Purification of the S. Typhimurium

Purification of the S. Typhimurium TLR11 Ligand
S. Typhimurium (SL1344) was grown overnight at 37°C without shaking, collected by centrifugation, washed once in 10 mM Tris (pH 8), and homogenized in a Warring Blender for 5 × 10 s followed by heating at 60°C for 30 min. The resulting product was centrifuged at 10,000 ×g for 30 min, and the supernatant was ultracentrifuged at 100,000 ×g for 60 min. The resulting supernatant was treated with polymyxin B (Thermo/Pierce), applied to a DEAE Sephacel column, and eluted by step elution with 250 and 500 mM NaCl. Dialyzed fractions were assessed by NF-κB luciferase reporter assay, and fractions of interest were pooled and subjected to CM Sepharose chromatography. Fractions containing peak activity (flow through) were applied to Mono Q column and eluted with a linear 50–500 mM NaCl gradient (AKTA, GE biosciences). Fractions containing stimulatory activity were resolved by SDS-PAGE and visualized by Coomassie. A single band coeluting with the TLR11 stimulatory activity was excised and subjected to in-gel tryptic digest and MS analysis (Columbia University Protein Core Facility).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำให้บริสุทธิ์ของลิแกนด์ TLR11 Typhimurium s ได้S. Typhimurium (SL1344) ถูกปลูกค้างคืนที่ 37° C โดยไม่ต้องสั่น รวบรวม โดย centrifugation ล้าง 10 มม.ตรี (pH 8) ครั้ง และ homogenized เป็นกลุ่มใน Blender Warring สำหรับ s × 10 5 ตามความร้อนที่ 60° C ใน 30 นาที ผลที่ได้คือ centrifuged ที่ 10000 × g สำหรับ 30 นาที และ supernatant ถูก ultracentrifuged ที่ 100000 × g สำหรับ 60 นาที Supernatant ได้รับ polymyxin B (เพียร์ซเทอร์โม), กับคอลัมน์ DEAE Sephacel และ eluted โดย elution ขั้นตอนกับ 250 และ 500 มิลลิเมตร NaCl เศษ dialyzed ถูกประเมิน โดย NF κB luciferase โปรแกรมรายงานวิเคราะห์ และส่วนของดอกเบี้ยถูกทางถูกพู และการ chromatography CM Sepharose เศษส่วนที่ประกอบด้วยกิจกรรมสูงสุด (ไหลผ่าน) กับคอลัมน์ Q ขาวดำ และ eluted กับ NaCl ไล่เส้น 50-500 มม. (AKTA, GE เวลาออก) เศษส่วนที่ประกอบด้วยกิจกรรม stimulatory ถูกแก้ไข โดย SDS หน้า และ visualized โดย Coomassie วงเดียว coeluting กับกิจกรรม stimulatory TLR11 ถูก excised และต้องในเจล tryptic ย่อยและวิเคราะห์ MS (โคลัมเบียมหาวิทยาลัยโปรตีนหลักสิ่งอำนวยความสะดวก)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของ S. Typhimurium TLR11 แกนด์
เอส typhimurium (SL1344) ปลูกค้างคืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสโดยไม่ต้องสั่นที่เก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงล้างครั้งใน 10 มิลลิ Tris (pH 8) และปั่นในเครื่องปั่นรบเป็นเวลา 5 × 10 วินาทีตามมาด้วยความร้อนที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที . ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 30 นาทีและใสถูก ultracentrifuged ที่ 100,000 ×กรัมเป็นเวลา 60 นาที ส่งผลให้ใสรับการรักษาด้วย polymyxin B (เทอร์โม / เพียร์ซ) นำไปใช้กับคอลัมน์ DEAE Sephacel และชะชะโดยขั้นตอนที่มี 250 และ 500 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ เศษส่วน Dialyzed ได้รับการประเมินโดยการทดสอบนักข่าว NF-κB luciferase และเศษส่วนที่น่าสนใจที่ได้รวบรวมและยัดเยียดให้โค CM Sepharose เศษส่วนที่มีกิจกรรมสูงสุด (ไหลผ่าน) ถูกนำไปใช้กับคอลัมน์โมโน Q และมีชะลาดเชิงเส้น 50-500 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ (AKTA จีอีชีววิทยาศาสตร์) เศษส่วนที่มีกิจกรรมกระตุ้นได้รับการแก้ไขโดยวิธี SDS-PAGE และมองเห็นโดย Coomassie วงเดียว coeluting กับกิจกรรม TLR11 กระตุ้นก็พอและเป็นไปในเจล tryptic ย่อยและการวิเคราะห์ MS (มหาวิทยาลัยโคลัมเบียโปรตีนหลักของสิ่งอำนวยความสะดวก)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

บริสุทธิ์ของ S . typhimurium tlr11 ลิแกนด์
S . typhimurium ( sl1344 ) คือปลูกค้างคืนที่ 37 องศา C โดยไม่สั่น ที่รวบรวมจากการเหวี่ยงแยก ล้างครั้งเดียวใน 10 มม. นอกจากนี้ ( pH 8 ) และบดในเครื่องปั่นสงคราม 5 × 10 ตามความร้อนที่อุณหภูมิ 60 องศา C เป็นเวลา 30 นาที ส่งผลให้ผลิตภัณฑ์ไฟฟ้าที่ 10 × G สำหรับ 30 นาที และนำเป็น ultracentrifuged ที่ 100000 × G สำหรับ 60 นาทีนำผลปฏิบัติกับ polymyxin B ( เทอร์โม / Pierce ) ใช้กับเอนไซม์และการทำคอลัมน์ ตัวอย่างตามขั้นตอน ( ขนาด 250 และ 500 มิลลิเมตร เศษส่วนที่ผ่านประเมินได้จาก NF - κ B นักข่าวว่าลูซิเฟอเรส และส่วนของเงินกู้รวมเกี่ยวข้องและต้องซมโครมาโตกราฟีเศษส่วนที่มีกิจกรรมสูงสุด ( ไหลผ่าน ) ที่ใช้คอลัมน์ Q โมโน และตัวอย่างกับเส้น 50 –ขนาด 500 มม. ( สี akta , GE Biosciences ) เศษส่วนที่มีกิจกรรมกระตุ้นถูกแก้ไขถูกรับโดยเหล่านี้น่าจะเป็น .วงเดียว coeluting กับ tlr11 กระตุ้นกิจกรรม ตัด และต้องใช้อาหารย่อยและ MS Analysis ( สถานที่หลักโปรตีน
มหาวิทยาลัยโคลัมเบีย )