PCR amplification targeting a mitoch

PCR amplification targeting a mitochondrial fragment of 6000 bp using the KOD Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase⁄ kit. The 25 ll long-range PCR reactions incorporated 12.5 ll of 2 Xtreme Buffer, 5 ll of dNTPs (2 mM each), 0.5 ll each of the heavy and light strand primers (10 lM), 0.5 units of KOD Xtreme™ HotStart DNA Polymerase (0.5 ll at a concentration of 1 U/ll), 2 ll of template DNA (at an approximate concentration of 0.8 ng/ll), and 4 ll of HPLC water. The thermal cycling conditions for the long- range amplification were as follows: intial denaturation at 94 C for 2 min, followed by 40 cycles of denaturation at 98 C for 10 s, primer annealing at 60 C for 30 s, and extension at 68 C for 6 min, with a final extension also at 68 C for an additional 6 min. PCR, with a final extension at 68 C for 7 min. PCR products were visualized on 1% agarose gels, using 3 ll of the amplified PCR product and 2 ll of a combination of GelRed™ nucleic acid stain and 5 Green GoTaq Reaction Buffer (proportion 1:40).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การกำหนดเป้าหมายส่วน mitochondrial ของ bp 6000 ใช้ชุดโฮโปรด™ร้อนเริ่มต้นดีเอ็นเอ Polymerase⁄ amplification PCR ที่ 25 จะพิสัย PCR ปฏิกิริยารวม 12.5 จะบัฟเฟอร์ Xtreme 2, 5 ll ของ dNTPs (2 มิลลิเมตรแต่ละ), 0.5 จะทุกของหนักและไฟสแตรนไพรเมอร์ (10 lM), 0.5 หน่วยของโปรดโฮ™ HotStart ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (0.5 จะที่ความเข้มข้นของ 1 U ll), 2 จะของดีเอ็นเอแม่แบบ (ที่มีประมาณความเข้มข้นของ ng จะ 0.8)และ 4 จะน้ำ HPLC สภาพขี่ความร้อนสำหรับ amplification ช่วงยาวมีดังนี้: denaturation intial ที่ 94 C สำหรับ 2 นาที ตาม ด้วยวงจร 40 การ denaturation ที่ 98 C 10 s พื้นการอบเหนียวที่ 60 C 30 s และส่วนขยายที่ 68 C สำหรับขั้นต่ำ 6 ขยาย final ที่ C 68 สำหรับการลด 6 เพิ่มเติม PCRขยาย final ที่ 68 C สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR 7 นาทีมี visualized บน 1% agarose ใช้ 3 ll ผลิตภัณฑ์ PCR amplified และ 2 ll GelRed ™กรดนิวคลีอิกคราบและบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา GoTaq เขียว 5 (สัดส่วน 1:40)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PCR Ampli Fi ไอออนบวกการกำหนดเป้​​าหมายส่วนยล 6000 bp ใช้ KOD Xtreme ™เริ่มร้อนดีเอ็นเอชุด Polymerase/ 25 จะเกิดปฏิกิริยา PCR ระยะยาวที่จัดตั้งขึ้น 12.5 LL 2 Xtreme Buffer, 5 LL ของ dNTPs (2 มิลลิแต่ละ), 0.5 LL แต่ละหนักและไพรสาระแสง (10 LM) 0.5 หน่วย KOD Xtreme ™ HotStart ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (0.5 LL ที่ความเข้มข้น 1 U / LL) LL 2 ของแม่ดีเอ็นเอ (ที่ความเข้มข้นประมาณ 0.8 ng / LL) และ 4 LL น้ำ HPLC เงื่อนไขการขี่จักรยานการระบายความร้อนสำหรับช่วงยาวไอออนบวก Fi Ampli มีดังนี้ denaturation intial ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 98 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาที, การหลอมไพรเมอร์ที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและนามสกุลที่ 68 C 6 นาที, ที่มีนามสกุล NAL ในไฟยังที่ 68 องศาเซลเซียสเป็นเวลาอีก 6 นาที วิธี PCR ที่มีนามสกุล NAL ในสายที่ 68 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการมองเห็นในวันที่ 1% agarose เจลโดยใช้ 3 LL ของสาย Ampli เอ็ดผลิตภัณฑ์ PCR และ 2 LL ของการรวมกันของ GelRed ™คราบกรดนิวคลีอิกและ 5 สีเขียว GoTaq ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ (สัดส่วน 01:40)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดยการ ampli จึงเล็งตัดส่วนของ 6 , 000 BP ใช้รหัส โปรด™ร้อนเริ่มต้น DNA polymerase ⁄ kit 25 จะระยะยาว PCR ปฏิกิริยารวม 12.5 จะ 2 , บัฟเฟอร์ , 5 จะ dntps ( 2 มม. แต่ละ ) , 0.5 จะทั้งหนักและเบา ชายหาด ไพรเมอร์ ( 10 LM ) 0.5 หน่วยของรหัส โปรด™ hotstart DNA polymerase ( 0.5 จะที่ความเข้มข้น 1 U / ll )2 จะดีเอ็นเอแม่แบบ ( ที่ความเข้มข้นประมาณ 0.8 กรัม / ll ) และ 4 จะหาน้ำ โดยจักรยานเงื่อนไขยาว ช่วง ampli จึงบวกมีดังนี้ ( ยูคาลิปตัสที่ 94 C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 40 รอบ ( ที่ 98 C 10 S , ไพรเมอร์อบที่ 60 C 30 , และส่วนขยายที่ 68 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 นาที กับนามสกุลที่ 68 จึงนาล C อีก 6 นาทีตรวจด้วยระบบการถ่ายทอดที่ 68 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 7 นาที ซึ่งเป็นภาพผลิตภัณฑ์บน 1% เจล ( ใช้ 3 จะของ ampli จึงเอ็ดเทคนิคผลิตภัณฑ์ และ 2 จะได้ของการรวมกันของ gelred ™กรดนิวคลีอิกคราบและ 5 สีเขียว gotaq ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ ( สัดส่วน 1 : 40 ) .