0.6 มิลลิลิตร / นาทีและขั้นตอนการไล่ระดับสีที่ใช้: 0-9 ต่ำสุด 0% B, 9-19 นาที 50% B, 19-30 นาที 50% บีคอลัมน์ถูก equilibrated แล้วกับ 5% B 12 นาทีก่อนที่จะทำงานต่อไป อุณหภูมิไว้ที่ 27 องศาเซลเซียส เครื่องตรวจจับที่ใช้ไฟฟ้าเป็น 15 อีเอสเอ CoulArray กับ BDD วิเคราะห์เซลล์รุ่น 5040 และมีศักยภาพในการดำเนินงานตั้งอยู่ที่1500 mV ความเข้มข้นของสารตัวอย่างได้รับการพิจารณาจากพื้นที่จุดสูงสุดของสารโดยใช้เส้นโค้งการสอบเทียบมาตรฐานและซอฟต์แวร์ HPLC จัดอีเอสเอ ความเข้มข้นของสารตัวอย่างได้รับปกติกับปริมาณโปรตีน ในบางกรณีตัวอย่างที่ถูกปรับลดในขั้นตอนการมือถือเป็นสิ่งจำเป็นหรือเพิ่มขึ้นถึง 50 พีของกลุ่มตัวอย่างได้รับการฉีดเพื่อให้มั่นใจว่าระดับ thiol ที่อยู่ภายใน 20 ช่วงของกราฟมาตรฐาน ผลที่จะได้แสดงในรูปที่ 7 ตัวอย่างที่ 7: ผลของ BCM-7 ดีเอ็นเอเมธิเลชันระดับดีเอ็นเอทั่วโลกเมธิเลชันระดับที่เกิดจากBCM-7 ได้รับการตรวจสอบโดยใช้เมธิลโดเมนCpG ผูกพัน (MBD) จีโนมที่อุดมด้วยโปรตีน ลำดับ (MBD-seq) ตามที่อธิบายไว้ที่25 ก่อนหน้านี้ (Trivedi M. , et al., Mol. Pharm. 2014) ในขณะที่ข้อมูล microarray mRNA แปลที่ได้รับใช้ชิปmicroarray Agilent V3 จากการควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษาเซลล์ SH-SY5Y และเซลล์ ได้รับการรักษาเป็นเวลา 4 ชั่วโมงกับ 01:00 BCM-7. ดีเอ็นเอจีโนมถูกสกัดจากตัวอย่างกับชุดดีเอ็นเอง่าย (Invitrogen K1800- 01) โดยใช้โปรโตคอลที่เหมาะสมสำหรับเซลล์ การกระจายตัวของกำลังดำเนินการ Covaris 30 S2 กับการตั้งค่าต่อไปนี้: รอบการทำงาน 10% ความเข้ม 5, 200 รอบต่อออกมาในช่วง 200 วินาที ชิ้นส่วนที่ได้รับมีความยาวเฉลี่ยของ 200 bp โหมดพลังงานความถี่กวาดอุณหภูมิ 6-8 องศาเซลเซียสระดับน้ำ 12 สูงสุด 5 หน้าถูกโหลดใน 130 พี Tris- ใน EDTA Microtube กับ AFA intensifier สำหรับตัวอย่างด้วยการป้อนข้อมูลดีเอ็นเอน้อย(ลดลงถึง 500 นาโนกรัม) ดีเอ็นเอถูกเจือจาง 1: 5 TrisEDTA ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลที่ 5-3 หน้าได้35 วิเคราะห์ใน Agilent 2100 โดยใช้ดีเอ็นเอ 1000 ชิป ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลต่ำกว่า 3 หน้าถูกเข้มข้นในเครื่องระเหยแบบหมุนถึง25 พีและการจัดจำหน่ายชิ้นถูกตรวจสอบในความไวสูงชิปดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอ methylated ถูกจับโดยใช้ชุด MethylCap (Diagenode, เบลเยียม) ผลผลิตเป็นปกติระหว่าง 0.5 และ 8 งะดีเอ็นเอจับรวม. เศษมีลำดับขั้นตอนต่อมาโดยใช้การวิเคราะห์จีโนม Illumina ครั้งที่สอง ความเข้มข้นของการแยกส่วนและจับดีเอ็นเอได้รับการพิจารณาในการอ่านแผ่น Optima Fluostar กับควอนท์-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) ที่ 480 / 520nm. เพื่อเตรียมความพร้อมห้องสมุดดีเอ็นเอที่เตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอโทผสมชุดที่ 1 (NEB E6040 ) เป็น 5 ใช้ร่วมกับการเตรียมสารตัวอย่าง Multiplexing Oligo Kit (96 ตัวอย่าง Illumina PE-400-1001) ดีเอ็นเอทั้งการแยกส่วนที่ถูกนำมาใช้และปฏิบัติตามโปรโตคอล NEB โดยใช้อะแดปเตอร์มัลติลำดับที่ให้ไว้ในการเตรียมสารตัวอย่าง Multiplexing Oligo ชุด เลือกขนาดของห้องสมุดได้ดำเนินการใน 2% agarose เจล (อัลตร้าช่วงต่ำ Agarose Biorad 161-3107) 1KB บันไดพลัส (Invitrogen 10787-018) ถูกนำมาใช้และ10 เจลวิ่งที่ 120 V สำหรับ 2 ชั่วโมง ส่วนของ 300 bps +/- 50bps ถูกตัดและชะในคอลัมน์การสกัดเจลQiagen Kit (Qiagen 28704) และใน 23 ชะพี EB. ดัชนีการขยายห้องสมุด Illumina โปรโตคอลที่ใช้มีดังต่อไปนี้การเปลี่ยนแปลง: 22 พีดีเอ็นเอถูกนำมาใช้และ ดำเนินการ 21 รอบเรียกใช้ กลุ่มตัวอย่างที่บริสุทธิ์ในคอลัมน์ PCR Qiaquick บริสุทธิ์ (Qiagen 28101) และใน 50 ชะพี EB 1: 5 เจือจางและ 15 เข้มข้นในเครื่องระเหยแบบหมุนถึง 10 พี 1 พีถูกนำไปใช้กับ Agilent 2100 HS ดีเอ็นเอชิปและความเข้มข้นที่ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ป้ายบนAgilent 2100 ตัวอย่างที่ถูกปรับลดถึง 10 นาโนเมตร หลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติที่มี NaOH ตัวอย่างที่ถูกลดลงเหลือ16 pm เซลล์ไหลคู่-End ที่ถูกจัดทำขึ้นตามไปยังสถานีคลัสเตอร์คู่มือการใช้งาน. ลำดับที่ได้ดำเนินการตามคู่มือผู้ใช้ HiSeq (ดำเนินการ Multiplexed PE 20 Run) มี 2 x 51 รอบสำหรับวิ่งปลายคู่. ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมด MBD- หมายเลขเปิดเผยยีนที่แตกต่างกันสาร (DMTs) ตามที่กำหนดโดยอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) <0.1 และตามด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนของนักเรียน post-hoc ของ t-ทดสอบ(p <0.05) ใบรับรองผลการเรียนรวมทั้งยีนและ RNAs ที่ไม่ใช่การเข้ารหัสที่มีความแตกต่างกันสาร/ คัดลอก เหนือการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมเช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัส25 เกิดจาก BCM-7 ในทางชีวภาพที่เฉพาะเจาะจงหรือทางเดินหน้าที่ที่เกี่ยวข้องได้รับการประเมินโดยใช้ความฉลาดPathway วิเคราะห์ (IPA) เครื่องมือและเส้นทางการแสดงผลกระทบสูงที่สุดที่ถูกระบุ ผลที่จะได้แสดงในตารางที่ 4 การเปลี่ยนแปลงในสถานะเหนือพันธุกรรมของยีนที่รับผิดชอบในการเผาผลาญอาหารและการสังเคราะห์แลคโตสแลคโตสจะมีการรายงานยังมีการเปลี่ยนแปลงภายใต้ BCM7 ดังแสดงในรูปที่ 8 และ 9 ตารางที่ 4: รายชื่อ Differentially methylated Transcripts ภายใต้อิทธิพลของ BCM-7 ทำงานอภิปรัชญา / ยีนอภิปรัชญาแลคโตสการย่อยอาหารการเผาผลาญของแลคโตสชีวสังเคราะห์ทางเดินกระเพาะอาหารกรดกาแลคโตการเผาผลาญอาหารหลั่งตัวอย่างที่8: ผลของ BCM-7 ในแลคเตสระดับในลำไส้เล็ก20 หนู NOD (ชายและหญิง) กำลังเริ่ม ในอาหารที่อุดมด้วยเบต้า - การเคซีนอัลหรือA2 โปรตีนนมจากหย่านม อาหารเหล่านี้ถูกสร้างขึ้นมาโดยเฉพาะทางฟีด Pty. จำกัด(ออสเตรเลีย) เพื่อให้แน่ใจว่าองค์ประกอบเพียงพอและโภชนาการ ผองเพื่อนของหนู (n = 10) จากแต่ละเพศและการรับประทานอาหารที่ถูกeuthanased ที่ 10 สัปดาห์หรือ 20 สัปดาห์ที่ผ่านมา ในช่วงเวลาของการผ่าตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ถูกเก็บรวบรวมและจัดเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสใน RNAlaterm 40 หนู NOD ถูก25 ใช้ในการศึกษาครั้งนี้: 10 ต่อกลุ่ม (ชาย / หญิง: อัล / A2). อาร์เอ็นเอจากการเพาะเลี้ยงเซลล์สำหรับการวิเคราะห์การถอดความอาร์เอ็นเอที่แยกได้โดยใช้ชุดRNAqueous®-4PCR จาก Ambion (ออสติน, เท็กซัส) ขั้นตอนการได้เหมือนกันตามที่อธิบายไว้โดยโปรโตคอลของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอที่แยกออกมารับการรักษาด้วยการชำระล้าง DNase RNA ตามปริมาณ RNA ใช้ spectrophotometer NanoDrop ND-1000 ยีนได้30 สังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้การสังเคราะห์ยีนแรกสาระจากโรช(อินเดียแนโพลิ) อาร์เอ็นเอ (1 มก.) ผสม dNTP (1 มิลลิ) ไพรเมอร์ hexamer สุ่ม (60 มิลลิเมตร) ที่มีอณูชีววิทยาเพียงพอเกรดH20 ถูกเพิ่มเพื่อให้บรรลุปริมาณตัวอย่างสุดท้ายของ 13 มล. ตัวอย่างแต่ละเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีแล้ววางไว้บนน้ำแข็ง. Transcriptor RT (20 หน่วย / ลำธาร) (Roche) ยับยั้งป้องกัน RNase (40 Wm ') (Roche) 5 35 Transcriptor ย้อนกลับ Transcriptase ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ (Roche ) และระดับอณูชีววิทยาH20, มีการเพิ่มปริมาณและสุดท้ายมีการปรับถึง 20 มล. นี้ตามด้วยการบ่มใน PTC Thermocycler (MJ วิจัยเซนต์บรูโน่, QC, แคนาดา) ที่ 25 ° C เป็นเวลา 10 นาทีและ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที สุดท้ายเอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับถูกยับยั้งโดยการบ่มที่ 85 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที. การวิเคราะห์ qRT-PCR ได้รับการดำเนินการกับตัวอย่างเพิ่มขึ้นสามเท่าโดยใช้ LightCycler 480 เครื่อง qRT-PCR จากโรช (Trivedi et al., Mol. Pharmcol. 2014) qRT-PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ขนาด5 ml แม่แบบยีนรู้สึกมิลลิ 10 และไพรเมอร์ antisense 10 มล. SYBR สีเขียวผมจากโทโรชเช่นเดียวกับ dH2O ในเล่มสุดท้าย 20 มล. ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ5 ครั้งนี้มีจุดประสงค์ไปข้างหน้า 5'-GGAGTGTCACCCACAGACAG-3 'และย้อนกลับ 5'- GAACACAAGCTACACGGGGA-3' กลุ่มตัวอย่างที่ถูกนำผ่านโปรโตคอลดังต่อไปนี้: การบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียสแล้ว 45 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 10 วินาที 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วยรอบเดียว 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที1 นาทีที่ 65 องศาเซลเซียสและ 97 องศาเซลเซียสเป็นเวลาโค้งละลายตามด้วยการระบายความร้อนที่ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา10 90 วินาที ไม่มีการควบคุมแม่แบบ (กทช) ได้รับการทำงานบนจานและเส้นโค้งการแยกตัวออกถูกสร้างขึ้นเพื่อตรวจสอบผลิตภัณฑ์เชิญชมและนี่ก็เป็นปกติที่จะหลีกเลี่ยงการขยายใดๆ ที่ไม่เฉพาะเจาะจง วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้วิธีการที่ปริมาณ Roche D (DCT) และปกติจะเบต้าระดับ -actin ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 10 ที่ 15 ถึงแม้ว่าการประดิษฐ์ที่ได้รับการอธิบายโดยวิธีการเช่นนี้ก็ควรจะชื่นชมว่ารูปแบบและการปรับเปลี่ยนอาจจะทำโดยไม่ต้องออกจากขอบเขตของการประดิษฐ์ตามที่กำหนดไว้ในการเรียกร้องที่ นอกจากนี้ที่เทียบเท่าที่รู้จักกันอยู่เพื่อคุณลักษณะเฉพาะเทียบเท่าดังกล่าวจะจัดตั้งขึ้นเป็นถ้าเรียกเฉพาะในข้อกำหนดนี้
เซลล์ประสาทได้รับการเติบโตขึ้นไปบรรจบในMEM- สื่อได้รับการสำลักและเซลล์ถูกล้างครั้งที่สอง 1
มิลลิลิตรของน้ำแข็งเย็น HBSS HBSS ถูกสำลักและ 0.6 มิลลิลิตรน้ำแข็งเย็น dH2O ถูกบันทึกอยู่ในเซลล์.
เซลล์ที่ถูกคัดลอกมาจากขวดจาน / และระงับใน dH2O ระงับเซลล์
sonicated สำหรับ 15 วินาทีบนน้ำแข็งและ 100 PL
ของการระงับถูกใช้ในการตรวจสอบโปรตีนเนื้อหา lysate ที่เหลือถูกบันทึกอยู่ในหลอดไมโครและปริมาณที่เท่ากันของ
0.4 ยังไม่มีกรดเปอร์คลอริกที่เพิ่มขึ้นตามมาด้วยการบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่างหมุนเหวี่ยงที่ 5,000 XG ใสและถ่ายโอนไปยังหลอดไมโครใหม่ 100 PL ของแต่ละตัวอย่างถูกบันทึกอยู่ในขวดขนาดเล็กฉีดตัวอย่างอัตโนมัติกรวยและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสใน
5 ถาดระบายความร้อนฉีดตัวอย่างอัตโนมัติ 10 PL ของแต่ละตัวอย่างเหล่านี้ได้รับการฉีดเข้าไปใน HPLC
ได้ระบบ.
การแยกของรีดอกซ์และเมธิเลชันสารทางเดินก็ประสบความสำเร็จโดยใช้ Agilent คราส XDB-C8 คอลัมน์วิเคราะห์ (3 x 150 มม; 03:05) และ Agilent คราส XDB -C8 (4.6 x 12.5 มม; 05:00) คอลัมน์ยาม สองขั้นตอนมือถือถูกใช้. 10 เฟสมือถือ: 0% acetonitrile, โซเดียมฟอสเฟต 25 มิลลิ 1.4 มิลลิกรด 1 octanesulfonic, ปรับค่าพีเอช 2.65 ด้วยกรดฟอสฟ เฟสมือถือ B: 50% acetonitrile อัตราการไหลที่ได้รับการตั้งค่าเริ่มต้นที่ 0.6 มิลลิลิตร / นาทีและขั้นตอนการไล่ระดับสีที่ใช้: 0-9 ต่ำสุด 0% B, 9-19 นาที 50% B, 19-30 นาที 50% บีคอลัมน์ถูก equilibrated แล้วกับ 5% B 12 นาทีก่อนที่จะทำงานต่อไป อุณหภูมิไว้ที่ 27 องศาเซลเซียส เครื่องตรวจจับที่ใช้ไฟฟ้าเป็น 15 อีเอสเอ CoulArray กับ BDD วิเคราะห์เซลล์รุ่น 5040 และมีศักยภาพในการดำเนินงานตั้งอยู่ที่1500 mV ความเข้มข้นของสารตัวอย่างได้รับการพิจารณาจากพื้นที่จุดสูงสุดของสารโดยใช้เส้นโค้งการสอบเทียบมาตรฐานและซอฟต์แวร์ HPLC จัดอีเอสเอ ความเข้มข้นของสารตัวอย่างได้รับปกติกับปริมาณโปรตีน ในบางกรณีตัวอย่างที่ถูกปรับลดในขั้นตอนการมือถือเป็นสิ่งจำเป็นหรือเพิ่มขึ้นถึง 50 พีของกลุ่มตัวอย่างได้รับการฉีดเพื่อให้มั่นใจว่าระดับ thiol ที่อยู่ภายใน 20 ช่วงของกราฟมาตรฐาน ผลที่จะได้แสดงในรูปที่ 7 ตัวอย่างที่ 7: ผลของ BCM-7 ดีเอ็นเอเมธิเลชันระดับดีเอ็นเอทั่วโลกเมธิเลชันระดับที่เกิดจากBCM-7 ได้รับการตรวจสอบโดยใช้เมธิลโดเมนCpG ผูกพัน (MBD) จีโนมที่อุดมด้วยโปรตีน ลำดับ (MBD-seq) ตามที่อธิบายไว้ที่25 ก่อนหน้านี้ (Trivedi M. , et al., Mol. Pharm. 2014) ในขณะที่ข้อมูล microarray mRNA แปลที่ได้รับใช้ชิปmicroarray Agilent V3 จากการควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษาเซลล์ SH-SY5Y และเซลล์ ได้รับการรักษาเป็นเวลา 4 ชั่วโมงกับ 01:00 BCM-7. ดีเอ็นเอจีโนมถูกสกัดจากตัวอย่างกับชุดดีเอ็นเอง่าย (Invitrogen K1800- 01) โดยใช้โปรโตคอลที่เหมาะสมสำหรับเซลล์ การกระจายตัวของกำลังดำเนินการ Covaris 30 S2 กับการตั้งค่าต่อไปนี้: รอบการทำงาน 10% ความเข้ม 5, 200 รอบต่อออกมาในช่วง 200 วินาที ชิ้นส่วนที่ได้รับมีความยาวเฉลี่ยของ 200 bp โหมดพลังงานความถี่กวาดอุณหภูมิ 6-8 องศาเซลเซียสระดับน้ำ 12 สูงสุด 5 หน้าถูกโหลดใน 130 พี Tris- ใน EDTA Microtube กับ AFA intensifier สำหรับตัวอย่างด้วยการป้อนข้อมูลดีเอ็นเอน้อย(ลดลงถึง 500 นาโนกรัม) ดีเอ็นเอถูกเจือจาง 1: 5 TrisEDTA ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลที่ 5-3 หน้าได้35 วิเคราะห์ใน Agilent 2100 โดยใช้ดีเอ็นเอ 1000 ชิป ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลต่ำกว่า 3 หน้าถูกเข้มข้นในเครื่องระเหยแบบหมุนถึง25 พีและการจัดจำหน่ายชิ้นถูกตรวจสอบในความไวสูงชิปดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอ methylated ถูกจับโดยใช้ชุด MethylCap (Diagenode, เบลเยียม) ผลผลิตเป็นปกติระหว่าง 0.5 และ 8 งะดีเอ็นเอจับรวม. เศษมีลำดับขั้นตอนต่อมาโดยใช้การวิเคราะห์จีโนม Illumina ครั้งที่สอง ความเข้มข้นของการแยกส่วนและจับดีเอ็นเอได้รับการพิจารณาในการอ่านแผ่น Optima Fluostar กับควอนท์-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) ที่ 480 / 520nm. เพื่อเตรียมความพร้อมห้องสมุดดีเอ็นเอที่เตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอโทผสมชุดที่ 1 (NEB E6040 ) เป็น 5 ใช้ร่วมกับการเตรียมสารตัวอย่าง Multiplexing Oligo Kit (96 ตัวอย่าง Illumina PE-400-1001) ดีเอ็นเอทั้งการแยกส่วนที่ถูกนำมาใช้และปฏิบัติตามโปรโตคอล NEB โดยใช้อะแดปเตอร์มัลติลำดับที่ให้ไว้ในการเตรียมสารตัวอย่าง Multiplexing Oligo ชุด เลือกขนาดของห้องสมุดได้ดำเนินการใน 2% agarose เจล (อัลตร้าช่วงต่ำ Agarose Biorad 161-3107) 1KB บันไดพลัส (Invitrogen 10787-018) ถูกนำมาใช้และ10 เจลวิ่งที่ 120 V สำหรับ 2 ชั่วโมง ส่วนของ 300 bps +/- 50bps ถูกตัดและชะในคอลัมน์การสกัดเจลQiagen Kit (Qiagen 28704) และใน 23 ชะพี EB. ดัชนีการขยายห้องสมุด Illumina โปรโตคอลที่ใช้มีดังต่อไปนี้การเปลี่ยนแปลง: 22 พีดีเอ็นเอถูกนำมาใช้และ ดำเนินการ 21 รอบเรียกใช้ กลุ่มตัวอย่างที่บริสุทธิ์ในคอลัมน์ PCR Qiaquick บริสุทธิ์ (Qiagen 28101) และใน 50 ชะพี EB 1: 5 เจือจางและ 15 เข้มข้นในเครื่องระเหยแบบหมุนถึง 10 พี 1 พีถูกนำไปใช้กับ Agilent 2100 HS ดีเอ็นเอชิปและความเข้มข้นที่ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ป้ายบนAgilent 2100 ตัวอย่างที่ถูกปรับลดถึง 10 นาโนเมตร หลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติที่มี NaOH ตัวอย่างที่ถูกลดลงเหลือ16 pm เซลล์ไหลคู่-End ที่ถูกจัดทำขึ้นตามไปยังสถานีคลัสเตอร์คู่มือการใช้งาน. ลำดับที่ได้ดำเนินการตามคู่มือผู้ใช้ HiSeq (ดำเนินการ Multiplexed PE 20 Run) มี 2 x 51 รอบสำหรับวิ่งปลายคู่. ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมด MBD- หมายเลขเปิดเผยยีนที่แตกต่างกันสาร (DMTs) ตามที่กำหนดโดยอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) <0.1 และตามด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนของนักเรียน post-hoc ของ t-ทดสอบ(p <0.05) ใบรับรองผลการเรียนรวมทั้งยีนและ RNAs ที่ไม่ใช่การเข้ารหัสที่มีความแตกต่างกันสาร/ คัดลอก เหนือการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมเช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัส25 เกิดจาก BCM-7 ในทางชีวภาพที่เฉพาะเจาะจงหรือทางเดินหน้าที่ที่เกี่ยวข้องได้รับการประเมินโดยใช้ความฉลาดPathway วิเคราะห์ (IPA) เครื่องมือและเส้นทางการแสดงผลกระทบสูงที่สุดที่ถูกระบุ ผลที่จะได้แสดงในตารางที่ 4 การเปลี่ยนแปลงในสถานะเหนือพันธุกรรมของยีนที่รับผิดชอบในการเผาผลาญอาหารและการสังเคราะห์แลคโตสแลคโตสจะมีการรายงานยังมีการเปลี่ยนแปลงภายใต้ BCM7 ดังแสดงในรูปที่ 8 และ 9 ตารางที่ 4: รายชื่อ Differentially methylated Transcripts ภายใต้อิทธิพลของ BCM-7 ทำงานอภิปรัชญา / ยีนอภิปรัชญาแลคโตสการย่อยอาหารการเผาผลาญของแลคโตสชีวสังเคราะห์ทางเดินกระเพาะอาหารกรดกาแลคโตการเผาผลาญอาหารหลั่งตัวอย่างที่8: ผลของ BCM-7 ในแลคเตสระดับในลำไส้เล็ก20 หนู NOD (ชายและหญิง) กำลังเริ่ม ในอาหารที่อุดมด้วยเบต้า - การเคซีนอัลหรือA2 โปรตีนนมจากหย่านม อาหารเหล่านี้ถูกสร้างขึ้นมาโดยเฉพาะทางฟีด Pty. จำกัด(ออสเตรเลีย) เพื่อให้แน่ใจว่าองค์ประกอบเพียงพอและโภชนาการ ผองเพื่อนของหนู (n = 10) จากแต่ละเพศและการรับประทานอาหารที่ถูกeuthanased ที่ 10 สัปดาห์หรือ 20 สัปดาห์ที่ผ่านมา ในช่วงเวลาของการผ่าตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ถูกเก็บรวบรวมและจัดเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสใน RNAlaterm 40 หนู NOD ถูก25 ใช้ในการศึกษาครั้งนี้: 10 ต่อกลุ่ม (ชาย / หญิง: อัล / A2). อาร์เอ็นเอจากการเพาะเลี้ยงเซลล์สำหรับการวิเคราะห์การถอดความอาร์เอ็นเอที่แยกได้โดยใช้ชุดRNAqueous®-4PCR จาก Ambion (ออสติน, เท็กซัส) ขั้นตอนการได้เหมือนกันตามที่อธิบายไว้โดยโปรโตคอลของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอที่แยกออกมารับการรักษาด้วยการชำระล้าง DNase RNA ตามปริมาณ RNA ใช้ spectrophotometer NanoDrop ND-1000 ยีนได้30 สังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้การสังเคราะห์ยีนแรกสาระจากโรช(อินเดียแนโพลิ) อาร์เอ็นเอ (1 มก.) ผสม dNTP (1 มิลลิ) ไพรเมอร์ hexamer สุ่ม (60 มิลลิเมตร) ที่มีอณูชีววิทยาเพียงพอเกรดH20 ถูกเพิ่มเพื่อให้บรรลุปริมาณตัวอย่างสุดท้ายของ 13 มล. ตัวอย่างแต่ละเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีแล้ววางไว้บนน้ำแข็ง. Transcriptor RT (20 หน่วย / ลำธาร) (Roche) ยับยั้งป้องกัน RNase (40 Wm ') (Roche) 5 35 Transcriptor ย้อนกลับ Transcriptase ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ (Roche ) และระดับอณูชีววิทยาH20, มีการเพิ่มปริมาณและสุดท้ายมีการปรับถึง 20 มล. นี้ตามด้วยการบ่มใน PTC Thermocycler (MJ วิจัยเซนต์บรูโน่, QC, แคนาดา) ที่ 25 ° C เป็นเวลา 10 นาทีและ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที สุดท้ายเอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับถูกยับยั้งโดยการบ่มที่ 85 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที. การวิเคราะห์ qRT-PCR ได้รับการดำเนินการกับตัวอย่างเพิ่มขึ้นสามเท่าโดยใช้ LightCycler 480 เครื่อง qRT-PCR จากโรช (Trivedi et al., Mol. Pharmcol. 2014) qRT-PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ขนาด5 ml แม่แบบยีนรู้สึกมิลลิ 10 และไพรเมอร์ antisense 10 มล. SYBR สีเขียวผมจากโทโรชเช่นเดียวกับ dH2O ในเล่มสุดท้าย 20 มล. ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ5 ครั้งนี้มีจุดประสงค์ไปข้างหน้า 5'-GGAGTGTCACCCACAGACAG-3 'และย้อนกลับ 5'- GAACACAAGCTACACGGGGA-3' กลุ่มตัวอย่างที่ถูกนำผ่านโปรโตคอลดังต่อไปนี้: การบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียสแล้ว 45 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 10 วินาที 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วยรอบเดียว 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที1 นาทีที่ 65 องศาเซลเซียสและ 97 องศาเซลเซียสเป็นเวลาโค้งละลายตามด้วยการระบายความร้อนที่ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา10 90 วินาที ไม่มีการควบคุมแม่แบบ (กทช) ได้รับการทำงานบนจานและเส้นโค้งการแยกตัวออกถูกสร้างขึ้นเพื่อตรวจสอบผลิตภัณฑ์เชิญชมและนี่ก็เป็นปกติที่จะหลีกเลี่ยงการขยายใดๆ ที่ไม่เฉพาะเจาะจง วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้วิธีการที่ปริมาณ Roche D (DCT) และปกติจะเบต้าระดับ -actin ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปที่ 10 ที่ 15 ถึงแม้ว่าการประดิษฐ์ที่ได้รับการอธิบายโดยวิธีการเช่นนี้ก็ควรจะชื่นชมว่ารูปแบบและการปรับเปลี่ยนอาจจะทำโดยไม่ต้องออกจากขอบเขตของการประดิษฐ์ตามที่กำหนดไว้ในการเรียกร้องที่ นอกจากนี้ที่เทียบเท่าที่รู้จักกันอยู่เพื่อคุณลักษณะเฉพาะเทียบเท่าดังกล่าวจะจัดตั้งขึ้นเป็นถ้าเรียกเฉพาะในข้อกำหนดนี้
การแปล กรุณารอสักครู่..
sh-sy5y ระหว่างเซลล์มี
โตบรรจบใน a-mem . สื่อถูกลมและเซลล์ถูกล้างสองครั้ง 1
4 hbss น้ำแข็งเย็น hbss คือ aspirated 0.6 ml เย็น dh2o ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ เซลล์ก็ขูด
จากขวด / จาน และแขวนลอยใน dh2o เซลล์แขวนลอยอยู่
sonicated 15 บนน้ำแข็งและ 100 ของช่วงล่างที่จะศึกษาโปรตีน
เนื้อหาการ lysate ที่เหลือคือเพิ่มหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ และปริมาณเท่ากันของ
0 n เปอร์คลอริกแอซิด ได้เพิ่ม ตามด้วยการบ่มแข็งเป็นเวลา 5 นาที จำนวนระดับที่ 5 , 000 x G และนำย้ายหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ใหม่ 100 PL ของแต่ละตัวอย่างที่ถูกเพิ่มเข้าไปในขวดรูปกรวย autosampler ไมโครและเก็บไว้ที่ 4 ° C
5 autosampler ถาดระบายความร้อน10 . ของแต่ละตัวอย่างเหล่านี้ถูกฉีดเข้าไปในระบบ HPLC
.
แยกสารได้ และทางไฟฟ้าเมธิเลชัน
ใช้คอลัมน์ Agilent คราส xdb-c8 วิเคราะห์ ( 3 x 150 มม. ; 3.5 น. ) และ xdb-c8 คราส Agilent
( 5 ทุ่ม 4.6 x 12.5 มม. ; ) คอลัมน์ ยาม สองขั้นตอนมือถือใช้ .
10 เฟสเคลื่อนที่เป็น 0 % ไน 25 มิลลิโมลาร์โซเดียมฟอสเฟต 14 มม. 1-octanesulfonic กรด
ปรับ pH 2.65 กับกรดฟอสฟอริก มือถือเฟส B : 50% ไน . อัตราการไหลที่ถูกตั้งค่าเริ่มต้นที่ 0.6 มิลลิลิตรต่อนาทีและขั้นตอนการใช้ : 0-9 มิน 0 % B , 9-19 นาที 50 % B , 19-30 มิน 50% คอลัมน์ B แล้ว equilibrated 5% B 12 นาทีก่อน
หน้าวิ่ง อุณหภูมิไว้ที่ 25 องศาการใช้เครื่องตรวจจับที่ใช้เป็น 15 ESA coularray กับ bdd วิเคราะห์เซลล์แบบ 0 และศักยภาพการดำเนินงานไว้ที่
1500 MV . ตัวอย่างปริมาณกำหนดจากพื้นที่สูงสุดของสารโดยใช้เส้นโค้งสอบเทียบมาตรฐาน ESA
บรรจุซอฟต์แวร์และ . ตัวอย่างปริมาณ
บาทต่อปริมาณโปรตีนในตัวอย่างบางรายถูกเจือจางในเฟสเคลื่อนที่เป็น
ต้องการหรือถึง 50 ตัวอย่างที่จะถูกฉีดเพื่อให้มั่นใจว่า ขนาด ระดับภายใน
20 ช่วงของเส้นโค้งมาตรฐาน ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูป 7
ตัวอย่างที่ 7 : ผลของ bcm-7 ในระดับดีเอ็นเอ ( DNA เมธิเลชัน
เมธิเลชันระดับเกิดจากการ bcm-7 ทำการศึกษาโดยใช้เมทิล -
CPG ผูกโดเมน ( mbd ) โปรตีนที่อุดมด้วยลำดับจีโนม ( mbd seq ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ตริเวดี
25 เมตร et al . , มอล Pharm . 2014 ) ส่วน mRNA แปลข้อมูล microarray
ได้รับการใช้เลนต์ V3 microarray ชิพ จากไม่ถือว่าควบคุม sh-sy5y เซลล์และเซลล์บำบัด 4 ชั่วโมง กับ 1 ทุ่ม bcm-7 .
จีโนมดีเอ็นเอจากตัวอย่างดีเอ็นเอกับชุดง่าย ( Invitrogen k1800 -
01 ) โดยใช้โปรโตคอลที่เหมาะสมสำหรับโทรศัพท์สาย การกระทำใน covaris 30 S2 ได้ด้วยการตั้งค่าต่อไปนี้ : รอบหน้าที่ 10 % ความเข้ม 5 , 200 รอบ / ระเบิดในช่วง 200
วินาที เศษที่ได้มีความยาวเฉลี่ย 200 BP . โหมดพลังงาน
ความถี่กวาด , อุณหภูมิ 6-8 องศา C , ระดับน้ํา 12 สูงสุด 5 PG ถูกโหลดใน
130 คุณทริส - EDTA ใน microtube กับอุปกรณ์ที่มีอยู่ . สำหรับตัวอย่างที่มีน้อยดีเอ็นเอเข้า
( ลง 500 ng ) ดีเอ็นเอเจือจาง 1 : 5 ใน trisedta . ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลจาก PG เป็น 5-3
35 วิเคราะห์ในด้าน 2100 ใช้ดีเอ็นเอ 1000 ชิป ดีเอ็นเอด้วยอินพุตน้อยกว่า 3 PG
คือความเข้มข้นในเครื่องโรตารี่ 25 PL และชิ้นส่วนการตรวจสอบ
บนความไวสูงชิปดีเอ็นเอ
โตบรรจบใน a-mem . สื่อถูกลมและเซลล์ถูกล้างสองครั้ง 1
4 hbss น้ำแข็งเย็น hbss คือ aspirated 0.6 ml เย็น dh2o ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ เซลล์ก็ขูด
จากขวด / จาน และแขวนลอยใน dh2o เซลล์แขวนลอยอยู่
sonicated 15 บนน้ำแข็งและ 100 ของช่วงล่างที่จะศึกษาโปรตีน
เนื้อหาการ lysate ที่เหลือคือเพิ่มหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ และปริมาณเท่ากันของ
0 n เปอร์คลอริกแอซิด ได้เพิ่ม ตามด้วยการบ่มแข็งเป็นเวลา 5 นาที จำนวนระดับที่ 5 , 000 x G และนำย้ายหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ใหม่ 100 PL ของแต่ละตัวอย่างที่ถูกเพิ่มเข้าไปในขวดรูปกรวย autosampler ไมโครและเก็บไว้ที่ 4 ° C
5 autosampler ถาดระบายความร้อน10 . ของแต่ละตัวอย่างเหล่านี้ถูกฉีดเข้าไปในระบบ HPLC
.
แยกสารได้ และทางไฟฟ้าเมธิเลชัน
ใช้คอลัมน์ Agilent คราส xdb-c8 วิเคราะห์ ( 3 x 150 มม. ; 3.5 น. ) และ xdb-c8 คราส Agilent
( 5 ทุ่ม 4.6 x 12.5 มม. ; ) คอลัมน์ ยาม สองขั้นตอนมือถือใช้ .
10 เฟสเคลื่อนที่เป็น 0 % ไน 25 มิลลิโมลาร์โซเดียมฟอสเฟต 14 มม. 1-octanesulfonic กรด
ปรับ pH 2.65 กับกรดฟอสฟอริก มือถือเฟส B : 50% ไน . อัตราการไหลที่ถูกตั้งค่าเริ่มต้นที่ 0.6 มิลลิลิตรต่อนาทีและขั้นตอนการใช้ : 0-9 มิน 0 % B , 9-19 นาที 50 % B , 19-30 มิน 50% คอลัมน์ B แล้ว equilibrated 5% B 12 นาทีก่อน
หน้าวิ่ง อุณหภูมิไว้ที่ 25 องศาการใช้เครื่องตรวจจับที่ใช้เป็น 15 ESA coularray กับ bdd วิเคราะห์เซลล์แบบ 0 และศักยภาพการดำเนินงานไว้ที่
1500 MV . ตัวอย่างปริมาณกำหนดจากพื้นที่สูงสุดของสารโดยใช้เส้นโค้งสอบเทียบมาตรฐาน ESA
บรรจุซอฟต์แวร์และ . ตัวอย่างปริมาณ
บาทต่อปริมาณโปรตีนในตัวอย่างบางรายถูกเจือจางในเฟสเคลื่อนที่เป็น
ต้องการหรือถึง 50 ตัวอย่างที่จะถูกฉีดเพื่อให้มั่นใจว่า ขนาด ระดับภายใน
20 ช่วงของเส้นโค้งมาตรฐาน ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูป 7
ตัวอย่างที่ 7 : ผลของ bcm-7 ในระดับดีเอ็นเอ ( DNA เมธิเลชัน
เมธิเลชันระดับเกิดจากการ bcm-7 ทำการศึกษาโดยใช้เมทิล -
CPG ผูกโดเมน ( mbd ) โปรตีนที่อุดมด้วยลำดับจีโนม ( mbd seq ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ตริเวดี
25 เมตร et al . , มอล Pharm . 2014 ) ส่วน mRNA แปลข้อมูล microarray
ได้รับการใช้เลนต์ V3 microarray ชิพ จากไม่ถือว่าควบคุม sh-sy5y เซลล์และเซลล์บำบัด 4 ชั่วโมง กับ 1 ทุ่ม bcm-7 .
จีโนมดีเอ็นเอจากตัวอย่างดีเอ็นเอกับชุดง่าย ( Invitrogen k1800 -
01 ) โดยใช้โปรโตคอลที่เหมาะสมสำหรับโทรศัพท์สาย การกระทำใน covaris 30 S2 ได้ด้วยการตั้งค่าต่อไปนี้ : รอบหน้าที่ 10 % ความเข้ม 5 , 200 รอบ / ระเบิดในช่วง 200
วินาที เศษที่ได้มีความยาวเฉลี่ย 200 BP . โหมดพลังงาน
ความถี่กวาด , อุณหภูมิ 6-8 องศา C , ระดับน้ํา 12 สูงสุด 5 PG ถูกโหลดใน
130 คุณทริส - EDTA ใน microtube กับอุปกรณ์ที่มีอยู่ . สำหรับตัวอย่างที่มีน้อยดีเอ็นเอเข้า
( ลง 500 ng ) ดีเอ็นเอเจือจาง 1 : 5 ใน trisedta . ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลจาก PG เป็น 5-3
35 วิเคราะห์ในด้าน 2100 ใช้ดีเอ็นเอ 1000 ชิป ดีเอ็นเอด้วยอินพุตน้อยกว่า 3 PG
คือความเข้มข้นในเครื่องโรตารี่ 25 PL และชิ้นส่วนการตรวจสอบ
บนความไวสูงชิปดีเอ็นเอ
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- เราควรมาทำความเข้าใจกัน. เพราะเราเริ่มมา
- โต๊ะจีน
- covered
- อย่างไรคุณชอบฉัน
- จากข้อมูลยังนำมาใช้ประโยชน์ไม่ได้ อาจารย
- ขณะนี้เรายังไม่สามารถนำเอกสารไปวางที่บริ
- เบื่อมากไปเที่ยวนี้ซิ
- 1. เสียบสาย usb เข้าไปที่ พอร์ท usb ของ
- Where applicable, redundant information
- This dye comes from the shells of the fe
- Check
- I don't own cats
- พ่อบุญธรรม
- Discuss about food project AS/RS
- ผมกลัวพี่ไม่สบายใจครับ
- 動画
- พรพรหม
- ฉันเข้าใจคุณฉันขอโทษ
- many
- Fried rice with Shrimps, Crab
- accumulated
- while
- a pilot
- ผมอยู่ประเทศไทย
