Several new options for possible pr

Several new options for possible primers were found
when the nirS sequences were aligned (Table 3; Fig. 1a).
They are all located in the second half of the gene, where
the majority of the sequences have been derived. Unfortunately,
there are only nine complete nirS gene sequences
in the databases. For several nirS primers, small
modifications were tested, but in Table 1 only the results
from the best primer targeting each primer site is shown.
The best result was obtained with the modified version
of primer cd3F [11] cd3aF in combination with the nirS
408 I.N. Throb€ack et al. / FEMS Microbiology Ecology 49 (2004) 401–417
Downloaded from http://femsec.oxfordjournals.org/ by guest on May 17, 2016
primer R3cd, which partly overlaps with primer nirS4R
[9]. The pair managed to amplify the correct fragment in
13 out of 14 strains as well as in all environmental
samples. No other bands were detected, which eliminates
the need to purify the correct fragment from
agarose gels before downstream analysis. When applying
this primer pair to a known nirK-denitrifier (A.
faecalis ATCC 8750) or to non-denitrifiers, no PCR
products were obtained. Primer combinations
F1acd:R4bcd, nirS1F:R4bcd and F3nirS:nirS6R managed
to amplify a fragment of the correct size in the nirK
denitrifier A. faecalis ATCC 8750. Moreover, a fragment
was also amplified from L. reuteri DSM 20016 with the
nirS4F:R4bcd set. In all these cases, the region for the
reverse primer is the same, which indicates that this region
is less specific than previously believed.
Primer cd3F was originally designed for quantification
of cd1-denitrifiers in marine sediments [11]. Two
additional primer sites were used in this earlier study.
Forward primer cd8F is located approximately 200 bp
upstream of the nirS1F site [9], but only seven sequences
are known in this region. Moreover, only a few bases
seem to be conserved. Primer cd4R corresponds to
primers nirS6R [9] and R4cd [10]. The most commonly
used primers, nirS1F and nirS6R, were less successful in
our study and amplified the correct fragment in only
eight organisms within four genera. Other potential
primers have also been used to survey denitrifying
communities. Yan et al. [15] modified the two nirS
primers F1acd (renamed to Heme 832F) and R4cd
(Heme 1606) published by Hallin and Lindgren [10] to
determine diversity of denitrifying bacteria in groundwater
and these were also used for studies of denitrification
genes in sediments [22]. The forward primer
(KA3-F) used by R€osch et al. [13] targets a region on the
nirS gene corresponding to bases 183–206 in Pseudomonas
stutzeri ATCC 14405. The primer was not used in
our evaluation since there are only seven sequences
available for this region and they do not appear to be
very conserved. Their reverse primer is similar to the one
developed by Braker et al. [9].
A number of primer combinations targeting nirS
failed to amplify the gene in several of the environmental
samples (Table 1). The nirS gene was readily
amplified from the activated sludge samples with most
of the primers, but we had severe problems with Alunda
and Uller
aker soil samples and the peat. It was only
from the new primer pair cd3aF:R3cd that we obtained
an amplicon of the correct size from all samples. The
commonly used nirS1F:nirS6R primers did not work
well on soil samples and we only obtained a product
from Brunnby soil. Others have also encountered
problems in detecting nirS in soils with these primers
and reported a low nirS abundance and diversity in soil
[28]. This could likely be a consequence of the primers
used, although it might also be a correct description of
the samples. Based on the results from our evaluation,
we conclude that the cd3aF:R3cd primer set would be
the best for community analysis of nirS denitrifiers. The
fragment size is also suitable for DGGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

พบตัวเลือกใหม่ ๆ สำหรับไพรเมอร์ที่เป็นไปได้เมื่อลำดับผลิตภัณฑ์ที่สอดคล้อง (ตารางที่ 3 รูป 1a)พวกเขาจะอยู่ในครึ่งหลังของยีน ที่ส่วนใหญ่ลำดับที่ได้รับมา อับมีผลิตภัณฑ์สมบูรณ์เก้าเท่าลำดับยีนในฐานข้อมูล สำหรับหลายผลิตภัณฑ์ไพรเมอร์ เล็กการปรับเปลี่ยน ได้ ผ่านการทดสอบ ในตารางที่ 1 ผลการกำหนดเป้าหมายแต่ละไซต์รองพื้นแสดงจากไพรเมอร์ที่ดีที่สุดได้รับผลลัพธ์ที่ดีที่สุดกับรุ่นแก้ไขของไพรเมอร์ cd3F cd3aF [11] ร่วมกับผลิตภัณฑ์408 ทร้อป I.N. €ack ร้อยเอ็ด / FEMS จุลชีววิทยานิเวศวิทยา 49 (2004) 401 – 417ดาวน์โหลดจาก http://femsec.oxfordjournals.org/ โดยเข้าพักเมื่อ 17 พฤษภาคม 2016รองพื้น R3cd ซึ่งบางส่วนทับซ้อนกับไพรเมอร์ nirS4R[9] . คู่จัดการเพื่อขยายส่วนถูกต้องใน13 จาก 14 สายพันธุ์เป็นอย่างดีในทุกสิ่งแวดล้อมตัวอย่าง วงอื่น ๆ ไม่พบ ที่กำจัดความต้องการในส่วนถูกต้องจากการทำให้บริสุทธิ์เจ agarose ก่อนปลายน้ำวิเคราะห์ เมื่อใช้คู่นี้สีรองพื้นการที่รู้จักกัน nirK-denitrifier (ก.faecalis ATCC 8750) หรือไม่ denitrifiers, PCR ไม่ผลิตภัณฑ์ได้รับ ชุดรองพื้นF1acd:R4bcd, nirS1F:R4bcd และ F3nirS:nirS6R ที่มีจัดการการขยายส่วนของขนาดถูกต้องในการ nirKdenitrifier A. faecalis ATCC 8750 นอกจากนี้ ส่วนยังถูกขยายจาก L. reuteri DSM 20016 กับการชุด nirS4F:R4bcd ในทุกกรณีเหล่านี้ ภูมิภาคสำหรับการย้อนหลังรองพื้นจะเหมือนกัน ซึ่งบ่งชี้ว่า ภูมิภาคนี้จะเจาะจงน้อยลงกว่าที่เคย เชื่อกันCd3F รองพื้นแต่เดิมถูกออกแบบให้นับของ denitrifiers cd1 ในตะกอนทะเล [11] สองรองพื้นเพิ่มเติมเว็บไซต์ใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้Cd8F รองพื้นไปข้างหน้าจะอยู่ประมาณ 200 bpต้นน้ำของเว็บไซต์ nirS1F [9], แต่ลำดับที่เจ็ดเท่านั้นเป็นที่รู้จักกันในภูมิภาคนี้ นอกจากนี้ เพียงส่วนฐานดูเหมือนจะไปได้อย่างราบรื่น Cd4R รองพื้นสอดคล้องกับไพรเมอร์ nirS6R [9] และ R4cd [10] กันมากที่สุดใช้ไพรเมอร์ nirS1F และ nirS6R ประสบความสำเร็จน้อยในศึกษาของเรา และขยายส่วนถูกต้องในเท่านั้นสิ่งมีชีวิตแปดภายในสี่สกุล อื่น ๆ ที่มีศักยภาพนอกจากนี้ยังมีการใช้ไพรเมอร์เพื่อสำรวจ denitrifyingชุมชนและสังคม Yan et al. [15] แก้ไขผลิตภัณฑ์สองไพรเมอร์ F1acd (เปลี่ยนชื่อเป็น Heme 832F) และ R4cd(Heme 1606) ประกาศ โดย Hallin และ Lindgren [10]ตรวจสอบความหลากหลายของ denitrifying แบคทีเรียในน้ำบาดาลและเหล่านี้ยังถูกใช้สำหรับการศึกษาของ denitrificationยีนในตะกอน [22] รองพื้นไปข้างหน้า(KA3-F) ใช้ R€ osch et al. [13] เป้าหมายภูมิภาคในการผลิตภัณฑ์ยีนที่สอดคล้องกับฐาน 183 – 206 ใน Pseudomonasstutzeri ATCC 14405 รองพื้นที่ไม่เคยใช้การประเมินของเราเนื่องจากมีลำดับเจ็ดเท่าพร้อมใช้งานสำหรับภูมิภาคนี้และพวกเขาไม่ใช่อนุรักษ์มากขึ้น รองพื้นของพวกเขากลับเป็นเหมือนกับพัฒนาโดย Braker et al. [9]จำนวนเป้าหมายผลิตภัณฑ์ชุดรองพื้นล้มเหลวในการขยายยีนในหลายที่สิ่งแวดล้อมตัวอย่าง (ตารางที่ 1) ยีนเช่นเดียวได้อย่างง่ายดายขยายจากตัวอย่างการเปิดใช้งานมีมากที่สุดของไพรเมอร์ แต่เรามีปัญหารุนแรงกับ Alundaและตัวอย่างดิน aker Uller และพรุ เท่านั้นจาก cd3aF:R3cd คู่รองพื้นใหม่ที่เราได้รับamplicon มีขนาดตัวอย่างทั้งหมดถูกต้อง การไพรเมอร์ nirS1F:nirS6R ที่ใช้กันทั่วไปไม่ทำงานบนดิน ตัวอย่างและเราจะรับผลิตภัณฑ์จากดิน Brunnby คนอื่น ๆ ได้พบปัญหาในการตรวจจับผลิตภัณฑ์ดินกับไพรเมอร์เหล่านี้และรายงานผลิตภัณฑ์ที่ต่ำความอุดมสมบูรณ์และความหลากหลายในดิน[28] ได้ซึ่งอาจเป็นผลมาจากไพรเมอร์ที่มีแนวโน้มใช้ แม้ว่ามันอาจเป็นคำอธิบายที่ถูกต้องของกลุ่มตัวอย่าง ตามผลลัพธ์จากการประเมินของเราเราสรุปได้ว่า จะเป็นชุดรองพื้น cd3aF:R3cdที่ดีสุดสำหรับการวิเคราะห์ชุมชนของผลิตภัณฑ์ denitrifiers การส่วนขนาดเหมาะสำหรับ DGGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวเลือกใหม่ ๆ สำหรับไพรเมอร์ที่เป็นไปได้ถูกพบ
เมื่อลำดับ nirS ถูกจัดชิด (ตารางที่ 3. รูป 1a).
พวกเขาจะอยู่ในช่วงครึ่งหลังของยีนที่
ส่วนใหญ่ลำดับที่ได้รับมา แต่น่าเสียดายที่
มีเพียงเก้าสมบูรณ์ nirS ลำดับยีน
ในฐานข้อมูล สำหรับ nirS หลายไพรเมอร์ขนาดเล็ก
ปรับเปลี่ยนได้มีการทดสอบ แต่ในตารางที่ 1 เพียง แต่ผลที่ได้
จากการกำหนดเป้าหมายแต่ละเว็บไซต์ Primer ไพรเมอร์ที่ดีที่สุดคือแสดงให้เห็น.
ผลที่ดีที่สุดที่ได้รับกับรุ่นที่แก้ไข
ของไพรเมอร์ cd3F [11] cd3aF ร่วมกับ nirS
408 ในการเต้น€ ACK et al, / FEMS จุลชีววิทยานิเวศวิทยา 49 (2004) 401-417
ดาวน์โหลดจาก http://femsec.oxfordjournals.org/ โดยผู้เข้าพักเมื่อ 17 พฤษภาคม 2016
ไพรเมอร์ R3cd ซึ่งบางส่วนทับซ้อนกับไพรเมอร์ nirS4R
[9] ทั้งคู่มีการจัดการเพื่อขยายส่วนที่ถูกต้องใน
13 จาก 14 สายพันธุ์เช่นเดียวกับในสิ่งแวดล้อม
ตัวอย่าง ไม่มีวงดนตรีอื่น ๆ ที่ถูกตรวจพบซึ่งช่วยขจัดความ
จำเป็นที่จะต้องชำระส่วนที่ถูกต้องจาก
เจล agarose ก่อนที่จะวิเคราะห์ปลายน้ำ เมื่อใช้
คู่นี้ไพรเมอร์ให้เป็นที่รู้จักกัน nirK-denitrifier ( A.
faecalis ATCC 8750) หรือที่ไม่ใช่ denitrifiers, PCR ไม่มี
ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับ การผสมรองพื้น
F1acd: R4bcd, nirS1F: R4bcd และ F3nirS: nirS6R การจัดการ
เพื่อขยายส่วนของขนาดที่ถูกต้องใน nirK
denitrifier A. faecalis ATCC 8750. นอกจากนี้ชิ้นส่วน
ยังถูกขยายจาก L. reuteri DSM 20016 กับ
nirS4F: R4bcd ชุด ในทุกกรณีเหล่าภูมิภาคสำหรับ
ไพรเมอร์กลับเป็นเหมือนกันซึ่งบ่งชี้ว่าภูมิภาคนี้
เป็นเฉพาะน้อยกว่าที่เคยเชื่อกัน.
รองพื้น cd3F ได้รับการออกแบบมาสำหรับปริมาณ
ของ CD1-denitrifiers ในตะกอนดินในทะเล [11] สอง
เว็บไซต์ไพรเมอร์ที่เพิ่มขึ้นถูกนำมาใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้.
cd8F ไพรเมอร์ไปข้างหน้าจะอยู่ที่ประมาณ 200 bp
ต้นน้ำของเว็บไซต์ nirS1F [9] แต่เพียงเจ็ดลำดับ
เป็นที่รู้จักกันในภูมิภาคนี้ นอกจากนี้เพียงไม่กี่ฐาน
ดูเหมือนจะอนุรักษ์ ไพรเมอร์ cd4R สอดคล้องกับ
ไพรเมอร์ [9] nirS6R และ R4cd [10] มากที่สุด
ใช้ไพรเมอร์, และ nirS1F nirS6R, ไม่ประสบความสำเร็จใน
การศึกษาของเราและขยายส่วนที่ถูกต้องในเวลาเพียง
แปดชีวิตภายในสี่จำพวก มีศักยภาพอื่น ๆ
ไพรเมอร์ยังได้รับการใช้ในการสำรวจ Denitrifying
ชุมชน ยัน et al, [15] การแก้ไขทั้งสอง nirS
ไพรเมอร์ F1acd (เปลี่ยนชื่อเป็น Heme 832F) และ R4cd
(Heme 1606) ตีพิมพ์โดย Hallin และลินด์เกรน [10] เพื่อ
ตรวจสอบความหลากหลายของ Denitrifying แบคทีเรียในน้ำบาดาล
และเหล่านี้ยังถูกนำมาใช้สำหรับการศึกษาของ denitrification
ยีนในตะกอนดิน [ 22] ไปข้างหน้าไพรเมอร์
(KA3-F) ใช้โดย R € Osch et al, [13] เป้าหมายภูมิภาคใน
ยีน nirS สอดคล้องกับฐาน 183-206 ใน Pseudomonas
stutzeri ATCC 14405. ไพรเมอร์ไม่ได้ถูกนำมาใช้ใน
การประเมินผลของเราตั้งแต่มีเพียงเจ็ดลำดับ
ให้บริการในภูมิภาคนี้และพวกเขาดูเหมือนจะไม่ได้รับการ
อนุรักษ์มาก ไพรเมอร์กลับของพวกเขาคือคล้ายกับที่
พัฒนาโดย Braker et al, [9].
จำนวนชุดค่าผสมรองพื้น nirS กำหนดเป้าหมาย
ล้มเหลวในการขยายยีนหลายวิธีในสิ่งแวดล้อม
ตัวอย่าง (ตารางที่ 1) ยีน nirS ถูกพร้อม
ขยายจากตัวอย่างตะกอนกับที่สุด
ของไพรเมอร์ แต่เรามีปัญหารุนแรงกับ Alunda
และ Uller? ตัวอย่างดินและ Aker พรุ มันเป็นเพียง
จากไพรเมอร์คู่ใหม่ cd3aF: R3cd ที่เราได้รับ
amplicon ของขนาดที่ถูกต้องจากตัวอย่างทั้งหมด
ที่ใช้กันทั่วไป nirS1F: nirS6R ไพรเมอร์ไม่ได้ทำงาน
ได้ดีในตัวอย่างดินและเราได้รับเฉพาะผลิตภัณฑ์
จาก Brunnby ดิน คนอื่น ๆ ได้พบยัง
ปัญหาในการตรวจสอบ nirS ในดินที่มีไพรเมอร์เหล่านี้
และรายงานความอุดมสมบูรณ์ต่ำ nirS และความหลากหลายในดิน
[28] นี้อาจจะเป็นผลมาจากไพรเมอร์
ที่ใช้แม้ว่ามันอาจจะเป็นคำอธิบายที่ถูกต้องของ
กลุ่มตัวอย่าง บนพื้นฐานของผลจากการประเมินของเรา
ที่เราสรุปได้ว่า cd3aF: ชุดไพรเมอร์ R3cd จะเป็น
สิ่งที่ดีที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ชุมชน denitrifiers nirS
ขนาดชิ้นส่วนยังเหมาะสำหรับ DGGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลายตัวเลือกใหม่สำหรับไพรเมอร์พบว่าเป็นไปได้เมื่อ nirs ลำดับชิด ( ตารางที่ 3 ; รูปที่ 1A )พวกเขาจะตั้งอยู่ในครึ่งหลังของยีนที่ส่วนใหญ่ของผู้ที่ได้รับมา ขออภัยมีเพียงเก้า nirs ลำดับยีนที่สมบูรณ์ในฐานข้อมูล หลาย nirs ไพรเมอร์ , ขนาดเล็กการปรับเปลี่ยนทดสอบแต่ตารางที่ 1 ผลเท่านั้นไพรเมอร์รองพื้นที่ดีที่สุด จากเป้าหมายที่แต่ละเว็บไซต์ที่แสดงผลที่ได้ กับรุ่นที่แก้ไขที่ดีที่สุดไพรเมอร์ cd3f [ 11 ] cd3af ร่วมกับ nirs408 p.m . อารมณ์ด้านแอ๊ค et al . / fems ระบบนิเวศจุลชีววิทยา 49 ( 2004 ) 401 – 417ดาวน์โหลดได้จาก http://femsec.oxfordjournals.org/ แขก 17 พฤษภาคม 2016รองพื้น r3cd ซึ่งบางส่วนทับซ้อนกับ nirs4r ไพรเมอร์[ 9 ] คู่ที่จัดการเพื่อขยายส่วนที่ถูกต้องใน13 จาก 14 สายพันธุ์ รวมทั้งในสิ่งแวดล้อมตัวอย่าง ไม่มีวงอื่นถูกตรวจพบ ซึ่งจะขจัดต้องชำระส่วนที่ถูกต้องจาก( เจลก่อนการวิเคราะห์ด้านท้ายน้ำ เมื่อสมัครนี้ ไพรเมอร์คู่รู้จักเนิร์กดีไนทริฟายเออร์ ( Aออกซิเจน ATCC วย ) หรือ ไม่ denitrifiers ไม่มีดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์ที่ได้รับ ไพรเมอร์ผสมf1acd : r4bcd nirs1f : และ , r4bcd f3nirs : nirs6r จัดการเพื่อขยายส่วนของขนาดที่ถูกต้องในเนิร์กดีไนทริฟายเออร์ . faecalis ~ i วย . นอกจากนี้ ส่วนก็ขยายจาก DSM 20016 กับ รัฐฟลอริดาnirs4f : r4bcd ชุด ในทุกกรณีเหล่านี้ภูมิภาคสำหรับกลับสีเป็นแบบเดียวกัน ซึ่งบ่งชี้ว่า ภูมิภาคนี้เฉพาะเจาะจงน้อยกว่าเชื่อก่อนหน้านี้รองพื้น cd3f ถูกออกแบบมาสำหรับปริมาณของ CD1 denitrifiers ตะกอนในทะเล [ 11 ] สองเว็บไซต์หลักเพิ่มเติมใช้ในก่อนหน้านี้การศึกษาcd8f ตั้งอยู่ประมาณ 200 คู่เบสรองพื้นไปข้างหน้าต้นน้ำของ nirs1f เว็บไซต์ [ 9 ] แต่ลำดับเจ็ดเป็นที่รู้จักกันในภูมิภาคนี้ นอกจากนี้ เพียงไม่กี่ฐานดูเหมือนจะสามารถ . รองพื้น cd4r ตรงกับไพรเมอร์ nirs6r [ 9 ] และ r4cd [ 10 ] มากที่สุดโดยทั่วไปใช้ไพรเมอร์ nirs1f และ nirs6r , ประสบความสำเร็จน้อยกว่าการศึกษาและขยายส่วนที่ถูกต้องเท่านั้นแปดสิ่งมีชีวิตภายในสี่สกุล ที่มีศักยภาพอื่น ๆไพรเมอร์ยังถูกใช้เพื่อสำรวจดีไนตริฟายอิงชุมชน ยัน et al . [ 15 ] แก้ไขสอง nirsไพรเมอร์ f1acd ( เปลี่ยนชื่อฮีม 832f ) และ r4cd( ฮีม 1606 ) ตีพิมพ์โดย hallin ลินด์เกรน [ 10 ] และตรวจสอบความหลากหลายของแบคทีเรียดีไนตริฟายอิง ในน้ำบาดาลและเหล่านี้ยังใช้เพื่อการศึกษาของน้ำยีนในตะกอน [ 22 ] รองพื้นไปข้างหน้า( ka3-f ) ใช้โดย R ด้าน osch et al . [ 13 ] เป้าหมายเขตในnirs ยีนที่สอดคล้องกับฐานของ 183 – 206 ในstutzeri ATCC ด้าน . ไพรเมอร์ไม่ได้ถูกใช้ในเราประเมินเนื่องจากมีเพียงลำดับเจ็ดของภูมิภาคนี้และพวกเขาไม่ได้ปรากฏเป็นอนุรักษ์มาก . ของพวกเขาย้อนกลับรองพื้นคล้ายกับหนึ่งพัฒนาโดยทุก et al . [ 9 ]จํานวนผสมรองพื้น nirs เป้าหมายล้มเหลวในการขยายยีนต่างๆ ของสิ่งแวดล้อมตัวอย่าง ( ตารางที่ 1 ) การ nirs ยีนพร้อมขยายจากกากตะกอนน้ำเสียตัวอย่างที่สุดของด้วย แต่เรามีปัญหารุนแรงกับ Alundaulleraker และตัวอย่างดินและพีท . มันเป็นเพียงจากไพรเมอร์คู่ใหม่ cd3af : r3cd ที่เราได้รับเป็นและของขนาดที่ถูกต้องจากตัวอย่างทั้งหมด ที่ที่ใช้กันทั่วไป nirs1f : nirs6r ไพรเมอร์ไม่ได้ทํางานในตัวอย่างดินและเราจะได้รับผลิตภัณฑ์จาก brunnby ดิน คนอื่น ๆยังพบปัญหาในการตรวจสอบ nirs ในดินด้วยวิธีเหล่านี้และรายงาน nirs ความอุดมสมบูรณ์และความหลากหลายในดินต่ำ[ 28 ] นี้อาจเป็นผลมาจากไพรเมอร์ใช้ ถึงแม้ว่ามันอาจจะแก้ไขรายละเอียดของตัวอย่าง จากผลการประเมินของเราเราสรุปได้ว่า cd3af : r3cd primer ตั้งค่าจะที่ดีที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ชุมชนของ nirs denitrifiers . ที่ขนาดมียังเหมาะสำหรับการทดลอง