Two constructs encoding the primary

Two constructs encoding the primary biosynthetic activities for omega-3 LC-PUFA biosynthesis (p5_EPA and p7_DHA) were prepared for introduction into C. sativa. Construct p5_EPA was designed to produce high levels of EPA in seeds and contained five genes (Figure 1b), while construct p7_DHA was designed to accumulate both EPA and DHA, and contained seven genes (Figure 1b). In both cases, individual biosynthetic activities were encoded by codon-optimized sequences under the independent control of seed-specific promoters (Figure 1b; see also Experimental procedures). These two constructs were introduced into C. sativa plants via Agrobacterium-mediated floral transformation. The transformation of C. sativa and expression of these constructs resulted in no change in the germination, development or stature of the transgenic plants (Figure S1). Analysis of total fatty acid methyl esters (FAMEs) from the seeds of eight individual transgenic C. sativa T2 lines expressing the p5_EPA construct demonstrated accumulation of significant levels of EPA (Table S1). The mean levels of EPA found in these T2 lines ranged from 6.8 to 18.7% of total fatty acids in mature seeds (mean 13.8%). As observed previously, the amount of oleic acid (18:1 n-9, OA) decreased dramatically from 14.5% in the untransformed control to 5.9% in transgenic C. sativa seeds expressing the O. tauri Δ6-desaturase (Sayanova et al., 2011a). In agreement with previous results obtained with expression of acyl CoA Δ6-desaturases in transgenic plants (Hoffmann et al., 2008; Petrie et al., 2010; Sayanova et al., 2011a; Ruiz-Lopez et al., 2012, 2013), only a minor accumulation of C18 Δ6-desaturated fatty acids was observed: the mean levels of GLA and stearidonic acid (18:4 n-3, SDA) in T2 seeds were 2.7% and 2.9% of total fatty acids, respectively (Table S1). Similarly, the mean levels of the omega-6 LC-PUFA intermediates arachidonic acid (20:4 n-6, ARA) and dihomo-γ-linolenic acid (20:3 n-6, DGLA) were 1.7% and 0.8%, respectively. Overall, levels of newly synthesized omega-3 fatty acids were much higher than those of omega-6 acids, with an n-3/n-6 ratio of 9:1. It is interesting to note that the health-promoting effects of LC-PUFAs are dependent on maintenance of the correct balance between omega-3 and omega-6 PUFA. A lower ratio of omega-6/omega-3 fatty acids is more desirable to reduce the risk of many of the chronic diseases of now prevalent in Western societies.

Analysis of seed FAMEs in control (Figure 2a) and T3 lines expressing p5_EPA showed an increase in EPA content (14.7% of total fatty acids in seeds). In contrast to the mean T2 value, the highest EPA value observed in an individual T3 line (named RRes_EPA) was 23.9% (Figure 2c and Table S1). Further analyses demonstrated that the highest EPA value observed in an individual seed of RRes_EPA was 31% of total fatty acids (Figure 2d). Previous reports on high EPA accumulations (e.g. Cheng et al., 2010) focused on the zero-erucic acid Brassica carinata, with a mean EPA level of 20.4% in transgenic seeds. However, the potential of B. carinata as a source of omega-3 was compromised by the inefficient Δ6-elongation step, which resulted in accumulation of GLA and SDA (26.9% and 5.4% of total fatty acids, respectively).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สองโครงสร้างรหัสกิจกรรมหลัก biosynthetic สำหรับโอเมก้า-3 LC PUFA สังเคราะห์ (p5_EPA และ p7_DHA) ถูกเตรียมไว้สำหรับแนะนำเข้าสู่ซีซา P5_EPA โครงสร้างถูกออกแบบมาเพื่อผลิตระดับสูงของ EPA ในเมล็ด และประกอบด้วยห้ายีน (รูปที่ 1b), ในขณะที่สร้าง p7_DHA ถูกออกแบบให้สะสมทั้ง EPA และดีเอชเอ และประกอบด้วยเจ็ดยีน (รูปที่ 1b) ในทั้งสองกรณี แต่ละกิจกรรม biosynthetic ถูกเข้ารหัส โดยลำดับรหัสพันธุกรรมที่เหมาะภายใต้การควบคุมอิสระของก่อเฉพาะเมล็ด (รูปที่ 1b ขั้นตอนทดลองยังดู) โครงสร้างสองเหล่านี้ถูกนำเข้าสู่พืชซีซาผ่านแปลงดอกไม้ mediated อโกรแบคทีเรียม การเปลี่ยนแปลงของซีซาและของโครงสร้างเหล่านี้ส่งผลให้ไม่เปลี่ยนแปลงในการงอก พัฒนา หรือรูปร่างของพืชถั่วเหลือง (รูป S1) การวิเคราะห์กรดไขมันรวม methyl esters (FAMEs) จากเมล็ดของบรรทัดละถั่วเหลืองซา C. T2 8 แสดงโครงสร้างของ p5_EPA แสดงให้เห็นว่าการสะสมระดับสำคัญของ EPA (ตาราง S1) ระดับเฉลี่ยของ EPA พบในรายการ T2 เหล่านี้อยู่ในช่วงจาก 6.8 18.7% ของกรดไขมันทั้งหมดในเมล็ดผู้ใหญ่ (หมายถึง 13.8%) เท่าที่สังเกตก่อนหน้านี้ จำนวน oleic กรด (n-9 18:1, OA) ลดลงอย่างมากจาก 14.5% ในการควบคุม untransformed 5.9% ในเมล็ดถั่วเหลือง C. ซาแสดง tauri โอ Δ6-desaturase (Sayanova et al., 2011a) ยังคงผลลัพธ์ก่อนหน้าได้ ด้วยของ acyl CoA Δ6 desaturases ในถั่วเหลืองพืช (Hoffmann et al., 2008 Petrie et al., 2010 Sayanova และ al., 2011a Ruiz-Lopez et al., 2012, 2013), เพียงสะสมรอง C18 Δ6 desaturated กรดไขมันที่พบ: ในระดับเฉลี่ยของจีแอลเอและ stearidonic กรด (n-3 18:4, SDA) ในเมล็ด T2 มีการ 2.7% และ 2.9% ของกรดไขมันทั้งหมด ตามลำดับ (ตาราง S1) ในทำนองเดียวกัน ในระดับเฉลี่ยของกรด arachidonic intermediates LC PUFA ของโอเมก้า-6 (n-6 20:4, ARA) และ dihomo-γ-linolenic กรด (n-6 20:3, DGLA) ได้ 1.7% และ 0.8% ตามลำดับ โดยรวม ระดับของกรดไขมันโอเมก้า-3 เพิ่งสังเคราะห์ได้สูงกว่าของกรดโอเมก้า-6 มีอัตราส่วน 9:1 n-3/n-6 การ เป็นที่น่าสนใจเพื่อทราบว่า LC PUFAs ผลส่งเสริมสุขภาพจะขึ้นอยู่กับการบำรุงรักษาถูกต้องสมดุลระหว่างโอเมก้า 3 และโอเมก้า-6 PUFA อัตราส่วนที่ต่ำกว่ากรดไขมันโอเมก้า-6/โอ เมก้า-3 คือต้องการมากขึ้นเพื่อลดความเสี่ยงของโรคเรื้อรังของตอนนี้แพร่หลายในสังคมของตะวันตกวิเคราะห์ของเมล็ด FAMEs ในการควบคุม (รูป 2a) และ T3 บรรทัดแสดง p5_EPA พบเพิ่มในเนื้อหา EPA (14.7% ของกรดไขมันทั้งหมดในเมล็ด) ตรงข้ามหมายถึงค่า T2 ค่า EPA สูงสุดในแต่ละ T3 บรรทัด (ชื่อ RRes_EPA) เป็น 23.9% (รูปที่ 2 c และตาราง S1) วิเคราะห์เพิ่มเติมแสดงว่า ค่า EPA สูงสุดที่พบในเมล็ดแต่ละตัวของ RRes_EPA อยู่ 31% ของกรดไขมันทั้งหมด (รูปที่ 2d) รายงานก่อนหน้านี้บน accumulations EPA สูง (เช่นเฉิง et al., 2010) เน้นกรดศูนย์ erucic carinata ผัก ด้วย EPA ระดับยัง 20.4% ในเมล็ดถั่วเหลืองหมายความว่า อย่างไรก็ตาม ศักยภาพของ carinata เกิดเป็นแหล่งของโอเมก้า 3 ถูกทำลายตอน Δ6 elongation ต่ำ ซึ่งทำให้เกิดการสะสมของจีแอลเอและ SDA (26.9% และ 5.4% ของกรดไขมันทั้งหมด ตามลำดับ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สองโครงสร้างการเข้ารหัสกิจกรรมชีวสังเคราะห์หลักสำหรับโอเมก้า 3 สังเคราะห์ LC-PUFA (p5_EPA และ p7_DHA) กำลังเตรียมพร้อมสำหรับการเปิดตัวเข้ามาในซี sativa สร้าง p5_EPA ถูกออกแบบมาเพื่อการผลิตระดับสูงของ EPA ในเมล็ดและมีห้ายีน (รูปที่ 1 ข) ในขณะที่การสร้าง p7_DHA ถูกออกแบบมาเพื่อสะสมทั้ง EPA และ DHA และมีเจ็ดยีน (รูปที่ 1b) ในทั้งสองกรณีกิจกรรมชีวสังเคราะห์ของแต่ละบุคคลที่ถูกเข้ารหัสโดยลำดับ codon ที่ดีที่สุดภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์อิสระเมล็ดเฉพาะ (รูปที่ 1b; ดูขั้นตอนการทดลอง) ทั้งสองโครงสร้างที่ถูกนำเข้ามาในซีพืช sativa ผ่าน Agrobacterium พึ่งการเปลี่ยนแปลงดอกไม้ การเปลี่ยนแปลงของซี sativa และการแสดงออกของโครงสร้างเหล่านี้ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการงอกของการพัฒนาหรือความสูงของพืชดัดแปรพันธุกรรมไม่มี (รูปที่ S1) การวิเคราะห์เมทิลเอสเตอร์ของกรดไขมันรวม (FAMEs) จากเมล็ดพันธุ์แต่ละแปดซีสาย T2 sativa แสดงการสะสม p5_EPA สร้างแสดงให้เห็นถึงระดับที่สำคัญของ EPA (ตารางที่ S1) ระดับเฉลี่ยของ EPA ที่พบในสาย T2 เหล่านี้อยู่ในช่วง 6.8-18.7% ของกรดไขมันทั้งหมดในเมล็ดผู้ใหญ่ (เฉลี่ย 13.8%) ขณะที่ก่อนหน้านี้ตั้งข้อสังเกตปริมาณของกรดโอเลอิก (ที่ 18: 1 n-9, OA) ลดลงอย่างมากจาก 14.5% ในการควบคุม untransformed 5.9% ในเมล็ดพันธุ์ซี sativa แสดงทุม Tauri Δ6-desaturase (Sayanova et al, , 2011a) ในข้อตกลงกับผลที่ก่อนหน้านี้ได้มีการแสดงออกของ acyl CoA Δ6-desaturases ในพืชดัดแปรพันธุกรรม (Hoffmann et al, 2008;. เพท et al, 2010;. Sayanova, et al, 2011a.. Ruiz-โลเปซ, et al, 2012, 2013) เพียงสะสมเล็ก ๆ น้อย ๆ ของ C18 Δ6-desaturated กรดไขมันที่เป็นข้อสังเกต: ระดับเฉลี่ยของ GLA และกรด stearidonic (18: 4 n-3, SDA) ในเมล็ด T2 เป็น 2.7% และ 2.9% ของกรดไขมันรวมตามลำดับ (ตารางที่ S1) ในทำนองเดียวกันในระดับเฉลี่ยของโอเมก้า 6 ตัวกลาง LC-PUFA กรด arachidonic (20: 4 n-6, ARA) และกรด dihomo-γ-linolenic (20: 3 n-6, DGLA) เป็น 1.7% และ 0.8% ตามลำดับ โดยรวม, ระดับของการสังเคราะห์ใหม่โอเมก้า 3 กรดไขมันที่มีมากสูงกว่าของโอเมก้า 6 กรดกับ n-3 / n-6 อัตราส่วน 9: 1 เป็นที่น่าสนใจที่จะต้องทราบว่าผลการส่งเสริมสุขภาพของ LC-PUFAs จะขึ้นอยู่กับการบำรุงรักษาของความสมดุลที่ถูกต้องระหว่างโอเมก้า 3 และโอเมก้า 6 PUFA อัตราส่วนที่ต่ำกว่าของโอเมก้า 6 / โอเมก้า 3 กรดไขมันที่เป็นที่ต้องการมากขึ้นเพื่อลดความเสี่ยงของหลายโรคเรื้อรังตอนนี้ที่แพร่หลายในสังคมตะวันตก. วิเคราะห์ FAMEs เมล็ดในการควบคุม (รูปที่ 2a) และสาย T3 แสดง p5_EPA แสดงให้เห็นว่า เพิ่มขึ้นในเนื้อหาของ EPA (14.7% ของกรดไขมันทั้งหมดในเมล็ด) ในทางตรงกันข้ามกับค่าเฉลี่ย T2 ค่า EPA สูงสุดสังเกตในสาย T3 ของแต่ละบุคคล (ชื่อ RRes_EPA) เป็น 23.9% (รูปที่ 2 c และ S1 ตาราง) การวิเคราะห์เพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่าค่า EPA สูงสุดพบว่าในเมล็ดของแต่ละ RRes_EPA เป็น 31% ของกรดไขมันทั้งหมด (รูปที่ 2d) รายงานก่อนหน้านี้ในการสะสม EPA สูง (เช่น Cheng et al., 2010) ที่มุ่งเน้นการ carinata Brassica กรดศูนย์ erucic, มีค่าเฉลี่ยระดับ EPA 20.4% ในเมล็ดพันธุ์ แต่ศักยภาพของ B. carinata เป็นแหล่งของโอเมก้า 3 ที่ถูกทำลายโดยขั้นตอนΔ6-การยืดตัวที่ไม่มีประสิทธิภาพซึ่งส่งผลให้เกิดการสะสมของ GLA และ SDA (ที่ 26.9% และ 5.4% ของกรดไขมันรวมตามลำดับ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สองโครงสร้างการเข้ารหัสการร่วมกิจกรรม 3 lc-pufa ชีวสังเคราะห์ ( p5_epa และ p7_dha ) เตรียมแนะนำเป็น C . sativa . สร้าง p5_epa ถูกออกแบบมาเพื่อผลิตระดับสูงของ EPA ในเมล็ดที่มีอยู่ห้ายีน ( รูปที่ 1A ) ในขณะที่สร้าง p7_dha ถูกออกแบบมาเพื่อสะสมทั้ง EPA และ DHA และมีอยู่เจ็ดยีน ( รูปที่ 1A ) ในทั้งสองกรณีกิจกรรมการส่งเสริมบุคคลถูกเข้ารหัสโดยปรับลำดับภายใต้ควบคุมอิสระของโปรโมเตอร์เฉพาะเมล็ด ( รูป 1B ; ดูยังขั้นตอนการทดลอง ) เหล่านี้สองโครงสร้างถูกแนะนำใน C . sativa พืชผ่านดอกไม้ Agrobacterium โดยการแปลง การเปลี่ยนแปลงของ C . sativa และการแสดงออกของโครงสร้างเหล่านี้ส่งผลให้มีการเปลี่ยนแปลงในการงอกของเมล็ดการพัฒนาหรือความสูงของพืชดัดแปรพันธุกรรม ตัวเลข ( S1 ) การวิเคราะห์ทั้งหมดของกรดไขมันเมทิลเอสเทอร์ ( FAMEs ) จากเมล็ดของต้น C . sativa T2 แปดแต่ละเส้นแสดง p5_epa สร้างแสดงให้เห็นถึงการสะสมของระดับนัยสำคัญของ EPA ( ตาราง S1 ) หมายถึงระดับของ EPA พบในบรรทัด T2 เหล่านี้ระหว่าง 6.8 ถึง 18.7 % ของกรดไขมันทั้งหมดเป็นเมล็ด ( ค่าเฉลี่ยร้อยละ 13.8 )เท่าที่สังเกตก่อนหน้านี้ ปริมาณกรดโอเลอิก ( 18 : 1 n-9 OA ) ลดลงอย่างมากจาก 14.5% ในการควบคุม untransformed ถึง 5.9% ในยีน C . sativa เมล็ดแสดง . tauri Δ 6-desaturase ( sayanova et al . , 2011a ) ในข้อตกลงกับผลลัพธ์ที่ก่อนหน้านี้ได้มีการแสดงออกของยีนในพืช , COA Δ 6-desaturases ( Hoffmann et al . , 2008 ; เพทรี et al . , 2010sayanova et al . , 2011a ; รู โลเปซ et al . , 2012 , 2013 ) เท่านั้น การสะสมเล็ก ๆน้อย ๆจาก c18 Δ 6-desaturated กรดไขมันที่พบ : หมายถึงระดับของ GLA stearidonic acid ( 18 : 4 และกรดไขมันในเมล็ด , T2 SDA ) อยู่ที่ 2.7 และร้อยละ 2.9 ของกรดไขมันทั้งหมด ตามลำดับ ( ตาราง S1 ) . พบว่า ระดับค่าเฉลี่ยของโอเมก้า 6 กรด arachidonic ( 20 : 4 n-6 lc-pufa intermediates ,