1. IntroductionThe innate immune sy

1. Introduction
The innate immune system is the first line of defense against invading pathogens in invertebrates and vertebrates (Rauta et al., 2014). As the first and best characterized pattern recognition receptors (PRRs), Toll-like receptors (TLRs) play a crucial role in the innate immune system (Wei et al., 2014). TLRs can recognize diverse highly conserved pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) such as lipopeptides, lipopolysaccharide (LPS), flagellin, RNA, and DNA containing unmethylated CpG motifs (CpG DNA), and trigger the signaling pathways that activate immune cells in response to pathogen infection (Palti, 2011 and Sasai and Yamamoto, 2013).

To date, 13 members of the TLR family have been identified in mammals, and several bacterial components have been shown to be the ligands of mammalian TLRs (e.g. TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, and TLR10) (Sasai and Yamamoto, 2013, Akira et al., 2006, Takeuchi and Akira, 2010, Smith et al., 2003, Hayashi et al., 2001 and Hemmi et al., 2000). Compared with mammals, fish have more TLRs, and at least 20 TLR types have been found in more than a dozen of fish species to date (Rauta et al., 2014). However, the direct evidence of ligand specificity has only been shown for a few members (TLR2, TLR3, TLR5M, TLR5S, TLR9, TLR21, and TLR22) of the TLRs identified in fish. TLR2, TLR5M and TLR5S, TLR9 and TLR21 could specifically recognize lipopeptides and PGN, flagellin, and unmethylated CpG DNA, respectively, which are PAMPs from bacteria. In addition, other TLRs such as TLR1, TLR4, TLR14, TLR18, and TLR25 may also be sensors of bacteria (reviewed in Zhang et al., 2014). After the first infection and the re-infection of Aeromonas hydrophila, TLR2, TLR3, TLR5, TLR21 were found to be significantly induced in anterior kidney of channel catfish (Ictalurus punctatus) ( Mu et al., 2011 and Mu et al., 2013). In the spleen of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea), TLR1 and TLR3 were significantly up-regulated while TLR2 and TLR22 were down-regulated after A. hydrophila infection ( Mu et al., 2010). Additionally, TLR5 was involved in the immune response against A. hydrophila infection in the Indian major carp, mrigal (Cirrhinus mrigala) ( Basu et al., 2012). Nevertheless, whether and which TLRs play the critical roles in the immune defense against A. hydrophila infection in Qihe crucian carp (Carassius auratus) is still largely unknown.

The C. auratus living in Qihe River, as an endemic freshwater fish, grows very quickly and is famous for its delicious taste and rich nutrition. Therefore, this species has become an important commercial fish and has been widely cultivated throughout the north of Henan Province, China ( Jiang et al., 2012 and Zhou et al., 2014). A. hydrophila, a gram-negative bacterium, is the most widely popular opportunistic pathogen in China which can infect people, livestock and aquatic animals ( Zhou and Zhou, 2012). The infection of A. hydrophila, spreads very fast and causes extensive losses in aquaculture, and it has been considered as the most devastating pathogenic bacteria for Cyprinid fish ( Podok et al., 2014, Lü et al., 2015 and Yadav et al., 2014).

To our knowledge, the expression patterns of a complete set of TLRs in freshwater fish during gram-negative bacteria infection have not been reported. In the present study, we cloned partial sequences of TLRs in C. auratus and investigated the expression profiles of the TLRs in spleen and head kidney to screen which TLRs play essential roles in immune response against A. hydrophila infection. This work will facilitate our comprehensive understanding for the functions of TLRs in the process of gram-negative bacterial infection in C. auratus.

2. Materials and methods
2.1. Fish

Healthy C. auratus with an average body weight of 55 ± 2 g were obtained from aquaculture farms in Henan Normal University. The fish were acclimatized at 20 ± 2 °C for two weeks in plastic aquaria (30 fish/aquaria) and were then fed twice a day with commercial pellets until 24 h before exposure to the treatment.

2.2. Bacteria

A. hydrophila was cultured in Luria-Bertain (LB) at 28 °C for 24 h with constant shaking (180 rpm), then harvested by centrifugation at 8000 rpm for 10 min and washed three times with 0.65% physiological saline and also precipitated by centrifugation. The bacteria cells obtained were suspended in physiological saline and viable count was determined as colony forming unit (CFU) by plating following 10-fold serial dilutions on agar plates.

2.3. Challenge experiments and tissues sampling

Healthy fish were randomly divided into two groups (30 fish per group). For bacterial infection group, fish were injected intraperitoneally (i.p.) with 200 μl A. hydrophila suspension (5 × 107 CFU/ml) based on previous unpublished data. The fish treated with 200 μl 0.65% physiological saline, were used as the control. After 3, 6, 12, 24, and 48 h of injection, respectively, the spleen and head kidney, as the main immune organs of fish, were collected and immediately stored at −80 °C until RNA extraction. Five fish were sampled from each group at each time point. The experiments were performed in triplicate. In addition, the spleen in healthy fish was sampled for cloning partial sequences of TLRs genes.

2.4. Total RNA isolation and cDNA synthesis

Total RNA was extracted from each sample using TRIzol Reagent (TaKaRa, Japan) according to the manufacture's protocol. The RNA concentrations were measured using NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) and the integrity was assessed by electrophoresis on 1% agarose gel. The first-strand cDNAs were synthesized using the PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan), which were respectively used to clone the TLRs gene fragments and to examine the expressing levels of the TLR genes by the quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) using the PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfert Real Time) (TaKaRa, Japan) following the instructions of manufacture. The cDNA templates were stored at −20 °C until used.

2.5. Molecular cloning of the partial cDNA sequences of TLRs in C. auratus

To clone the partial sequences of C. auratus TLRs, degenerate primers were designed using Primer 5.0 software based on the conserved nucleotides which were identified from multiple sequence alignment of TLR in several fish species ( Table 1). Primers for TLR9 and TLR20 amplification were referenced from Wang et al. (2014) and Pietretti et al. (2014). The PCR was performed with 1 μl of cDNA in a 25 μl reaction volume under the protocol of initial denaturation at 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of 94 °C for 30 s, 53–57 °C (for different TLRs) for 30 s, 72 °C for 60 s and a final extension at 72 °C for 10 min. The PCR products were detected by electrophoresis on 1.5% agarose gel, purified using the E.Z.N.A.™ gel extraction kit (OMEGA, USA), and then ligated into pMD19-T vectors (TaKaRa, Japan) and transformed into DH5α competent cells (Biomed, China). Positive clones were screened by colony PCR and at least two clones were sequenced in both directions by Sangon Biotech Company (Shanghai, China).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเป็นบรรทัดแรกของการป้องกันการบุกรุกโรคใน invertebrates และ vertebrates (Rauta et al., 2014) เหมือนโทร receptors (TLRs) เล่นบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (Wei et al., 2014) เป็นแรก และดีที่สุดลักษณะรูปแบบการรู้ receptors (PRRs), TLRs สามารถจดจำมีความหลากหลายสูงนำเชื่อมโยงการศึกษาโมเลกุลรูปแบบ (PAMPs) เช่น lipopeptides, lipopolysaccharide (LPS), flagellin อาร์เอ็นเอ ดีเอ็นเอที่ประกอบด้วยโดดเด่นประเภทวัสดุสิ้นเปลือง unmethylated (ดีเอ็นเอประเภทวัสดุสิ้นเปลือง), และมนต์ signaling ที่เซลล์ภูมิคุ้มกันตอบสนองต่อการติดเชื้อการศึกษา (Palti, 2011 และ Sasai และยามาโม โตะ 2013) การเรียกใช้ ทริกเกอร์To date, 13 members of the TLR family have been identified in mammals, and several bacterial components have been shown to be the ligands of mammalian TLRs (e.g. TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, and TLR10) (Sasai and Yamamoto, 2013, Akira et al., 2006, Takeuchi and Akira, 2010, Smith et al., 2003, Hayashi et al., 2001 and Hemmi et al., 2000). Compared with mammals, fish have more TLRs, and at least 20 TLR types have been found in more than a dozen of fish species to date (Rauta et al., 2014). However, the direct evidence of ligand specificity has only been shown for a few members (TLR2, TLR3, TLR5M, TLR5S, TLR9, TLR21, and TLR22) of the TLRs identified in fish. TLR2, TLR5M and TLR5S, TLR9 and TLR21 could specifically recognize lipopeptides and PGN, flagellin, and unmethylated CpG DNA, respectively, which are PAMPs from bacteria. In addition, other TLRs such as TLR1, TLR4, TLR14, TLR18, and TLR25 may also be sensors of bacteria (reviewed in Zhang et al., 2014). After the first infection and the re-infection of Aeromonas hydrophila, TLR2, TLR3, TLR5, TLR21 were found to be significantly induced in anterior kidney of channel catfish (Ictalurus punctatus) ( Mu et al., 2011 and Mu et al., 2013). In the spleen of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea), TLR1 and TLR3 were significantly up-regulated while TLR2 and TLR22 were down-regulated after A. hydrophila infection ( Mu et al., 2010). Additionally, TLR5 was involved in the immune response against A. hydrophila infection in the Indian major carp, mrigal (Cirrhinus mrigala) ( Basu et al., 2012). Nevertheless, whether and which TLRs play the critical roles in the immune defense against A. hydrophila infection in Qihe crucian carp (Carassius auratus) is still largely unknown.The C. auratus living in Qihe River, as an endemic freshwater fish, grows very quickly and is famous for its delicious taste and rich nutrition. Therefore, this species has become an important commercial fish and has been widely cultivated throughout the north of Henan Province, China ( Jiang et al., 2012 and Zhou et al., 2014). A. hydrophila, a gram-negative bacterium, is the most widely popular opportunistic pathogen in China which can infect people, livestock and aquatic animals ( Zhou and Zhou, 2012). The infection of A. hydrophila, spreads very fast and causes extensive losses in aquaculture, and it has been considered as the most devastating pathogenic bacteria for Cyprinid fish ( Podok et al., 2014, Lü et al., 2015 and Yadav et al., 2014).To our knowledge, the expression patterns of a complete set of TLRs in freshwater fish during gram-negative bacteria infection have not been reported. In the present study, we cloned partial sequences of TLRs in C. auratus and investigated the expression profiles of the TLRs in spleen and head kidney to screen which TLRs play essential roles in immune response against A. hydrophila infection. This work will facilitate our comprehensive understanding for the functions of TLRs in the process of gram-negative bacterial infection in C. auratus.2. Materials and methods2.1. FishHealthy C. auratus with an average body weight of 55 ± 2 g were obtained from aquaculture farms in Henan Normal University. The fish were acclimatized at 20 ± 2 °C for two weeks in plastic aquaria (30 fish/aquaria) and were then fed twice a day with commercial pellets until 24 h before exposure to the treatment.2.2. BacteriaA. hydrophila was cultured in Luria-Bertain (LB) at 28 °C for 24 h with constant shaking (180 rpm), then harvested by centrifugation at 8000 rpm for 10 min and washed three times with 0.65% physiological saline and also precipitated by centrifugation. The bacteria cells obtained were suspended in physiological saline and viable count was determined as colony forming unit (CFU) by plating following 10-fold serial dilutions on agar plates.2.3. Challenge experiments and tissues samplingHealthy fish were randomly divided into two groups (30 fish per group). For bacterial infection group, fish were injected intraperitoneally (i.p.) with 200 μl A. hydrophila suspension (5 × 107 CFU/ml) based on previous unpublished data. The fish treated with 200 μl 0.65% physiological saline, were used as the control. After 3, 6, 12, 24, and 48 h of injection, respectively, the spleen and head kidney, as the main immune organs of fish, were collected and immediately stored at −80 °C until RNA extraction. Five fish were sampled from each group at each time point. The experiments were performed in triplicate. In addition, the spleen in healthy fish was sampled for cloning partial sequences of TLRs genes.2.4. Total RNA isolation and cDNA synthesisTotal RNA was extracted from each sample using TRIzol Reagent (TaKaRa, Japan) according to the manufacture's protocol. The RNA concentrations were measured using NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) and the integrity was assessed by electrophoresis on 1% agarose gel. The first-strand cDNAs were synthesized using the PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan), which were respectively used to clone the TLRs gene fragments and to examine the expressing levels of the TLR genes by the quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) using the PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfert Real Time) (TaKaRa, Japan) following the instructions of manufacture. The cDNA templates were stored at −20 °C until used.2.5. Molecular cloning of the partial cDNA sequences of TLRs in C. auratusTo clone the partial sequences of C. auratus TLRs, degenerate primers were designed using Primer 5.0 software based on the conserved nucleotides which were identified from multiple sequence alignment of TLR in several fish species ( Table 1). Primers for TLR9 and TLR20 amplification were referenced from Wang et al. (2014) and Pietretti et al. (2014). The PCR was performed with 1 μl of cDNA in a 25 μl reaction volume under the protocol of initial denaturation at 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of 94 °C for 30 s, 53–57 °C (for different TLRs) for 30 s, 72 °C for 60 s and a final extension at 72 °C for 10 min. The PCR products were detected by electrophoresis on 1.5% agarose gel, purified using the E.Z.N.A.™ gel extraction kit (OMEGA, USA), and then ligated into pMD19-T vectors (TaKaRa, Japan) and transformed into DH5α competent cells (Biomed, China). Positive clones were screened by colony PCR and at least two clones were sequenced in both directions by Sangon Biotech Company (Shanghai, China).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1.
บทนำระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเป็นบรรทัดแรกของการป้องกันการบุกรุกเชื้อโรคในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังและสัตว์มีกระดูกสันหลัง(Rauta et al., 2014) ในฐานะที่เป็นรูปแบบการรับรับรู้เป็นครั้งแรกและลักษณะที่ดีที่สุด (PRRs) รับโทรเหมือน (TLRs) มีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (Wei et al., 2014) TLRs สามารถรับรู้ที่มีความหลากหลายป่าสงวนเชื้อโรคที่เกี่ยวข้องรูปแบบโมเลกุล (PAMPs) เช่น lipopeptides, lipopolysaccharide (LPS) แฟ, อาร์เอ็นเอและดีเอ็นเอที่มีลวดลาย unmethylated CpG (CpG ดีเอ็นเอ) และก่อให้เกิดเส้นทางการส่งสัญญาณที่เปิดใช้งานเซลล์ภูมิคุ้มกันในการตอบสนอง การติดเชื้อเชื้อโรค (ปัลที 2011 และ Sasai และยามาโมโตะ, 2013). ในวันที่ 13 สมาชิกของครอบครัว TLR ได้รับการระบุในการเลี้ยงลูกด้วยนมและส่วนประกอบของเชื้อแบคทีเรียหลายแห่งมีการแสดงให้เห็นว่าแกนด์ของ TLRs เลี้ยงลูกด้วยนม (เช่น TLR1, TLR2, TLR4 , TLR5, TLR6, TLR9 และ TLR10) (Sasai และยามาโมโตะ, 2013, อากิระ et al., 2006, ทาเคอุจิและอากิระ 2010 สมิ ธ et al., 2003, ฮายาชิ et al., 2001 และ Hemmi et al., 2000 ) เมื่อเทียบกับการเลี้ยงลูกด้วยนมปลา TLRs มีมากขึ้นและอย่างน้อย 20 TLR ชนิดได้ถูกพบในมากกว่าหนึ่งโหลปลาจนถึงปัจจุบัน (Rauta et al., 2014) อย่างไรก็ตามหลักฐานโดยตรงของความจำเพาะแกนด์มีเพียงการแสดงสำหรับสมาชิกบาง (TLR2, TLR3, TLR5M, TLR5S, TLR9, TLR21 และ TLR22) ของ TLRs ระบุในปลา TLR2, TLR5M และ TLR5S, TLR9 และ TLR21 เฉพาะสามารถรับรู้และ lipopeptides PGN, แฟและดีเอ็นเอ unmethylated CpG ตามลำดับซึ่งเป็น PAMPs จากเชื้อแบคทีเรีย นอกจากนี้ TLRs อื่น ๆ เช่น TLR1, TLR4, TLR14, TLR18 และ TLR25 ก็อาจจะเป็นเซ็นเซอร์ของเชื้อแบคทีเรีย (ทบทวน Zhang et al., 2014) หลังจากการติดเชื้อครั้งแรกและการติดเชื้อของเชื้อ Aeromonas hydrophila, TLR2, TLR3, TLR5, TLR21 ถูกพบว่ามีการเหนี่ยวนำให้เกิดอย่างมีนัยสำคัญในไตหน้าของช่องดุก (Ictalurus punctatus) (หมู่ et al., 2011 และจวน et al., 2013 ) ในม้ามของ croaker สีเหลืองขนาดใหญ่ (Pseudosciaena crocea) TLR1 และ TLR3 อย่างมีนัยสำคัญขึ้นควบคุมในขณะที่ TLR2 และ TLR22 ถูกควบคุมลงหลังจากการติดเชื้อ A. hydrophila (หมู่ et al., 2010) นอกจากนี้ TLR5 มีส่วนร่วมในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อ A. hydrophila ในปลาคาร์พที่สำคัญอินเดีย mrigal (Cirrhinus mrigala) (ซึ et al., 2012) แต่ไม่ว่าจะเป็นและที่ TLRs เล่นบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันการติดเชื้อ A. hydrophila ในปลาคาร์พ crucian Qihe (Carassius auratus) จะยังไม่ทราบส่วนใหญ่. ซี auratus ที่อาศัยอยู่ในแม่น้ำ Qihe เป็นปลาน้ำจืดที่ถิ่นเติบโตขึ้นอย่างรวดเร็ว และมีชื่อเสียงสำหรับรสชาติอร่อยที่อุดมไปด้วยและโภชนาการ ดังนั้นสายพันธุ์นี้ได้กลายเป็นปลาที่มีความสำคัญในเชิงพาณิชย์และได้รับการปลูกกันอย่างแพร่หลายทั่วตอนเหนือของมณฑลเหอหนานประเทศจีน (เจียง et al., 2012 และโจว et al., 2014) A. hydrophila, แบคทีเรียแกรมลบเป็นเชื้อฉวยโอกาสมากที่สุดที่นิยมแพร่หลายในประเทศจีนซึ่งสามารถติดเชื้อคนปศุสัตว์และสัตว์น้ำ (โจวและโจว 2012) การติดเชื้อของ hydrophila ก, แพร่กระจายอย่างรวดเร็วและทำให้เกิดความสูญเสียอย่างกว้างขวางในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำและจะได้รับการพิจารณาเป็นเชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคที่ร้ายแรงที่สุดสำหรับปลา Cyprinid (Podok et al., 2014 Lü et al., 2015 และดัฟ et al, 2014). ความรู้ของเรารูปแบบการแสดงออกของชุดที่สมบูรณ์ของ TLRs ในปลาน้ำจืดในช่วงแบคทีเรียแกรมลบการติดเชื้อยังไม่ได้รับรายงาน ในการศึกษาปัจจุบันเราโคลนลำดับบางส่วนของ TLRs ใน C. auratus และการตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกของ TLRs ในม้ามและไตมุ่งหน้าไปยังหน้าจอที่ TLRs มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อ A. hydrophila งานนี้จะอำนวยความสะดวกความเข้าใจที่ครอบคลุมของเราสำหรับการทำงานของ TLRs ในขั้นตอนของการติดเชื้อแบคทีเรียแกรมลบในซี auratus. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 ปลาเพื่อสุขภาพ C. auratus ที่มีน้ำหนักตัวเฉลี่ย 55 ± 2 กรัมที่ได้รับจากฟาร์มเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำในมณฑลเหอหนาน Normal University ปลาถูกปรับสภาพที่ 20 ± 2 องศาเซลเซียสเป็นเวลาสองสัปดาห์ในตู้พลาสติก (30 ตัว / ตู้) และได้รับการเลี้ยงดูจากนั้นครั้งที่สองวันที่มีเม็ดในเชิงพาณิชย์จน 24 ชั่วโมงก่อนที่จะสัมผัสกับการรักษา. 2.2 แบคทีเรียเอ hydrophila เป็นที่เลี้ยงใน Luria-Bertain (LB) วันที่ 28 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงมีค่าคงสั่น (180 รอบต่อนาที) เก็บเกี่ยวแล้วโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 8000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีและล้างสามครั้งกับ 0.65% น้ำเกลือทางสรีรวิทยาและตกตะกอนโดยการหมุนเหวี่ยง เซลล์แบคทีเรียได้ถูกระงับในน้ำเกลือทางสรีรวิทยาและนับทำงานได้ถูกกำหนดเป็นอาณานิคมของหน่วยขึ้นรูป (CFU) โดยชุบต่อไปนี้ 10 เท่าเจือจางอนุกรมบนแผ่นวุ้น. 2.3 การทดลองที่ท้าทายและเนื้อเยื่อสุ่มตัวอย่างปลาเพื่อสุขภาพที่ถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม (30 ปลาต่อกลุ่ม) สำหรับกลุ่มติดเชื้อแบคทีเรียปลาเข้า intraperitoneally ip () 200 ไมโครลิตร A. hydrophila ระงับ (5 × 107 CFU / ml) บนพื้นฐานของข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่ก่อนหน้านี้ ปลาที่ได้รับ 200 ไมโครลิตร 0.65% น้ำเกลือทางสรีรวิทยาถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม หลังจาก 3, 6, 12, 24 และ 48 ชั่วโมงของการฉีดตามลำดับม้ามและไตหัวเป็นอวัยวะหลักของระบบภูมิคุ้มกันของปลาที่ถูกเก็บรวบรวมและจัดเก็บไว้ทันทีที่ -80 องศาเซลเซียสจนถึงการสกัดอาร์เอ็นเอ ปลาห้าตัวอย่างจากแต่ละกลุ่มในแต่ละจุดเวลา การทดลองดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า นอกจากนี้ม้ามในปลาที่มีสุขภาพดีเป็นตัวอย่างสำหรับการโคลนลำดับบางส่วนของยีน TLRs. 2.4 แยก RNA รวมและการสังเคราะห์ยีนรวมRNA ถูกสกัดจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้ Trizol Reagent (Takara ญี่ปุ่น) ตามโปรโตคอลการผลิตของ ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอที่ถูกวัดโดยใช้ NanoDrop 2000 spectrophotometer (เทอร์โมวิทยาศาสตร์สหรัฐอเมริกา) และความสมบูรณ์ได้รับการประเมินโดย electrophoresis บน 1% agarose เจล cDNAs แรกเส้นใยสังเคราะห์ใช้ PrimeScriptTM ครั้งที่สอง 1 Strand ยีนสังเคราะห์ Kit (Takara ประเทศญี่ปุ่น) ซึ่งถูกนำมาใช้ตามลำดับในการโคลนเศษยีน TLRs และเพื่อตรวจสอบระดับการแสดงของยีน TLR โดยปริมาณ PCR แบบ Real-Time ( qRT-PCR) โดยใช้ PrimeScriptTM RT โทผสม (Perfert แบบ Real Time) (Takara ญี่ปุ่น) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต cDNA แม่ถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C จนใช้. 2.5 โคลนของลำดับยีนบางส่วนของ TLRs ใน C. auratus เพื่อโคลนลำดับส่วนหนึ่งของซี auratus TLRs ไพรเมอร์คนเลวได้รับการออกแบบโดยใช้ไพรเมอร์ซอฟแวร์ 5.0 ขึ้นอยู่กับนิวคลีโอป่าสงวนที่ถูกระบุจากลำดับการจัดเรียงหลาย TLR ในปลาหลายชนิด ( ตารางที่ 1). ไพรเมอร์สำหรับ TLR9 และขยาย TLR20 ถูกอ้างอิงจากวัง et al, (2014) และ Pietretti et al, (2014) PCR ได้ดำเนินการกับ 1 ไมโครลิตรของยีนในปริมาณ 25 ไมโครลิตรปฏิกิริยาภายใต้โปรโตคอลของ denaturation เริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบของ 94 ° C เป็นเวลา 30 วินาที, 53-57 ° C (สำหรับ TLRs ที่แตกต่างกัน ) เป็นเวลา 30 วินาที, 72 ° C เป็นเวลา 60 วินาทีและสุดท้ายเป็นส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกตรวจพบโดย electrophoresis บน 1.5% เจล agarose บริสุทธิ์โดยใช้ EZNA ™ชุดสกัดเจล (OMEGA, สหรัฐอเมริกา) และ ligated แล้วเป็นพาหะ pMD19-T (Takara ประเทศญี่ปุ่น) และกลายเป็นDH5αเซลล์อำนาจ (Biomed, จีน ) โคลนบวกถูกคัดกรองโดยวิธี PCR อาณานิคมและอย่างน้อยสองโคลนมีลำดับขั้นตอนในทั้งสองทิศทางโดย บริษัท ไบโอเทค Sangon (เซี่ยงไฮ้)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . บทนำ
ระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติเป็นบรรทัดแรกของการป้องกันการบุกรุกเชื้อโรคในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังและสัตว์ ( rauta et al . , 2010 ) เป็นครั้งแรกและลักษณะที่ดีที่สุดรูปแบบตัวรับ ( prrs ) โทรเหมือนตัวรับ ( tlrs ) มีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด ( Wei et al . , 2010 )tlrs สามารถรับรู้ความหลากหลายสูงอนุรักษ์รูปแบบโมเลกุล ( pamps เชื้อโรคที่เกี่ยวข้อง ) เช่น lipopeptides สีดำเข้ม , ( หล่อลื่น ) ทาง RNA และ DNA ที่ประกอบด้วยลวดลาย unmethylated CPG ( CPG ดีเอ็นเอ ) และเรียกการส่งสัญญาณที่จะเปิดใช้งานเซลล์ภูมิคุ้มกันในการตอบสนองต่อการติดเชื้อเชื้อโรค ( palti 2011 และซาไซ และยามาโมโตะ
, 2013 )
ไปเดท13 สมาชิกของครอบครัว TLR ที่ได้รับการระบุในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และส่วนประกอบของแบคทีเรียหลายได้รับการแสดงที่จะเป็นลิแกนด์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่น tlr1 tlr2 tlrs , tlr4 tlr5 tlr6 , , , , tlr9 และ tlr10 ) ( ซาไซ และ ยามาโมโตะ , 2013 , อากิระ et al . , 2006 , ทาเคอุจิและอากิระ , 2010 , สมิ ธ et al . , 2003 , ฮายาชิ et al . , 2001 และ hemmi et al . , 2000 ) เมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ปลามี tlrs เพิ่มเติมและอย่างน้อย 20 TLR ชนิดที่ถูกพบในมากกว่าโหลของปลาวันที่ ( rauta et al . , 2010 ) อย่างไรก็ตาม หลักฐานโดยตรงของการเกิดความจำได้ถูกแสดงไม่กี่สมาชิก ( tlr2 tlr3 , tlr5m tlr5s tlr9 , , , , tlr21 และ tlr22 ) ของ tlrs ระบุในปลา tlr2 tlr5m tlr5s , และ , และโดยเฉพาะ tlr9 tlr21 สามารถรับรู้และ lipopeptides pgn ทาง , ,unmethylated CPG และดีเอ็นเอ ตามลำดับ ซึ่ง pamps จากแบคทีเรีย นอกจากนี้ tlrs อื่นๆ เช่น tlr1 tlr4 tlr14 tlr18 , , , , และ tlr25 อาจถูกเซ็นเซอร์ของแบคทีเรีย ( ดูใน Zhang et al . , 2010 ) หลังจากการติดเชื้อครั้งแรกและอีกครั้งการติดเชื้อ hydrophila tlr2 tlr3 tlr5 , , , ,tlr21 พบเป็นทางนำไตด้านหน้าของปลาดุกอุย ( ictalurus punctatus ) ( MU et al . , 2011 และมู et al . , 2013 ) ในม้ามของปลาขนาดใหญ่ ( pseudosciaena crocea ) tlr1 tlr3 อย่างมีนัยสำคัญและสามารถและในขณะที่ tlr2 tlr22 ลงมาควบคุมการติดเชื้อ ( A . hydrophila หลังจากมู et al . , 2010 ) นอกจากนี้tlr5 มีส่วนร่วมในการสร้างภูมิคุ้มกันต่อต้านการติดเชื้อ A . hydrophila ในปลาคาร์พสาขาอินเดีย ปลานวลจันทร์เทศ ( วัดพระธาตุดอยสุเทพราชวรวิหาร mrigala ) ( บาซู et al . , 2012 ) อย่างไรก็ตาม ไม่ว่าที่ tlrs เล่นที่สำคัญบทบาทในระบบภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อ A . hydrophila ใน qihe crucian ปลาคาร์พ ( Carassius auratus ) ยังคงเป็นส่วนใหญ่ที่ไม่รู้จัก

c . auratus อาศัยอยู่ใน qihe แม่น้ํา เป็นปลาเฉพาะถิ่น ,ที่เติบโตอย่างรวดเร็ว และมีชื่อเสียงในรสชาติอร่อยและอาหารที่อุดมไปด้วย ดังนั้น , ชนิดนี้ เป็นปลาเชิงพาณิชย์ที่สำคัญและมีการปลูกกันอย่างแพร่หลายทั่วทางเหนือของมณฑลเหอหนาน , จีน ( เจียง et al . , 2012 และโจว et al . , 2010 ) A . hydrophila , แบคทีเรียแกรมลบเป็นเชื้อฉวยโอกาสที่นิยมกันอย่างแพร่หลายในประเทศจีนซึ่งสามารถติดเชื้อในคน