Materials and MethodsStrain Constru

Materials and Methods
Strain Construction
Bacterial strains, plasmids, and oligonucleotide primers used in this study are listed in
Tables I and II. Oligonucleotide primers were purchased from Integrated DNA
Technologies, Inc. (Coralville, IA). Chemicals and reagents were purchased from Fisher
Scientific (Pittsburgh, PA) unless otherwise specified. E. coli K-12 MG1655 was obtained
from the E. coli Genetic Stock Center (New Haven, CT) and was the background strain used
in this work. Strain RL01 was constructed by deleting the fadD gene from the MG1655
chromosome by λRed-mediated recombination (Datsenko and Wanner, 2000) using the
λRed recombinase encoded on plasmid pKD46. Plasmid pKD13 was used as the template
for amplification of the linear cassette using primers 1 and 2. The kan cassette was removed
by expressing the FLP recombinase encoded on plasmid pCP20. Strain NRD204 (K-12
MG1655 araBAD::cat; De Lay and Cronan, 2007) was generously donated by Dr. Cronan
(University of Illinois at Urbana-Champaign). Strain RL07 was constructed by P1 phage
transduction (Thomason et al., 2007) of the araBAD::cat insertion into strain RL01 via a
modified protocol utilizing selective plates containing 1.25 mM sodium pyrophosphate as a
calcium chelator. The cat cassette was removed using pCP20 producing strain RL08. To
minimize the possible presence of multiple insertions by λRed recombination, all
recombinant strains were used as donors to transduce back into the parent strain. Gene
insertions and deletions were verified by colony polymerase chain reaction (PCR) using
primers 3 and 4 for fadD and 5 and 6 for araBAD, and by the absence of growth after plating
on M9 agar supplemented with either 0.1% (w/v) sodium oleate (TCI America, Portland,
OR) as previously described (Overath et al., 1969), or 0.4% (w/v) L-arabinose (Calbiochem,
San Diego, CA) as carbon sources (Supplementary Fig. 1).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการต้องใช้ก่อสร้างสายพันธุ์แบคทีเรีย plasmids และ oligonucleotide ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้ตั้งอยู่ในตารางดาว ซื้อจากดีเอ็นเอรวม oligonucleotide ไพรเมอร์เทคโนโลยี อิงค์ (Coralville, IA) สารเคมีและ reagents ซื้อจากฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์ (พิตส์เบิร์ก PA) E. coli K 12 MG1655 กล่าวจาก E. coli พันธุหุ้น (นิวเฮ CT) และ พันธุ์พื้นหลังที่ใช้ในงานนี้ ต้องใช้ RL01 ถูกสร้าง โดยการลบยีน fadD จาก MG1655โครโมโซม โดย recombination λRed mediated (Datsenko และ Wanner, 2000) โดยใช้การเข้าใน plasmid pKD46 recombinase λRed Plasmid pKD13 ถูกใช้เป็นแม่แบบการขยายของเทปเชิงเส้นโดยใช้ไพรเมอร์ 1 และ 2 เทปกันถูกเอาออกโดยการแสดง recombinase FLP เข้าใน plasmid pCP20 สายพันธุ์ NRD204 (K-12MG1655 araBAD::cat เดอเลย์และ Cronan, 2007) ได้รับบริจาค โดยดร. Cronan(มหาวิทยาลัยอิลลินอยส์เออร์บานาแชมเพน) ต้องใช้ RL07 ถูกสร้างขึ้น โดย P1 phagetransduction (Thomason et al., 2007) การแทรก araBAD::cat ใน RL01 ต้องใช้ผ่านการปรับเปลี่ยนโพรโทคอลที่ใช้ประกอบด้วย pyrophosphate โซเดียม 1.25 มม.เป็นแผ่นที่ใช้เป็นแคลเซียม chelator ตลับแมวถูกเอาออกโดยใช้ pCP20 producing ต้องใช้ RL08 ถึงลดก็สามารถแทรกหลาย โดย λRed recombination ทั้งหมดสายพันธุ์ recombinant ถูกใช้เป็นผู้บริจาคเพื่อ transduce กลับเข้าไปในสายพันธุ์หลัก ยีนแทรกและการลบได้ถูกตรวจสอบโดยฝูงพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR)ไพรเมอร์ที่ 3 และ 4 สำหรับ fadD และ 5 และ 6 สำหรับ araBAD และการขาดงานของการเจริญเติบโตหลังการชุบใน agar M9 เสริม ด้วย oleate ทั้งโซเดียม 0.1% (w/v) (อเมริกา TCI พอร์ตแลนด์หรือ) ได้เคย อธิบายไว้ (Overath et al., 1969), หรือ 0.4% (w/v) L-arabinose (CalbiochemSan Diego, CA) เป็นแหล่งคาร์บอน (เสริม Fig. 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการสายพันธุ์ก่อสร้างสายพันธุ์แบคทีเรีย, พลาสมิดและไพรเมอร์ oligonucleotide ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีการระบุไว้ในตารางI และ II ไพรเมอร์ oligonucleotide ที่ซื้อมาจากดีเอ็นเอแบบบูรณาการTechnologies, Inc (คอรัลวิลล์, IA) สารเคมีและสารเคมีที่ซื้อมาจากฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ (Pittsburgh, PA) นอกจากที่ระบุไว้ เชื้อ E. coli K-12 MG1655 ที่ได้รับจากเชื้อE. coli ศูนย์พันธุหุ้น (New Haven, CT) และเป็นสายพันธุ์พื้นหลังที่ใช้ในงานนี้ สายพันธุ์ RL01 ถูกสร้างขึ้นโดยการลบยีน fadD จาก MG1655 โครโมโซมโดยการรวมตัวกันอีกλRedพึ่ง (Datsenko และ Wanner, 2000) โดยใช้recombinase λRedเข้ารหัสบนพลาสมิด pKD46 พลาสมิด pKD13 ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการขยายของเทปเชิงเส้นโดยใช้ไพรเมอร์ 1 และ 2 เทปกาฬถูกลบออกโดยแสดงrecombinase FLP เข้ารหัสบนพลาสมิด pCP20 สายพันธุ์ NRD204 (K-12 MG1655 araBAD :: แมว; เดอเลย์และ Cronan 2007) ได้รับการบริจาคอย่างไม่เห็นแก่โดยดร Cronan (มหาวิทยาลัยอิลลินอยส์ Urbana-Champaign) สายพันธุ์ RL07 ถูกสร้างขึ้นโดย P1 phage พลังงาน (สัน et al., 2007) ของ araBAD :: แทรกเข้าไปในแมวสายพันธุ์ RL01 ผ่านโปรโตคอลการปรับเปลี่ยนการใช้แผ่นที่มีการคัดเลือกpyrophosphate โซเดียม 1.25 มิลลิเป็นธาตุแคลเซียม เทปแมวจะถูกลบออกโดยใช้ pCP20 การผลิตสายพันธุ์ RL08 เพื่อลดการปรากฏตัวเป็นไปได้ของการแทรกหลายคนโดยรวมตัวกันอีกλRedทุกสายพันธุ์recombinant ถูกนำมาใช้เป็นผู้บริจาคแปลงพลังงานกลับเข้ามาในสายพันธุ์แม่ ยีนแทรกและลบได้รับการตรวจสอบโดยอาณานิคมวิธี polymerase chain reaction (PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ที่3 และ 4 สำหรับ fadD และ 5 และ 6 สำหรับ araBAD และกรณีที่ไม่มีการเจริญเติบโตหลังชุบบนวุ้นM9 เสริมด้วยทั้ง 0.1% (w / v) โซเดียม oleate (TCI อเมริกา, Portland, OR) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Overath et al., 1969) หรือ 0.4% (w / v) L-arabinose (Calbiochem, ซานดิเอโก) เป็นแหล่งคาร์บอน (เสริมรูปที่ 1).

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการก่อสร้าง

แบคทีเรียสายพันธุ์ ) และดีเอ็นเอ ซึ่งใช้ในการศึกษานี้อยู่ใน
ตาราง I และ II ซึ่งได้ทำการซื้อมาจากดีเอ็นเอเทคโนโลยี
รวม , Inc ( คอรัลวิลล์ , IA ) เคมีและสารเคมีที่ถูกซื้อจากชาวประมง
ทางวิทยาศาสตร์ ( Pittsburgh , PA ) นอกจากที่ระบุไว้ E . coli ภาคบังคับ mg1655 ได้
จาก Eศูนย์พันธุกรรมจากหุ้น ( ท่าใหม่ , CT ) และก็เมื่อยหลังใช้
ในงานนี้ สายพันธุ์ rl01 ถูกสร้างขึ้นโดยการลบ fadd ยีนจากโครโมโซมโดย mg1655
λ recombination ( สีแดง ) และ datsenko แวนเนอร์ , 2000 ) ใช้
λสีแดง recombinase เข้ารหัสบนพลาสมิด pkd46 . pkd13 พลาสมิดที่ถูกใช้เป็นแม่แบบของเส้นเทป
สำหรับเด็กโดยใช้ไพรเมอร์ 1 และ 2ญี่ปุ่นเทปถูกลบออก
โดยแสดง flp recombinase เข้ารหัสบนพลาสมิด pcp20 . สายพันธุ์ nrd204 ( ภาคบังคับ
mg1655 arabad : : แมว ; เดอ วาง และ โครแนน , 2007 ) คือเพื่อการกุศล โดย ดร. โครแนน
( มหาวิทยาลัยอิลลินอยส์ Urbana Champaign ) สายพันธุ์ rl07 ถูกสร้างขึ้นโดย P1
ผ่านฟา ( ทอมป์สัน et al . , 2007 ) ของ arabad : : แมวแทรกเข้ามา rl01 ความเครียดผ่าน
การแก้ไขพิธีสารเลือกจานที่มีโซเดียมไพโร 1.25 มม. เป็น
แคลเซียมคีเลเตอร์ . แมวเทปถูกลบโดยใช้ pcp20 การผลิตสายพันธุ์ rl08 .

ลดสถานะที่เป็นไปได้ของหลาย ๆ ครั้ง โดยการλสีแดงสายพันธุ์ของเซลล์ทั้งหมด
ถูกใช้เป็นผู้บริจาคเพื่อ transduce กลับเป็นพ่อแม่เครียด ยีน
แทรกชั่นและถูกตรวจสอบโดยอาณานิคมปฏิกิริยาลูกโซ่ ) โดยใช้ไพรเมอร์สำหรับ fadd
3 และ 4 และ 5 และ 6 ให้ arabad และโดยขาดการเติบโตหลังการชุบ
บน M9 agar ที่เติมให้ 0.1% ( w / v ) โซเดียมโอลีเอท ( TCI อเมริกา , พอร์ตแลนด์ ,
หรือ ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( โอเวอเริท et al . , 1969 ) , หรือ 0.4 % ( w / v )
( calbiochem l-arabinose , ซานดิเอโกCA ) เป็นแหล่งคาร์บอน ( เพิ่มเติมรูป
1 )