Real-time reverse transcription PCR

Real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) is an established technique for quantifying mRNA in biological samples. Benefits of this procedure over conventional methods for measuring RNA include its sensitivity, large dynamic range, and the potential for high throughout as well as accurate quantification. Its enhanced specificity is particularly useful for immunological research, which frequently involves analysis of proteins derived from different splice variants of the original transcript.1 Furthermore, many of the key proteins (eg cytokines and transcription factors) are found in such low abundance that real-time RT-PCR quantification of their mRNAs represents the only technique sensitive enough to measure reliably their expression in vivo.2,3 Although real-time RT-PCR is widely used to quantitate biologically relevant changes in mRNA levels, there remain a number of problems associated with its use. These include the inherent variability of RNA, variability of extraction protocols that may copurify inhibitors, and different reverse transcription and PCR efficiencies.4 Consequently, it is important that an accurate method
of normalisation is chosen to control for this error. Unfortunately, normalisation remains one of real-time RT-PCRs most difficult problems.5 Several strategies have been proposed for normalising real-time RT-PCR data. These range from ensuring that a similar sample size is chosen to using an internal housekeeping or reference gene (Table 1). These approaches are not mutually exclusive and can be incorporated into a protocol at many stages (Figure 1). Here we discuss the respective advantages and disadvantages of each technique.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Transcription ย้อนเวลาจริง (เรียลไทม์ RT-PCR) PCR เป็นเทคนิคกำหนดขึ้นสำหรับ quantifying mRNA ในตัวอย่างชีวภาพ ประโยชน์ของกระบวนการนี้ผ่านวิธีการทั่วไปสำหรับวัดอาร์เอ็นเอมีความไวของ ช่วงขนาดใหญ่ และศักยภาพในการนับสูงตลอด รวมทั้งความถูกต้อง Specificity เพิ่มความเป็นประโยชน์ระเบียบวิจัย ที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์โปรตีนที่มาจากตัวแปรอื่นประกบของ transcript.1 เดิม Furthermore บ่อย จำนวนมากของโปรตีนที่สำคัญ (เช่น cytokines และ transcription ปัจจัย) อยู่ในความอุดมสมบูรณ์ต่ำเช่นว่า นับ RT-PCR แบบเรียลไทม์ของ mRNAs ของแทนลับเทคนิคเพียงพอวัดได้นิพจน์ของพวกเขาใน vivo.2 , 3 แม้ว่า RT-PCR แบบเรียลไทม์คือใช้ไป quantitate ชิ้นเกี่ยวข้องการเปลี่ยนแปลงในระดับ mRNA ยังคงมีปัญหาที่เกี่ยวข้องกับการใช้ รวมถึงความแปรผันโดยธรรมชาติของอาร์เอ็นเอ ความแปรผันของการแยกโพรโทคอลที่อาจ copurify inhibitors และ transcription กลับแตกต่างกันและ PCR efficiencies.4 จึง มันเป็นสิ่งสำคัญที่วิธีการถูกต้องของ normalisation ที่ควบคุมสำหรับข้อผิดพลาดนี้ อับ normalisation ยังคงแบบเรียลไทม์ RT PCRs ยากที่สุด problems.5 ได้รับการเสนอกลยุทธ์ต่าง ๆ สำหรับ normalising RT-PCR แบบเรียลไทม์ข้อมูลอย่างใดอย่างหนึ่ง ช่วงนี้จากใจว่า ขนาดตัวอย่างที่คล้ายกันที่ใช้ภายในทำความสะอาดหรือการอ้างอิงยีน (ตาราง 1) วิธีเหล่านี้จะไม่แยกออกจากกัน และสามารถรวมอยู่ในโพรโทคอในหลายขั้นตอน (รูปที่ 1) ที่นี่เราหารือเกี่ยวข้องดีข้อเสียของแต่ละเทคนิค

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Real-time PCR ถอดความย้อนกลับ (real-time RT-PCR) เป็นเทคนิคที่จัดตั้งขึ้นเพื่อเชิงปริมาณ mRNA ในตัวอย่างทางชีวภาพ ประโยชน์ของขั้นตอนนี้มากกว่าวิธีการแบบเดิมในการวัดอาร์เอ็นเอรวมถึงความไวในช่วงแบบไดนามิกที่มีขนาดใหญ่และมีศักยภาพสำหรับสูงตลอดเช่นเดียวกับปริมาณที่ถูกต้อง ความจำเพาะที่เพิ่มขึ้นมันเป็นประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการวิจัยภูมิคุ้มกันซึ่งมักจะเกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ของโปรตีนที่ได้มาจากสายพันธุ์ที่แตกต่างกันประกบของเดิม transcript.1 นอกจากนี้หลายโปรตีนที่สำคัญ (เช่น cytokines และปัจจัยการถอดความ) พบในความอุดมสมบูรณ์ต่ำเช่นนั้นจริง เวลาปริมาณ RT-PCR ของพวกเขาแสดงให้เห็นถึง mRNAs เทคนิคเท่านั้นที่มีความสำคัญพอที่จะวัดได้อย่างน่าเชื่อถือในการแสดงออกของพวกเขาแม้ว่า vivo.2,3 แบบ real-time RT-PCR ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายใน quantitate เปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องทางชีวภาพในระดับ mRNA ยังคงมีจำนวนของปัญหา ที่เกี่ยวข้องกับการใช้งาน เหล่านี้รวมถึงความแปรปรวนของธรรมชาติของอาร์เอ็นเอแปรปรวนของโปรโตคอลการสกัดที่อาจ copurify ยับยั้งและถอดรหัสแบบย้อนกลับที่แตกต่างกันและวิธี PCR efficiencies.4
ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่วิธีการที่ถูกต้องของการฟื้นฟูได้รับการแต่งตั้งในการควบคุมสำหรับข้อผิดพลาดนี้ แต่น่าเสียดายที่การฟื้นฟูยังคงเป็นหนึ่งในเวลาจริง RT-PCRs ที่ยากที่สุด problems.5 กลยุทธ์หลายคนได้รับการเสนอชื่อสำหรับ normalizing เวลาจริงข้อมูล RT-PCR ช่วงนี้จากความมั่นใจว่าขนาดของกลุ่มตัวอย่างที่คล้ายกันคือเลือกที่จะใช้บริการทำความสะอาดภายในหรือยีนอ้างอิง (ตารางที่ 1) วิธีการเหล่านี้ไม่ได้พิเศษร่วมกันและสามารถรวมอยู่ในโปรโตคอลที่หลายขั้นตอน (รูปที่ 1) ที่นี่เราหารือเกี่ยวกับข้อดีและข้อเสียที่เกี่ยวข้องของแต่ละเทคนิค

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เวลาย้อนกลับ ( RT-PCR ) ถอดความจริงจริง ) เป็นเทคนิคของก่อตั้งค่าในตัวอย่างทางชีวภาพ ประโยชน์ของกระบวนการนี้ผ่านวิธีการปกติเพื่อวัดความไวของยา ได้แก่ ช่วงแบบไดนามิกที่มีขนาดใหญ่ และมีศักยภาพสูงตลอด รวมทั้งปริมาณที่ถูกต้อง เพิ่มความจำเพาะของเป็นประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการวิจัย ,ซึ่งมักเกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์โปรตีนที่ได้มาจากที่แตกต่างกันต่อสายพันธุ์ของฉบับเดิม ที่ 1 นอกจากนี้ จำนวนมากของโปรตีนที่สำคัญ ( เช่น cytokines และปัจจัยการถอดความ ) จะพบได้ในความอุดมสมบูรณ์ต่ำที่ปริมาณสารพันธุกรรมของเรียลไทม์ของรหัสของพวกเขาเป็นเพียงเทคนิคที่ละเอียดอ่อนพอที่จะวัดได้ 2 , การแสดงออกของพวกเขาในร่างกาย3 ถึงแม้ว่า RT-PCR แบบเรียลไทม์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกในระดับเหลือจำนวนของปัญหาที่เกี่ยวข้องกับการใช้ เหล่านี้รวมถึงการเปลี่ยนแปลงโดยธรรมชาติของอาร์เอ็นเอ แปรปรวนของการสกัดโปรโตคอลที่อาจ copurify inhibitors และถอดความย้อนกลับที่แตกต่างกันและเพิ่มประสิทธิภาพ 4 ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่
วิธีที่ถูกต้องของการฟื้นฟูถูกเลือกสำหรับการควบคุมข้อผิดพลาดนี้ ขออภัย การฟื้นฟูยังคงเป็นหนึ่งของปัญหาที่ยากที่สุด pcrs เรียลไทม์ RT 5 หลายกลยุทธ์ที่ได้รับการเสนอ normalising นี้สำหรับข้อมูลแบบเรียลไทม์ เหล่านี้ช่วงจากมั่นใจว่าขนาดตัวอย่างที่คล้ายกันคือ เลือกที่จะใช้งานภายในหรืออ้างอิงยีน ( ตารางที่ 1 )วิธีเหล่านี้จะไม่ได้พิเศษร่วมกัน และสามารถรวมอยู่ในขั้นตอนหลายขั้นตอน ( รูปที่ 1 ) ที่นี่เราจะหารือเกี่ยวกับข้อดีและข้อเสียของแต่ละวิธี แต่ละ .