Several new options for possible primers were found
when the nirS sequences were aligned (Table 3; Fig. 1a).
They are all located in the second half of the gene, where
the majority of the sequences have been derived. Unfortunately,
there are only nine complete nirS gene sequences
in the databases. For several nirS primers, small
modifications were tested, but in Table 1 only the results
from the best primer targeting each primer site is shown.
The best result was obtained with the modified version
of primer cd3F [11] cd3aF in combination with the nirS
408 I.N. Throb€ack et al. / FEMS Microbiology Ecology 49 (2004) 401–417
Downloaded from http://femsec.oxfordjournals.org/ by guest on May 17, 2016
primer R3cd, which partly overlaps with primer nirS4R
[9]. The pair managed to amplify the correct fragment in
13 out of 14 strains as well as in all environmental
samples. No other bands were detected, which eliminates
the need to purify the correct fragment from
agarose gels before downstream analysis. When applying
this primer pair to a known nirK-denitrifier (A.
faecalis ATCC 8750) or to non-denitrifiers, no PCR
products were obtained. Primer combinations
F1acd:R4bcd, nirS1F:R4bcd and F3nirS:nirS6R managed
to amplify a fragment of the correct size in the nirK
denitrifier A. faecalis ATCC 8750. Moreover, a fragment
was also amplified from L. reuteri DSM 20016 with the
nirS4F:R4bcd set. In all these cases, the region for the
reverse primer is the same, which indicates that this region
is less specific than previously believed.
Primer cd3F was originally designed for quantification
of cd1-denitrifiers in marine sediments [11]. Two
additional primer sites were used in this earlier study.
Forward primer cd8F is located approximately 200 bp
upstream of the nirS1F site [9], but only seven sequences
are known in this region. Moreover, only a few bases
seem to be conserved. Primer cd4R corresponds to
primers nirS6R [9] and R4cd [10]. The most commonly
used primers, nirS1F and nirS6R, were less successful in
our study and amplified the correct fragment in only
eight organisms within four genera. Other potential
primers have also been used to survey denitrifying
communities. Yan et al. [15] modified the two nirS
primers F1acd (renamed to Heme 832F) and R4cd
(Heme 1606) published by Hallin and Lindgren [10] to
determine diversity of denitrifying bacteria in groundwater
and these were also used for studies of denitrification
genes in sediments [22]. The forward primer
(KA3-F) used by R€osch et al. [13] targets a region on the
nirS gene corresponding to bases 183–206 in Pseudomonas
stutzeri ATCC 14405. The primer was not used in
our evaluation since there are only seven sequences
available for this region and they do not appear to be
very conserved. Their reverse primer is similar to the one
developed by Braker et al. [9].
A number of primer combinations targeting nirS
failed to amplify the gene in several of the environmental
samples (Table 1). The nirS gene was readily
amplified from the activated sludge samples with most
of the primers, but we had severe problems with Alunda
and Ulleraker soil samples and the peat. It was only
from the new primer pair cd3aF:R3cd that we obtained
an amplicon of the correct size from all samples. The
commonly used nirS1F:nirS6R primers did not work
well on soil samples and we only obtained a product
from Brunnby soil. Others have also encountered
problems in detecting nirS in soils with these primers
and reported a low nirS abundance and diversity in soil
[28]. This could likely be a consequence of the primers
used, although it might also be a correct description of
the samples. Based on the results from our evaluation,
we conclude that the cd3aF:R3cd primer set would be
the best for community analysis of nirS denitrifiers. The
fragment size is also suitable for DGGE
ตัวเลือกใหม่ ๆ สำหรับไพรเมอร์ที่เป็นไปได้ถูกพบ
เมื่อลำดับ nirS ถูกจัดชิด (ตารางที่ 3. รูป 1a).
พวกเขาจะอยู่ในช่วงครึ่งหลังของยีนที่
ส่วนใหญ่ลำดับที่ได้รับมา แต่น่าเสียดายที่
มีเพียงเก้าสมบูรณ์ nirS ลำดับยีน
ในฐานข้อมูล สำหรับ nirS หลายไพรเมอร์ขนาดเล็ก
ปรับเปลี่ยนได้มีการทดสอบ แต่ในตารางที่ 1 เพียง แต่ผลที่ได้
จากการกำหนดเป้าหมายแต่ละเว็บไซต์ Primer ไพรเมอร์ที่ดีที่สุดคือแสดงให้เห็น.
ผลที่ดีที่สุดที่ได้รับกับรุ่นที่แก้ไข
ของไพรเมอร์ cd3F [11] cd3aF ร่วมกับ nirS
408 ในการเต้น€ ACK et al, / FEMS จุลชีววิทยานิเวศวิทยา 49 (2004) 401-417
ดาวน์โหลดจาก http://femsec.oxfordjournals.org/ โดยผู้เข้าพักเมื่อ 17 พฤษภาคม 2016
ไพรเมอร์ R3cd ซึ่งบางส่วนทับซ้อนกับไพรเมอร์ nirS4R
[9] ทั้งคู่มีการจัดการเพื่อขยายส่วนที่ถูกต้องใน
13 จาก 14 สายพันธุ์เช่นเดียวกับในสิ่งแวดล้อม
ตัวอย่าง ไม่มีวงดนตรีอื่น ๆ ที่ถูกตรวจพบซึ่งช่วยขจัดความ
จำเป็นที่จะต้องชำระส่วนที่ถูกต้องจาก
เจล agarose ก่อนที่จะวิเคราะห์ปลายน้ำ เมื่อใช้
คู่นี้ไพรเมอร์ให้เป็นที่รู้จักกัน nirK-denitrifier ( A.
faecalis ATCC 8750) หรือที่ไม่ใช่ denitrifiers, PCR ไม่มี
ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับ การผสมรองพื้น
F1acd: R4bcd, nirS1F: R4bcd และ F3nirS: nirS6R การจัดการ
เพื่อขยายส่วนของขนาดที่ถูกต้องใน nirK
denitrifier A. faecalis ATCC 8750. นอกจากนี้ชิ้นส่วน
ยังถูกขยายจาก L. reuteri DSM 20016 กับ
nirS4F: R4bcd ชุด ในทุกกรณีเหล่าภูมิภาคสำหรับ
ไพรเมอร์กลับเป็นเหมือนกันซึ่งบ่งชี้ว่าภูมิภาคนี้
เป็นเฉพาะน้อยกว่าที่เคยเชื่อกัน.
รองพื้น cd3F ได้รับการออกแบบมาสำหรับปริมาณ
ของ CD1-denitrifiers ในตะกอนดินในทะเล [11] สอง
เว็บไซต์ไพรเมอร์ที่เพิ่มขึ้นถูกนำมาใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้.
cd8F ไพรเมอร์ไปข้างหน้าจะอยู่ที่ประมาณ 200 bp
ต้นน้ำของเว็บไซต์ nirS1F [9] แต่เพียงเจ็ดลำดับ
เป็นที่รู้จักกันในภูมิภาคนี้ นอกจากนี้เพียงไม่กี่ฐาน
ดูเหมือนจะอนุรักษ์ ไพรเมอร์ cd4R สอดคล้องกับ
ไพรเมอร์ [9] nirS6R และ R4cd [10] มากที่สุด
ใช้ไพรเมอร์, และ nirS1F nirS6R, ไม่ประสบความสำเร็จใน
การศึกษาของเราและขยายส่วนที่ถูกต้องในเวลาเพียง
แปดชีวิตภายในสี่จำพวก มีศักยภาพอื่น ๆ
ไพรเมอร์ยังได้รับการใช้ในการสำรวจ Denitrifying
ชุมชน ยัน et al, [15] การแก้ไขทั้งสอง nirS
ไพรเมอร์ F1acd (เปลี่ยนชื่อเป็น Heme 832F) และ R4cd
(Heme 1606) ตีพิมพ์โดย Hallin และลินด์เกรน [10] เพื่อ
ตรวจสอบความหลากหลายของ Denitrifying แบคทีเรียในน้ำบาดาล
และเหล่านี้ยังถูกนำมาใช้สำหรับการศึกษาของ denitrification
ยีนในตะกอนดิน [ 22] ไปข้างหน้าไพรเมอร์
(KA3-F) ใช้โดย R € Osch et al, [13] เป้าหมายภูมิภาคใน
ยีน nirS สอดคล้องกับฐาน 183-206 ใน Pseudomonas
stutzeri ATCC 14405. ไพรเมอร์ไม่ได้ถูกนำมาใช้ใน
การประเมินผลของเราตั้งแต่มีเพียงเจ็ดลำดับ
ให้บริการในภูมิภาคนี้และพวกเขาดูเหมือนจะไม่ได้รับการ
อนุรักษ์มาก ไพรเมอร์กลับของพวกเขาคือคล้ายกับที่
พัฒนาโดย Braker et al, [9].
จำนวนชุดค่าผสมรองพื้น nirS กำหนดเป้าหมาย
ล้มเหลวในการขยายยีนหลายวิธีในสิ่งแวดล้อม
ตัวอย่าง (ตารางที่ 1) ยีน nirS ถูกพร้อม
ขยายจากตัวอย่างตะกอนกับที่สุด
ของไพรเมอร์ แต่เรามีปัญหารุนแรงกับ Alunda
และ Uller? ตัวอย่างดินและ Aker พรุ มันเป็นเพียง
จากไพรเมอร์คู่ใหม่ cd3aF: R3cd ที่เราได้รับ
amplicon ของขนาดที่ถูกต้องจากตัวอย่างทั้งหมด
ที่ใช้กันทั่วไป nirS1F: nirS6R ไพรเมอร์ไม่ได้ทำงาน
ได้ดีในตัวอย่างดินและเราได้รับเฉพาะผลิตภัณฑ์
จาก Brunnby ดิน คนอื่น ๆ ได้พบยัง
ปัญหาในการตรวจสอบ nirS ในดินที่มีไพรเมอร์เหล่านี้
และรายงานความอุดมสมบูรณ์ต่ำ nirS และความหลากหลายในดิน
[28] นี้อาจจะเป็นผลมาจากไพรเมอร์
ที่ใช้แม้ว่ามันอาจจะเป็นคำอธิบายที่ถูกต้องของ
กลุ่มตัวอย่าง บนพื้นฐานของผลจากการประเมินของเรา
ที่เราสรุปได้ว่า cd3aF: ชุดไพรเมอร์ R3cd จะเป็น
สิ่งที่ดีที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ชุมชน denitrifiers nirS
ขนาดชิ้นส่วนยังเหมาะสำหรับ DGGE
การแปล กรุณารอสักครู่..
