As shown in รูป 33 (ฮิวเมน full-len

As shown in รูป 33 (ฮิวเมน full-length CD134-transfected cells clone no. 10 5 with high surface CD134 expression level; n=1), parental mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5 and all six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5 dose-dependently and specifically bound to cell surface expressed
ฮิวเมน CD134. Parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5, ไคเมริก 15 ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 and ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 versions 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1,
20E5 VL2VH2 and 20E5_VL2VH3 showed similar titration curves, which
indicated that their CD134 antigen binding affinity คือ very similar, whereas
ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 version VL1H1 and 20 VL1H2 seemed to show a slightly lower binding affinity.

As shown in รูป 34 (ฮิวเมน full-length CD134-transfected cells clone no.
5 with high surface CD134 expression level; n=2), parental mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 12H3 and all six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody 25 clone 12H3 dose-dependently and specifically bound to cell surface expressed
ฮิวเมน CD134. Parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3, ไคเมริก
ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and ฮิวเมไนซ์ IgG4tc แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 versions 12H3_VL2H1 and 12H3 VL2VH3,
showed identical titration curves, which indicated that their CD134 antigen
30 binding affinity คือ identical, whereas ฮิวเมไนซ์ IgG4k. แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 12H3 version 12H3_VL1H1, 12115 VL1H2, 12H3_VL1H3 and
12H3_VL2H2 seemed to show a slightly higher binding affinity.


As shown in รูป 35 (ฮิวเมน full-length CD134-transfected cells clone no.
23 with intermediate surface CD134 expression level; n=2), parental mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and all six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134
5 antibody clone 12H3 dose-dependently and specifically bound to cell surface
expressed ฮิวเมน CD134. Parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3
and ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 showed
similar titration curves, which indicated that their CD134 antigen binding affinity
is similar (EC50> 200 ng/mL), whereas all six ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน
10 CD134 antibody clone 12H3 versions — 12H3 VL1H1, 12H3_VL1H2,
12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 and 12H3_VL2VH3 — seemed to show
a higher binding affinity (EC5o < 200 ng/mL).
Collectively, these flow cytometric results demonstrated that ฮิวเมไนซ์
IgG4K. แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 versions 20E5_VL1H3,
15 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2, 20E5_VL2VH3, parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 and ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 showed a similar CD134 antigen binding affinity, whereas ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 version 20E5_VL1111 and 20E5_VL1H2
seemed to show a slightly lower CD134 antigen binding affinity. In addition, these 20 results demonstrated that all six ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 12H3 versions showed a higher CD134 antigen binding affinity than parental
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3.


25 (d). การยึดเกาะของ ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones
12H3 and 20E5 with full-length ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ and various truncated
ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ expressed on 293-F cell line (FACS domain mapping).
In order to analyze the fine specificity of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clones 12H3 and 20E5, the เอพิโทป location recognized 30 by ฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones 12H3 and
20E5 was determined by domain mapping. The ability of ฮิวเมไนซ์ IgGLIK แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones 12H3 and 20E5 to bind to truncated
ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์, expressed on the surface of (HEK-derived) 297-F cells, was determined by flow cytometric analysis.
Based on literature (Swiss-Prot: P43489.1; Latza et al. Eur J Immunol 1994;
24: 677-683; Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan et al.
5 Structure 2006; 14: 1321-1330; US Patent Publ. No. 2011/0028688), ซิสเทอีน-rich
domains (CRD) and a hinge-like structure in the ภายนอกเซลล์ region of ฮิวเมน
CD134 were identified. CRDs are coded CRD1, CRD2, (truncated) CRD3,
(truncated) CRD4 (see รูป 20). CRDs contain topologically distinct types of
modules, called an A-module and a B-module (see also รูป 20). A-modules are C-
10 shaped structures, and B-modules are S-shaped structures. A typical CRD is
usually composed of A1-B2-modules หรือ A2-B1-modules (or, less frequently, a
different pair of modules, like Al-B1) with 6 conserved ซิสเทอีน residues, โดยที่
the numeral denotes the number of ไดซัลไฟด์ bridges within each module (see also
รูป 20). As shown in รูป 20, 3 different ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ were
15 generated and expressed: (1) full-length ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์, which starts with
N-terminal CRD1 (i.e., CRD1 A1-B2-module covers amino acids 29-65), and
therefore denoted as `CRD1', and ประกอบรวมด้วยd amino acids 1-277 (see SEQ ID NO. 1),
(2) `CRD3' คอนสตรัคต์, which starts with N-terminal CRD3 (i.e., CRD3 Al-Bl-module
covers amino acids 108-146 (according to Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-
20 1330) หรือ truncated CRD3 Al-module covers amino acids 108-126 (according to
Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)), and ประกอบรวมด้วยd amino acids 108-
277 linked to signal peptide amino acids 1-28 (see SEQ ID NO: 31), (3) `CRD4'
คอนสตรัคต์, which consists of N-terminal CRD4 หรือ CRD3 subdomain
B1-module/truncated CRD4 Al-module (i.e., CRD4 Al-B1-module covers amino
25 acids 127-167 (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรือ a combination (not
shown in รูป 20) of CRD3 subdomain B1-module with truncated CRD4 Al-
module covers amino acids 127-146 with amino acids 147-167, ตามลำดับ
(Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330)), and ประกอบรวมด้วยd amino acids 127-
277 linked to signal peptide amino acids 1-28 (see SEQ ID NO: 32). By assembly 30 PCR using Accuprimem Pfx DNA Polymerase (Invitrogen), these 3 ฮิวเมน CD134
คอนสตรัคต์ were generated using primers shown in Table 2.


Table 2.
Briefly, cDNA encoding amino acids 1-28 of signal peptide and cDNA encoding
amino acids 66-277 of ฮิวเมน CD134 were amplified using ตามลำดับ primer pair
362/367 and 366/363 in a PCR reaction with full-length ฮิวเมน CD134 as a
10 template. Subsequently, `CRD3' คอนสตรัคต์ was generated by using these two PCR
products in an assembly PCR using primer pair 362/363. The cDNA encoding
`CRD3' คอนสตรัคต์ was โคลนย่อย into a pcDNA3.1-derived expression plasmid using
suitable restriction sites. Similarly, `CRD4' คอนสตรัคต์ (amino acids 1-28 of signal
peptide linked to amino acid 127-277) was generated and โคลนย่อย in pcDNA3.1-
15 derived expression plasmids using the corresponding primers shown in
abovementioned table. Furthermore, full-length ฮิวเมน CD134 (SEQ ID NO: 1)
was also re-cloned in a pcDNA3.1-derived expression plasmid.
Using the FreeStyleTM 293 Expression System (Life Technologies),
FreeStyleTM 293-F cells (Life Technologies) were transiently transfected with the 3 20 generated variants of ฮิวเมน CD134. After 48h, surface ฮิวเมน CD134 expression
on transfected cells was analyzed by FACS analysis. To this end, transfected cells
were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3
supplemented with 50 lag/mL purified ฮิวเมน IgG (Sigma; blocking Fcy รีเซปเตอร์).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดังแสดงในรูปที่ 33 (ฮิวเมนปราศจาก CD134 transfected เซลล์โคลน 5 10 หมายเลขกับสูงระดับนิพจน์ CD134 ผิว n = 1), โดยผู้ปกครองเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี 20E5 โคลนและฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีทั้งหมด 6 รุ่น 20E5 โคลนยา dependently และโดยเฉพาะกับผิวเซลล์ที่แสดง ฮิวเมน CD134 ผู้ปกครองเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ไคเมริก 15 ฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 และฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 รุ่น 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1 20E5 VL2VH2 และ 20E5_VL2VH3 แสดงให้เห็นว่าเส้นโค้งของการไทเทรตคล้าย ซึ่ง ระบุที่ตรวจหา CD134 การผูกความสัมพันธ์คือคล้ายกันมาก ขณะที่ ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 รุ่น VL1H1 และ 20 VL1H2 ดูเหมือนจะ แสดงความสัมพันธ์แบบผูกต่ำกว่าเล็กน้อยดังแสดงในรูปที่ 34 (ฮิวเมนปราศจาก CD134 transfected เซลล์โคลนไม่5 มีระดับสูงผิว CD134 นิพจน์ n = 2), โดยผู้ปกครองเมาส์แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H 3 ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี รุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี 25 12H 6 3 และทั้งหมดโคลนโคลน 12H 3 ยา dependently และโดยเฉพาะกับผิวเซลล์ที่แสดง ฮิวเมน CD134 ผู้ปกครองเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และฮิวเมไนซ์ IgG4tc แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3_VL2H1 รุ่น 3 H และ H 12 3 VL2VH3, 12 แสดงการไทเทรตเหมือนโค้ง ซึ่งระบุที่ตรวจหาการ CD134 30 ผูกคือความสัมพันธ์ที่เหมือนกัน ในขณะที่ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 รุ่น 12H3_VL1H1, 12115 VL1H2, 12H3_VL1H3 และ 12H3_VL2H2 ดูเหมือนจะ แสดงความสัมพันธ์ผูกสูงขึ้นเล็กน้อยดังแสดงในรูปที่ 35 (ฮิวเมนปราศจาก CD134 transfected เซลล์โคลนไม่23 กับผิว CD134 นิพจน์ระดับกลาง n = 2), โดยผู้ปกครองเมาส์แอนติ -ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และทั้งหมด 6 รุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134แอนติบอดีที่ 5 โคลน 12H 3 ยา dependently และโดยเฉพาะกับเซลล์ผิวแสดงฮิวเมน CD134 ผู้ปกครองเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 แสดงให้เห็นว่า คล้ายการไทเทรตโค้ง ซึ่งระบุที่ตรวจหา CD134 การผูกความสัมพันธ์ เป็นเหมือนกัน (EC50 > 200 ng/mL), ในขณะที่ทั้งหมดหกฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน 10 CD134 แอนติบอดีโคลน 12H รุ่น 3 – 12H 3 VL1H1, 12H3_VL1H2 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 และ 12H3_VL2VH3 ซึ่งดูเหมือนจะ แสดง ความสูงผูกความสัมพันธ์ (EC5o < 200 ng/mL)โดยรวม ผลลัพธ์เหล่านี้ cytometric ขั้นตอนแสดงที่ฮิวเมไนซ์IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 รุ่น 20E5_VL1H320E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2, 20E5_VL2VH3 ปกครอง 15 เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน 20E5 และไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 แสดงให้เห็นเป็นคล้าย CD134 ตรวจหาผูกความสัมพันธ์ ในขณะที่แอนติบอดีฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โคลน 20E5 รุ่น 20E5_VL1111 และ 20E5_VL1H2ดูเหมือนจะ แสดงด้านล่างเล็กน้อย CD134 ตรวจหาผูกความสัมพันธ์ แสดงผล 20 เหล่านี้ที่ทั้งหมดหกฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี โคลน 12H 3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าความสูง CD134 ตรวจหาผูกความสัมพันธ์มากกว่าผู้ปกครอง แอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์โคลน 12H 3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 325 (d) การยึดเกาะของฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน12H 3 และ 20E5 กับฮิวเมนปราศจาก CD134 คอนสตรัคต์และต่าง ๆ ตัดฮิวเมน CD134 แสดงบรรทัด 293 F เซลล์ (FACS โดเมนแม็ป) คอนสตรัคต์เพื่อวิเคราะห์ specificity ดีของแอนติ IgG4k ฮิวเมไนซ์-ฮิวเมนแอนติบอดีโมโนโคลนอล CD134 clones 12H 3 และ 20E5 รู้ตำแหน่งเอพิโทป 30 ฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโดย clones 12H 3 และ 20E5 ที่ถูกกำหนด โดยโดเมนการแม็ป ความสามารถของฮิวเมไนซ์ IgGLIK แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี clones 12H 3 และตัดทอน 20E5 ผูกกับฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ แสดงบนพื้นผิวของเซลล์ 297-F (มา HEK) ถูกกำหนด โดยการวิเคราะห์การไหล cytometricตามเอกสารประกอบการ (Prot สวิส: P43489.1 Latza et al. Eur J Immunol 1994 24:677-683 วิทยาศาสตร์วิศวกรรม Biochem แนวโน้ม Bodmer et al. 2002 27:19-26 Compaan et al โครงสร้าง 5 ปี 2006 14:1321-1330 สหรัฐอเมริกาสิทธิบัตรหมายเลข Publ. 2011/0028688), ซิสเทอีน-ริช โดเมน (CRD) และโครงสร้างเหมือนบานพับในแคว้นภายนอกเซลล์ฮิวเมน มีระบุ CD134 CRDs มีรหัส CRD1, CRD2, CRD3 (ตัด) (ตัด) CRD4 (ดูรูปที่ 20) CRDs ประกอบด้วย topologically ประเภทของ เรียกว่าโมดูล A เป็นโมดูลและบีโมดูล (ดูรูปที่ 20) โมดูล A เป็น C-10 รูปโครงสร้าง และโมดูล B มีโครงสร้างเป็นรูปตัว S CRD โดยทั่วไปคือมักจะประกอบด้วยโมดู B2 A1 หรือ A2 B1 โม (หรือ ไม่ บ่อย การคู่แตกต่างกันของโมดูล เช่นอัล-B1) กับ 6 อยู่ตกซิสเทอีน โดยที่ ตัวเลขแสดงจำนวนของสะพานไดซัลไฟด์ภายในแต่ละโมดู (โปรดดู รูป 20) ดังแสดงในรูป 20 ฮิวเมน 3 แตกต่างกันคอนสตรัคต์ถูก CD134 15 สร้าง และแสดง: ฮิวเมน (1) ปราศจาก CD134 คอนสตรัคต์ ซึ่งเริ่มต้นด้วย เทอร์มินัล N CRD1 (เช่น CRD1 A1 B2-โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 29-65), และ สามารถบุจึง เป็น 'CRD1' และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 1-277 (ดูรหัสลำดับหมายเลข 1),(2) ' CRD3' คอนสตรัคต์ ซึ่งเริ่มต้น ด้วย N-สถานี CRD3 (เช่น CRD3 อัล-Bl-โมดูล กรดอะมิโน 108 146 ครอบคลุม (ตาม Compaan et al. ปี 2006 โครงสร้าง 14:1321-20 1330) หรือตัดครอบคลุม CRD3 อัลโมดูลกรดอะมิโน 108-126 (ตามการ Latza et al. Eur J Immunol 1994 24:677-683)), และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 108 - 277 กับสัญญาณกรดอะมิโนเพปไทด์ 1-28 (ดูเลขลำดับ ID: 31), (3) 'CRD4' คอนสตรัคต์ ซึ่งประกอบด้วย CRD3 CRD4 N-เทอร์มินัลหรือโดเมนย่อย B1-โมดูล/ตัด CRD4 อัลโมดูล (เช่น CRD4 อัล-B1-โมดูลครอบคลุมอะมิโน กรด 25 127-167 (Latza et al. Immunol Eur J 1994; 24:677-683) หรือผสม (ไม่ แสดงในรูปที่ 20) ของโดเมนย่อย CRD3 B1-โมดูลกับตัด CRD4 อัล - โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 127 146 กับกรดอะมิโนตามลำดับ 147-167 (Compaan et al. 2006 โครงสร้าง 14:1321-1330)), และกรดอะมิโน ประกอบรวมด้วยd 127 - 277 กับสัญญาณกรดอะมิโนเพปไทด์ 1-28 (ดูเลขลำดับ ID: 32) โดยมีสภา 30 PCR โดยใช้ Accuprimem Pfx ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Invitrogen), ฮิวเมนเหล่านี้ 3 CD134 คอนสตรัคต์ถูกสร้างโดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 2ตารางที่ 2สั้น ๆ cDNA เข้า 28 1 กรดอะมิโนเพปไทด์สัญญาณและการเข้ารหัส cDNAกรดอะมิโน 66 277 ของฮิวเมน CD134 ถูกขยายโดยใช้คู่รองพื้นตามลำดับ 362/367 และ 366/363 ในปฏิกิริยา PCR มีฮิวเมนปราศจาก CD134 เป็นการ แม่ 10 ในเวลาต่อมา 'CRD3' คอนสตรัคต์ถูกสร้างขึ้น โดยใช้ PCR สองเหล่านี้ ผลิตภัณฑ์ในแอสเซมบลี PCR โดยใช้รองพื้นคู่ 362/363 การเข้ารหัส cDNA 'CRD3' คอนสตรัคต์เป็นโคลนย่อยเป็น plasmid มา pcDNA3.1 นิพจน์โดยใช้ ข้อจำกัดเหมาะสมไซต์ เหมือนกับ 'CRD4' คอนสตรัคต์ (กรดอะมิโน 1-28 ของสัญญาณ สร้างเพปไทด์กับกรดอะมิโน 127 277) และโคลนย่อยใน pcDNA3.1 -15 มา plasmids นิพจน์โดยใช้ไพรเมอร์ตรงที่แสดงใน ตารางดังกล่าวข้างต้น นอกจากนี้ ฮิวเมนปราศจาก CD134 (เลขลำดับรหัส: 1) ที่ยังใหม่โคลนใน plasmid มา pcDNA3.1 นิพจน์ใช้ระบบ FreeStyleTM 293 นิพจน์ (เทคโนโลยีชีวิต),FreeStyleTM 293 F เซลล์ (ชีวิตเทคโนโลยี) ได้ transfected กับตัวแปร 3 20 สร้างของฮิวเมน transiently CD134 หลังจาก 48h ผิวฮิวเมน CD134 นิพจน์ ในเซลล์ transfected ถูกวิเคราะห์ โดยวิเคราะห์ FACS เพื่อการนี้ transfected เซลล์ เก็บเกี่ยว และ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เสริม ด้วยความล่า ช้า/mL บริสุทธิ์ 50 ฮิวเมน IgG (ซิก บล็อก Fcy รีเซปเตอร์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดังแสดงในรูป 33 (ฮิวเมนยาวเต็มรูปแบบเซลล์ CD134-transfected โคลนไม่มี 10 5 จากระดับพื้นผิว CD134 สูงแสดงออก. 1 n =) เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 20E5, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134
โคลน 20E5 และทั้งหกรุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134
โคลน 20E5 ยา dependently
และผูกไว้โดยเฉพาะให้กับเซลล์ผิวแสดงฮิวเมนCD134 เมาส์ผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5, ไคเมริก 15 ฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 และฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ -
ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 20E5 รุ่น 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1,
20E5 VL2VH2 และ 20E5_VL2VH3
แสดงให้เห็นเส้นโค้งไตเตรทที่คล้ายกันซึ่งชี้ให้เห็นว่าแอนติเจนCD134
ของพวกเขาผูกพันความสัมพันธ์คือคล้ายกันมากในขณะที่ฮิวเมไนซ์IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 รุ่น VL1H1 และ 20 VL1H2 . ดูเหมือนจะแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันลดลงเล็กน้อยดังแสดงในรูปที่34 (ฮิวเมนความยาวเต็มเซลล์ CD134-transfected โคลน no. 5 ที่มีพื้นผิวสูงระดับการแสดงออกของ CD134; n = 2) เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3, ไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 และทั้งหกรุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดี 25 โคลน 12H3 ยา dependently และ ผูกไว้โดยเฉพาะให้กับเซลล์ผิวแสดงฮิวเมนCD134 เมาส์ผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3, ไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และฮิวเมไนซ์ IgG4tc แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 รุ่น 12H3_VL2H1 และ 12H3 VL2VH3, แสดงให้เห็นเส้นโค้งไตเตรทที่เหมือนกันซึ่งชี้ให้เห็นว่าแอนติเจน CD134 ของพวกเขา30 มีผลผูกพันความสัมพันธ์ที่เหมือนกันคือในขณะที่ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 รุ่น 12H3_VL1H1, 12115 VL1H2, 12H3_VL1H3 และ12H3_VL2H2 ดูเหมือนจะแสดงให้เห็นความสัมพันธ์เล็กน้อยผูกพันที่สูงขึ้น. ดังแสดงในรูปที่ 35 (ฮิวเมนความยาวเต็มเซลล์ CD134-transfected โคลน no. 23 พื้นผิวกลาง CD134 ระดับแสดงออก n = 2) เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3, ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 และทั้งหกรุ่นฮิว เมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 5 แอนติบอดีโคลน 12H3 dependently ยาและผูกไว้โดยเฉพาะให้กับเซลล์ผิวแสดงฮิวเมนCD134 เมาส์ผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 แสดงให้เห็นเส้นโค้งไตเตรทที่คล้ายกันซึ่งชี้ให้เห็นว่าแอนติเจนCD134 ของพวกเขาผูกพันความสัมพันธ์ที่มีความคล้ายคลึง(EC50> 200 นาโนกรัม / มิลลิลิตร) ในขณะที่ทั้งหกฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน10 CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 รุ่น - 12H3 VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 และ 12H3_VL2VH3 - ดูเหมือนจะแสดงให้เห็นความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันที่สูงขึ้น( EC5o <200 นาโนกรัม / มิลลิลิตร). โดยรวมแล้วผลการ cytometric ไหลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าฮิวเมไนซ์IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 รุ่น 20E5 20E5_VL1H3, 15 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2, 20E5_VL2VH3 เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 และไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 แสดงให้เห็นว่าแอนติเจน CD134 คล้ายผูกพันความสัมพันธ์ในขณะที่ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 รุ่น 20E5 20E5_VL1111 และ 20E5_VL1H2 ดูเหมือนจะแสดงลดลงเล็กน้อยแอนติเจน CD134 ผูกพันความสัมพันธ์ นอกจากนี้ผลการค้นหา 20 แสดงให้เห็นว่าทั้งหกฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าแอนติเจน CD134 ที่สูงขึ้นมีผลผูกพันความสัมพันธ์มากกว่าผู้ปกครองเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และ ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ -. ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 25 (ง) การยึดเกาะของฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี12H3 และ 20E5 กับยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ต่างๆถูกตัดทอนฮิวเมนCD134 คอนสตรั . คต์แสดงบน 293-F สายพันธุ์ของเซลล์ (มาซึ่งการทำแผนที่โดเมน) เพื่อที่จะวิเคราะห์ความจำเพาะที่ดีของฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5, เอพิ โทปสถานที่ได้รับการยอมรับ 30 โดยฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ20E5 ถูกกำหนดโดยการทำแผนที่โดเมน ความสามารถของฮิวเมไนซ์ IgGLIK แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ผูกกับตัดทอนฮิวเมนCD134 คอนสตรัคต์แสดงบนพื้นผิวของ (HEK มา) . เซลล์ 297-F, ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์การไหลของ cytometric จากวรรณกรรม (สวิส Prot: P43489.1; Latza et al, Eur J Immunol 1994. 24:. 677-683; Bodmer et al, แนวโน้ม Biochem วิทย์ 2002; 27: 19-26; Compaan et al. 5 โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330; สิทธิบัตรสหรัฐอเมริกาเลขที่ 2011/0028688 Publ), ซิสเทอีนที่อุดมไปด้วยโดเมน(CRD) และโครงสร้างบานพับเหมือนในภายนอกเซลล์ พื้นที่ของฮิวเมนCD134 ถูกระบุ CRDs จะเขียน CRD1, CRD2 (ตัด) CRD3, (ตัด) CRD4 (ดูรูปที่ 20) CRDs มีประเภทที่แตกต่างทอพอโลยีของโมดูลที่เรียกว่าA-โมดูลและ B-โมดูล (ดูรูปที่ 20) โมดูล-A เป็น C- 10 โครงสร้างที่มีรูปร่างและ B-โมดูลจะมีโครงสร้างเป็นรูปตัว S CRD โดยทั่วไปมักจะประกอบด้วยA1-B2 โมดูลหรือ A2-B1 โมดูล (หรือน้อยเป็นคู่ที่แตกต่างกันของโมดูลเช่นAl-B1) มี 6 อนุรักษ์ซิสเทอีนตกค้างโดยที่หมายถึงตัวเลขจำนวนไดซัลไฟด์สะพานในแต่ละโมดูล (ดูรูปที่20) ดังแสดงในรูปที่ 20 3 ที่แตกต่างกันฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ถูก15 สร้างและแสดง (1) ยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ซึ่งเริ่มต้นด้วยCRD1 n- ขั้ว (เช่น CRD1 A1-B2 โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 29-65) และแสดงจึงเป็น`CRD1 'และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 1-277 (ดูรหัส SEQ NO. 1), (2)` CRD3' คอนสตรัค ต์ซึ่งเริ่มต้นด้วย CRD3 n- ขั้ว (เช่น CRD3 Al-Bl โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน108-146 (ตาม Compaan et al, โครงสร้าง 2006; 14:. 1321- 20 1330) หรือตัดทอน CRD3 อัลโมดูลครอบคลุมกรดอะมิโน 108-126 (ตามLatza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677-683)) และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 108 277 ที่เชื่อมโยงกับสัญญาณอะมิโนเปปไทด์กรด 1-28 (ดู SEQ ID NO: 31) (3) `CRD4 'คอนสตรัคต์ซึ่งประกอบด้วยn- ขั้ว CRD4 หรือโดเมนย่อย CRD3 B1 โมดูล / ตัด CRD4 อัลโมดูล (เช่น CRD4 Al-B1 โมดูลครอบคลุมอะมิโน25 กรด 127-167 (Latza . et al, Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรือการรวมกัน (ไม่ได้แสดงในรูปที่20) ของ CRD3 โมดูล B1-ย่อยกับตัดทอน CRD4 Al- โมดูลครอบคลุมกรดอะมิโนที่มี 127-146 147-167 กรดอะมิโน, ตาม ลำดับ(Compaan et al, โครงสร้าง 2006 14: 1321-1330)) และประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนง 127- 277 ที่เชื่อมโยงกับสัญญาณอะมิโนเปปไทด์กรด 1-28 (ดู SEQ ID NO: 32) โดยการชุมนุมวันที่ 30 PCR โดยใช้ดีเอ็นเอ Accuprimem PFX โพลิเมอร์ (Invitrogen) ทั้ง 3 ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 2 ตารางที่ 2 สั้น ๆ , การเข้ารหัส cDNA กรดอะมิโนเปปไทด์ 1-28 ของสัญญาณและยีน การเข้ารหัสกรดอะมิโน66-277 ของฮิวเมน CD134 ถูกขยายตามลำดับโดยใช้คู่ไพรเมอร์362/367 และ 366/363 ในปฏิกิริยา PCR ที่มีความยาวเต็มฮิวเมน CD134 เป็น10 แม่แบบ ต่อจากนั้น `CRD3 'คอนสตรัคต์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ทั้งสองวิธี PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ในการชุมนุมโดยใช้คู่ไพรเมอร์ 362/363 ยีนเข้ารหัส`CRD3 'คอนสตรัคต์ WAS โคลนย่อยเป็นพลาสมิดแสดงออก pcDNA3.1 ที่ได้มาจากการใช้เว็บไซต์ข้อจำกัด ที่เหมาะสม ในทำนองเดียวกัน `CRD4 'คอนสตรัคต์ (กรดอะมิโนที่ 1-28 ของสัญญาณเปปไทด์ที่เชื่อมโยงกับกรดอะมิโน127-277) ถูกสร้างขึ้นและโคลนย่อยใน pcDNA3.1- 15 มาพลาสมิดแสดงออกโดยใช้ไพรเมอร์ที่สอดคล้องกันที่แสดงในตารางข้างต้น นอกจากนี้ยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 (SEQ ID NO: 1). ยังเป็นโคลนอีกครั้งในพลาสมิดแสดงออก pcDNA3.1 ที่ได้มาจากการใช้FreeStyleTM 293 ระบบการแสดงออก (เทคโนโลยีชีวิต) FreeStyleTM เซลล์ 293-F (เทคโนโลยีชีวิต ) ถูก transfected transiently กับ 3 20 สร้างสายพันธุ์ของฮิวเมน CD134 หลังจาก 48h พื้นผิวฮิวเมนแสดงออก CD134 เซลล์ transfected ได้รับการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์มาซึ่ง ด้วยเหตุนี้เซลล์ transfected ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เสริมด้วยความล่าช้า 50 มิลลิลิตร / บริสุทธิ์ฮิวเมน IgG (ซิกม่า; ปิดกั้น FCY รีเซปเตอร์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดังแสดงในรูป 33 ( ฮิวเมนเต็มตัว cd134 transfected เซลล์โคลนหมายเลข 10 5 ระดับ สูง ผิว cd134 นิพจน์ n = 1 ) ของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ไคเมริกฮิวเมน , igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดี
โคลน 20e5 ทั้งหมด 6 รุ่น ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 dose dependently และโดยเฉพาะต้องผิวเซลล์แสดง
ฮิวเมน cd134 . ของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ไคเมริก 15 , ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 20e5 ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ -
ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 รุ่น 20e5_vl1h3 20e5_vl2h1
, ,20e5 vl2vh2 20e5_vl2vh3 แสดงเส้นโค้งและการไทเทรตที่คล้ายกันซึ่งพบว่าแอนติเจนของ cd134
binding affinity ความคล้ายคลึงกันมาก ในขณะที่
ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 รุ่น vl1h1 20 vl1h2 ดูเหมือนจะแสดงระดับต่ำลงเล็กน้อย ผูกติด

ตามที่แสดงในรูป 34 ( ฮิวเมนเต็มตัว cd134 transfected เซลล์โคลน
.5 ระดับ cd134 พื้นผิวการแสดงออก ; n = 2 ) ของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ไคเมริกฮิวเมน , igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดี
โคลน 12h3 ทั้งหมด 6 รุ่น ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนขนาด 25 12h3 dependently และโดยเฉพาะต้องผิวเซลล์แสดง
ฮิวเมน cd134 .ของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ไคเมริก
, ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 12h3 ฮิวเมไนซ์ igg4tc แอนติ -
ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 12h3 รุ่น 12h3_vl2h1 12h3 vl2vh3
แสดงเส้นโค้ง , ไทเทรตเหมือนกัน ซึ่งพบว่าแอนติเจนของ cd134
30 ความสัมพันธ์ความผูกพันเหมือนกันส่วนฮิวเมไนซ์ igg4k . แอนติ - ฮิวเมน cd134
แอนติบอดีโคลน 12h3 รุ่น 12h3_vl1h1 12115 vl1h2 12h3_vl1h3 , ,
12h3_vl2h2 และดูเหมือนจะแสดงสูงกว่าเล็กน้อยผูกติด


ตามที่แสดงในรูป 35 ( ฮิวเมนเต็มตัว cd134 transfected เซลล์โคลนไม่
23 กับกลางผิว cd134 การแสดงออกระดับ ; n = 2 ) , แอนติ - เมาส์ ผู้ปกครอง
ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ไคเมริกฮิวเมน , igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 ทั้งหมด 6 รุ่น ฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
5 12h3 แอนติบอดีโคลนขนาด dependently และโดยเฉพาะต้อง
พื้นผิวเซลล์แสดงฮิวเมน cd134 . ของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3
และ ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 พบ
โค้งไทเทรตที่คล้ายกันซึ่งพบว่าแอนติเจนของ cd134 binding affinity
คล้ายคลึง ( ec50 > 200 นาโนกรัม / มิลลิลิตร ) ในขณะที่ทั้งหมดหกฮิวเมไนซ์ igg4k แอนติ - ฮิวเมน
10 cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 รุ่น - 12h3 vl1h1 12h3_vl1h2 12h3_vl1h3 12h3_vl2h1
, , , ,