Electron microscopyTo purify virus,

Electron microscopy

To purify virus, 30 ml of cell culture supernatant was overlaid on 4 ml of 20% sucrose in TNE buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) and 2 ml of 55% sucrose in TNE in an SW 28 tube (Beckman-Coulter, Brea, CA). Samples were spun for 3 h at 25 k RPM in an SW 28 rotor. Purified virus was collected from the 20%-55% sucrose interface, diluted with TNE and pelleted for 2 h at 55 k RPM in an SW 55Ti rotor. Pellets were resuspended in 40–60 μl TNE and kept on ice for immediate use.

Purified virus was treated with 8.0 × 10-3 g/ml of S. nigra extract or 0.8% ethanol as a vehicle control in PBS for 15 min at room temperature. Samples were then spotted onto a glow discharged, carbon coated copper grid (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) and incubated for 2 min. Grids were rinsed with water, and stained for 1 min with 2% phosphotungstinic acid, pH 7.4. Samples were examined on a Hitachi 7600 transmission electron microscope under 80 kV, and micrographs collected using AMT Image Capture Engine software controlling an AMT ER50 5 megapixel CCD camera (Advanced Microscopy Techniques Corp., Danvers, MA).

Ethical approval

The research protocol used for this study was approved by the Health & Biosafety Committee at Emory University (Biosafety File #: 08-2528-11). No human or animal subjects were used.

Go to:
Results
Determining non-cytotoxic concentrations of plant extracts

Screening of plant extracts for antiviral potential must be done using non-cytotoxic concentrations of extract. Therefore, cytotoxicity assays with trypan blue staining were performed. Cells were treated for 48 h with the indicated concentration of N. sativa, R. rosea, or S. nigra extracts and the number of live cells for each concentration of extract, relative to solvent treatment alone, was determined. For all plant extracts, the number of live cells decreased with increasing concentrations of extract in a dose-responsive manner (Figure 1). The highest concentration of plant extract that did not significantly decrease the number of live cells, relative to controls, was used for all subsequent antiviral screening.

Figure 1
Figure 1
Determining non-cytotoxic concentrations of each plant extract. Vero cells were treated for 48 hours with the indicated concentration of plant extract. Independent cytotoxicity assays were performed three times, with four replicates per assay, using trypan ...
N. sativa and R. rosea extracts do not inhibit IBV, while S. nigra extracts do

Antiviral agents may exhibit an effect via myriad mechanisms. Therefore, screening was performed using extract before, during, and after infection to maximize the possibility of detecting antiviral action. Cells were treated for 24 h prior to infection with the indicated concentration of extract. Virus was treated for 20 min prior to infection and extract was present during the 1 h absorption of virus to cells. Cells were then treated for an additional 24 h post-infection (p.i.). Treatment with solvent alone was used as a control. At 24 h p.i. cells were visually assessed for viral cytopathic effect (CPE). Supernatants and cells were harvested separately and viral titers were quantified.

Virus titers of the N. sativa extract-treated supernatants and cells were not significantly different from controls (Figure 2A). Unexpectedly, R. rosea extract-treated supernatants and cells showed a small, yet reproducible, two-fold increase in virus titers (Figure 2B). On the other hand, S. nigra extract-treated cells showed no detectable CPE at an MOI of 0.1 and a reduction of virus titers by six orders of magnitude (Figures 2C & 2D). Inhibition was not as great in S. nigra extract-treated samples when a higher MOI of 1 was used (Figure 2E). However, this inhibition was still large, reducing viral titers by approximately four orders of magnitude, relative to solvent-treated samples. Virus titers also decreased with increasing S. nigra extract concentrations in a dose-responsive manner, indicating that S. nigra extract treatment was responsible for virus inhibition.

Figure 2
Figure 2
N. sativa and R. rosea extracts do not inhibit IBV, while S. nigra extracts do. A – D) Cells were pretreated for 24 h and virus for 20 min with 3.75 × 10-4 g/ml N. sativa extract, 1.5 × 10-4 g/ml ...
S. nigra extracts inhibit IBV at an early step in the infection process

To begin uncovering the mechanism by which S. nigra extracts inhibited IBV, we assessed the impact of shortened S. nigra extract treatments on IBV replication. A series of infections were done in which only cells were treated with extract prior to infection (pre-C), only virus was treated prior to infection (pre-V), or only treatment following infection was done (post). The pre-C treatment did not result in any reduction in virus titer relative to treatment with solvent alone (Figure 3). Similarly, virus titers were not reduced in the cells of samples that received only the post treatment. However, the post treatment did result in a modest, three-fold reduction in titers of the supernatants. On the other hand, the pre-V treatment resulted in a titer reduction of over three orders of magnitude in the cells and over four orders of magnitude in the supernatants. Clearly, out of the three shortened treatments tested, the pre-V treatment alone showed the greatest inhibition. However, this treatment was not sufficient for reducing virus titers to the same level as when all three treatments were combined.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Microscopy อิเล็กตรอนต้องทำไวรัส 30 ml ของ supernatant วัฒนธรรมเซลล์เป็น overlaid บน 4 ml ของซูโครส 20% สนอง TNE บัฟเฟอร์ (50 mM ตรี ค่า pH 7.4, 100 มม. NaCl, EDTA 1 mM) และ 2 ml ของซูโครส 55% ในสนอง TNE ในหลอด SW 28 (Beckman Coulter, Brea, CA) ตัวอย่างที่ปั่นสำหรับ h 3 ที่ 25 k RPM ในใบพัดเป็น SW 28 ไวรัสบริสุทธิ์รวบรวมจากอินเตอร์เฟซของซูโครส 20% - 55% ผสมกับสนอง TNE และ pelleted สำหรับ h 2 ที่ 55 k ได้ RPM ในมีใบพัด 55Ti ตะวันตกเฉียงใต้ ขี้ resuspended ใน μl 40 – 60 สนอง TNE และเก็บไว้ในน้ำแข็งทันทีใช้ไวรัสบริสุทธิ์ถูกรักษา ด้วย 8.0 × 10-3 g / ml ของ S. nigra 0.8% หรือสารสกัดเอทานอลเป็นตัวควบคุมยานพาหนะใน PBS ใน 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างแล้วก็ด่างไปเรืองแสงที่ปล่อยออก คาร์บอนเคลือบทองแดงเส้น (วิทยาศาสตร์ Microscopy อิเล็กตรอน แฮทฟิลด์ PA) และ incubated สำหรับกริด 2 นาที rinsed ด้วยน้ำ และสีใน 1 นาทีด้วย 2% phosphotungstinic กรด ค่า pH 7.4 ตัวอย่างตรวจสอบในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนส่งฮิตาชิ 7600 ต่ำกว่า 80 kV และ micrographs เก็บรวบรวมโดยใช้โปรแกรมการจับภาพจำนวนซอฟต์แวร์การควบคุมกล้องมีล้านพิกเซล CCD จำนวน ER50 5 (ขั้นสูง Microscopy เทคนิค Corp. เดนเวอร์ MA)อนุมัติจริยธรรมวิจัยใช้ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการมหาวิทยาลัย Emory Biosafety สุขภาพ (Biosafety แฟ้ม #: 2528-08-11) เรื่องสัตว์ หรือมนุษย์ไม่ได้ใช้ลุยเลย:ผลลัพธ์กำหนดความเข้มข้นไม่ใช่ cytotoxic สารสกัดจากพืชโรงงานคัดแยกสำหรับยาต้านไวรัสอาจจำเป็นต้องกระทำโดยใช้ความเข้มข้นไม่ใช่ cytotoxic ของสารสกัด ดังนั้น assays cytotoxicity ด้วยย้อมสี trypan blue ได้ดำเนิน เซลล์ได้รับการรักษาสำหรับ h 48 กับระบุความเข้มข้น ของซาตอนเหนือ rosea อาร์ S. nigra สารสกัด และกำหนดหมายเลขของเซลล์สดสำหรับแต่ละความเข้มข้นของสารสกัด เทียบเท่า รักษาตัวทำละลาย สำหรับสารสกัดจากพืชทั้งหมด จำนวนของเซลล์สดลดลง ด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของสารสกัดในลักษณะตอบสนองต่อปริมาณรังสี (รูปที่ 1) ความเข้มข้นสูงสุดของโรงงานสกัดที่ไม่มากลดจำนวนของเซลล์สด สัมพันธ์ควบคุม ใช้สำหรับคัดกรองยาต้านไวรัสตามมาทั้งหมดรูปที่ 1รูปที่ 1กำหนดความเข้มข้นไม่ใช่ cytotoxic ของสารสกัดจากพืชแต่ละ เซลล์ Vero ได้รับการรักษาภายใน 48 ชั่วโมงพร้อมระบุความเข้มข้นของสารสกัดจากพืช Assays cytotoxicity อิสระดำเนินสามครั้ง กับสี่เหมือนกับต่อทดสอบ ใช้ trypan ...ซาตอนเหนือและสารสกัด rosea อาร์ไม่ยับยั้ง IBV ในขณะที่สารสกัดจาก S. nigra ทำตัวแทนยาต้านไวรัสอาจแสดงผลผ่านทางกลไกการพัก ดังนั้น ตรวจที่ดำเนินการโดยใช้สารสกัดก่อน ระหว่าง และหลัง จากการติดเชื้อเพื่อเพิ่มความเป็นไปได้ของการตรวจสอบการดำเนินการต้านไวรัส เซลล์ได้รับการรักษาใน 24 ชมก่อนติดเชื้อด้วยการระบุความเข้มข้นของสารสกัด ไวรัสได้รับการรักษา 20 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ และสารสกัดอยู่ในระหว่างการดูดซึมของไวรัส 1 h ที่เซลล์ เซลล์ได้รับการรักษาแล้วการติดเชื้อหลัง 24 ชมเพิ่มเติม (p.i.) รักษา ด้วยตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวถูกใช้เป็นตัวควบคุม ที่ p.i. 24 ชม เซลล์เห็นประเมินผล cytopathic ไวรัส (CPE) Supernatants และเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวต่างหาก และไวรัส titers มี quantifiedไวรัส titers ซาตอนเหนือถือว่าสารสกัด supernatants และเซลล์ไม่แตกต่างอย่างมากจากตัวควบคุม (รูป 2A) โดยไม่คาดคิด R. rosea ถือว่าสารสกัด supernatants และเซลล์พบสองพับเล็ก ยัง จำลอง ไวรัส titers (รูปที่ 2B) เพิ่มขึ้น บนมืออื่น ๆ S. nigra รับสารสกัดเซลล์พบ CPE ไม่อาสาที่มีอยของ 0.1 และลดไวรัส titers โดยอันดับหกของขนาด (ตัวเลข 2C และ 2D) ยับยั้งไม่เป็นดี S. nigra ถือว่าสารสกัดจากตัวอย่างเมื่ออยสูง 1 ใช้ (รูปที่ 2E) อย่างไรก็ตาม ยับยั้งนี้เป็นใหญ่ยัง ไวรัส titers ที่ลดลง โดยประมาณสี่อันดับของขนาด สัมพันธ์กับตัวอย่างที่ถือว่าตัวทำละลาย Titers ไวรัสลดลงยัง มีเพิ่มขึ้น S. nigra สารสกัดความเข้มข้นในลักษณะที่ตอบสนองต่อยา ระบุว่า S. nigra สารสกัดรักษารับผิดชอบในการยับยั้งไวรัสรูปที่ 2รูปที่ 2ซาตอนเหนือและสารสกัด rosea อาร์ไม่ยับยั้ง IBV ในขณะที่สารสกัดจาก S. nigra ทำ A – D) เซลล์ที่ pretreated 24 ชมและไวรัสสำหรับ 20 นาทีกับ 3.75 × 10-4 g / ml ซาตอนเหนือแยก 1.5 × 10-4 g / ml ...S. nigra สารสกัดยับยั้ง IBV ในขั้นตอนการเริ่มต้นในการติดเชื้อเริ่มต้นเปิดเจอทุ่นระเบิดกลไก โดยที่ S. nigra สารสกัดห้าม IBV เราประเมินผลกระทบของย่อ S. nigra สารสกัดทรีทเมนต์บน IBV จำลอง ทำชุดของการติดเชื้อในเซลล์เดียวที่ได้รับสารสกัดก่อนติดเชื้อ (ก่อน-C), ไวรัสเท่านั้นถือว่าก่อนที่จะติดเชื้อ (pre-V), หรือรักษาเฉพาะต่อเชื้อเสร็จ (โพสต์) การรักษาก่อน-C ได้ผลในการลดในไวรัส titer สัมพันธ์รักษาด้วยตัวทำละลายเพียงอย่างเดียว (รูปที่ 3) ในทำนองเดียวกัน titers ไวรัสก็ไม่ได้ลดลงในเซลล์ตัวอย่างที่ได้รับเฉพาะการรักษาลง อย่างไรก็ตาม โพสต์การรักษาไม่ได้ผลในการเจียมเนื้อเจียมตัว ลด three-fold titers ของ supernatants บนมืออื่น ๆ การรักษาก่อน-V ผลลด titer ของกว่าสามอันดับของขนาดในเซลล์และ 4 อันดับของขนาดในการ supernatants ชัดเจน จากสามลดลงการรักษาผ่านทดสอบ การรักษาก่อน-V เพียงอย่างเดียวพบว่ายับยั้งมากที่สุด อย่างไรก็ตาม รักษานี้ไม่เพียงพอสำหรับไวรัส titers ที่ลดลงสู่ระดับเดียวกับเมื่อมีรวมรักษาทั้งหมดสาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในการชำระล้างไวรัส 30 มิลลิลิตรของสารละลายการเพาะเลี้ยงเซลล์ได้รับการซ้อนทับกันในวันที่ 4 มิลลิลิตร 20% น้ำตาลซูโครสในบัฟเฟอร์ TNE (50 mM Tris พีเอช 7.4, 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 1 มิลลิ EDTA) และ 2 มิลลิลิตร 55% น้ำตาลซูโครสใน TNE ใน หลอด 28 SW (Beckman-โคลเตอร์บรี, CA) ตัวอย่างกำลังหมุนเวลา 3 ชั่วโมง 25 k RPM ใน SW 28 โรเตอร์ ไวรัสบริสุทธิ์ถูกเก็บรวบรวมจาก 20% -55% อินเตอร์เฟซซูโครสเจือจางด้วย TNE และเม็ดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 55 k RPM ในโรเตอร์ SW 55TI เกล็ดถูก resuspended ใน 40-60 ไมโครลิตร TNE และเก็บไว้บนน้ำแข็งใช้งานได้ทันที. ไวรัสบริสุทธิ์ได้รับการรักษาด้วย 8.0 × 10-3 g / ml สารสกัดเอทานอลเอสนิโกรหรือ 0.8% เนื่องจากการควบคุมยานพาหนะในพีบีเอสเป็นเวลา 15 นาทีในห้องพัก อุณหภูมิ ตัวอย่างที่เห็นนั้นไปยังเรืองแสงออกจากโรงพยาบาลตารางทองแดงเคลือบคาร์บอน (Electron Microscopy วิทยาศาสตร์, ฮัท, PA) และบ่มเป็นเวลา 2 นาที กริดถูกล้างด้วยน้ำและการย้อมสีเป็นเวลา 1 นาทีมี 2% กรด phosphotungstinic ค่า pH 7.4 ตัวอย่างถูกตรวจสอบในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนส่ง Hitachi 7600 ภายใต้ 80 กิโลโวลต์และไมโครเก็บรวบรวมโดยใช้การจับภาพ AMT ซอฟต์แวร์ควบคุมเครื่องยนต์กล้อง CCD AMT ER50 5 ล้านพิกเซล (Advanced เทคนิคจุลทรรศน์คอร์ป, เดนเวอร์, MA). อนุมัติจริยธรรมโครงร่างการวิจัยที่ใช้ในการ การศึกษาครั้งนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการสุขภาพและความปลอดภัยทางชีวภาพที่มหาวิทยาลัยเอมอรี (Biosafety ไฟล์ #: 08-2528-11) ไม่มีวิชามนุษย์หรือสัตว์ถูกนำมาใช้. ไปที่: ผลการกำหนดความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษของสารสกัดจากพืชการคัดเลือกสารสกัดจากพืชที่มีศักยภาพสำหรับต้านไวรัสต้องทำโดยใช้ความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษของสารสกัด ดังนั้นการตรวจพิษด้วยการย้อมสีฟ้าทริแพนได้ดำเนินการ เซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 48 ชั่วโมงมีความเข้มข้นที่ระบุของ sativa เอ็นอาร์สีชมพูหรือสารสกัดจากเอสนิโกรและจำนวนของเซลล์สดสำหรับแต่ละความเข้มข้นของสารสกัดเทียบกับตัวทำละลายการรักษาเพียงอย่างเดียวที่ถูกกำหนด สำหรับสารสกัดจากพืชทั้งหมดจำนวนของเซลล์สดลดลงมีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของสารสกัดในลักษณะที่ตอบสนองต่อยา (รูปที่ 1) ความเข้มข้นสูงสุดของสารสกัดจากพืชที่ไม่ได้อย่างมีนัยสำคัญลดจำนวนของเซลล์ที่มีชีวิตอยู่เมื่อเทียบกับการควบคุมที่ใช้สำหรับการตรวจคัดกรองไวรัสที่ตามมาทั้งหมด. รูปที่ 1 รูปที่ 1 การกำหนดความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ของแต่ละสารสกัดจากพืช เซลล์เวโรได้รับการรักษาเป็นเวลา 48 ชั่วโมงมีความเข้มข้นที่ระบุของสารสกัดจากพืช การตรวจพิษอิสระได้ดำเนินการครั้งที่สามกับสี่ซ้ำต่อการทดสอบโดยใช้ทริแพน ... N. sativa และสารสกัดจากอาร์สีชมพูไม่ยับยั้งหลอดลมอักเสบติดต่อในขณะที่สารสกัดจากเอสนิโกรทำตัวแทนต้านไวรัสอาจแสดงผลผ่านทางกลไกมากมาย ดังนั้นการตรวจคัดกรองได้รับการดำเนินการโดยใช้สารสกัดจากก่อนระหว่างและหลังจากการติดเชื้อที่จะเพิ่มความเป็นไปได้ของการตรวจสอบการดำเนินการต้านไวรัส เซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะมีการติดเชื้อที่มีความเข้มข้นของสารสกัดที่ระบุ ไวรัสได้รับการรักษาเป็นเวลา 20 นาทีก่อนที่จะมีการติดเชื้อและสารสกัดที่ถูกนำเสนอในระหว่างการดูดซึม 1 ชั่วโมงของไวรัสไปยังเซลล์ เซลล์ได้รับการรักษาแล้วสำหรับอีก 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (PI) การรักษาด้วยตัวทำละลายเพียงอย่างเดียวในการควบคุม เวลา 24 ชั่วโมงเซลล์ปี่มีการประเมินสายตาสำหรับผล cytopathic ไวรัส (CPE) supernatants และเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและแยกเชื้อไวรัสได้รับการวัด. ไวรัส titers ของ N. sativa supernatants สารสกัดที่ได้รับและเซลล์ไม่แตกต่างจากการควบคุม (รูปที่ 2A) โดยไม่คาดคิดอาร์สีชมพู supernatants สารสกัดที่ได้รับและแสดงให้เห็นว่าเซลล์ขนาดเล็กยังสามารถทำซ้ำได้เพิ่มขึ้นสองเท่าใน titers ไวรัส (รูปที่ 2B) ในทางตรงกันข้าม, S. นิโกรเซลล์สารสกัดที่ได้รับพบว่าไม่มี CPE ที่ตรวจพบที่กระทรวงมหาดไทย 0.1 และการลดลงของเชื้อไวรัสโดยหกคำสั่งของขนาด (ตัวเลข 2C และ 2D) ยับยั้งไม่ได้เป็นใหญ่ในเอสนิโกรตัวอย่างสารสกัดที่ได้รับเมื่อ MOI ที่สูงขึ้นของ 1 ถูกนำมาใช้ (รูป 2E) อย่างไรก็ตามการยับยั้งนี้ก็ยังคงมีขนาดใหญ่ลดเชื้อไวรัสประมาณสี่คำสั่งของขนาดเมื่อเทียบกับตัวทำละลายที่ได้รับตัวอย่าง ไวรัสเชื้อก็ลดลงด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของสารสกัดจากเอสนิโกรในลักษณะที่ตอบสนองต่อยาที่แสดงให้เห็นว่าเอสนิโกรรักษาสารสกัดเป็นผู้รับผิดชอบในการยับยั้งไวรัส. รูปที่ 2 รูปที่ 2 N. sativa และสารสกัดจากอาร์สีชมพูไม่ยับยั้งหลอดลมอักเสบติดต่อในขณะที่สารสกัดจากเอสนิโกรทำ - D) เซลล์ที่ถูกปรับสภาพเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและไวรัสสำหรับ 20 นาทีกับ 3.75 × 10-4 g / ml N. สารสกัด sativa 1.5 × 10-4 g / ml ... เอ สารสกัดจากนิโกรยับยั้งหลอดลมอักเสบติดต่อในขั้นตอนเริ่มต้นในกระบวนการการติดเชื้อในการเริ่มต้นการเปิดเผยกลไกที่เอสนิโกรสารสกัดยับยั้งหลอดลมอักเสบติดต่อเราประเมินผลกระทบของการตัดให้สั้น S. นิโกรการรักษาสารสกัดในการจำลองแบบหลอดลมอักเสบติดต่อ ชุดของการติดเชื้อได้ทำที่เซลล์เดียวที่ได้รับการรักษาด้วยสารสกัดจากก่อนที่จะมีการติดเชื้อ (Pre-C), ไวรัสเพียงได้รับการรักษาก่อนที่จะมีการติดเชื้อ (Pre-V) หรือเพียงการรักษาต่อไปนี้การติดเชื้อได้ทำ (โพสต์) การรักษาก่อน-C ไม่ได้ผลในการลดใด ๆ ใน titer ไวรัสเมื่อเทียบกับการรักษาด้วยตัวทำละลายเพียงอย่างเดียว (รูปที่ 3) ในทำนองเดียวกัน titers ไวรัสที่ไม่ได้ลดลงในเซลล์ของกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการรักษาเพียงโพสต์ อย่างไรก็ตามการรักษาโพสต์ไม่ส่งผลในการเจียมเนื้อเจียมตัวลดลงสามเท่าใน titers ของ supernatants ในทางตรงกันข้ามการรักษาก่อน-V ส่งผลในการลด titer กว่าสามคำสั่งของขนาดในเซลล์และกว่าสี่คำสั่งของขนาดใน supernatants เห็นได้ชัดจากสามการรักษาสั้นลงทดสอบการรักษาก่อน-V คนเดียวยับยั้งที่ยิ่งใหญ่ที่สุด อย่างไรก็ตามการรักษานี้ไม่เพียงพอสำหรับการลดเชื้อไวรัสในระดับเดียวกับเมื่อทั้งสามการรักษามารวมกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

ให้ไวรัส 30 มล. สูงการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกวางทับบน 4 ml ของซูโครส 20% หวัง ( 50 มม. โดยบัฟเฟอร์ pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA ) และ 2 ml ของน้ำตาลซูโครสร้อยละ 55 ในหวังใน SW 28 หลอด ( Beckman Coulter เบรีย , แคลิฟอร์เนีย ) . จำนวนหมุน 3 H ที่ 25 , 000 รอบต่อนาทีใน SW 28 ใบพัด . เชื้อไวรัสบริสุทธิ์รวบรวมจาก 20% - 55% โดยติดต่อและเจือจางด้วยหวังเม็ด 2 ชั่วโมง 55 K รอบต่อนาทีในใบพัด SW 55ti . อัตรา resuspended 40 – 60 μผมรวบรวมและเก็บไว้บนน้ำแข็งเพื่อใช้ทันที

เชื้อไวรัสบริสุทธิ์รักษาด้วย 8 × 10-3 g / ml เอสไนกร้าแยกหรือเอทานอล 0.8% เป็นรถควบคุมใน PBS 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างที่พบจากนั้นไปยังเรืองแสงแบบนี้รางทองแดงเคลือบคาร์บอน ( กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน , วิทยาศาสตร์ , ฮัท , PA ) และบ่มเป็นเวลา 2 นาทีกริดถูกล้างด้วยน้ำและเปื้อน 1 นาทีกับ 2 % phosphotungstinic กรด pH 7.4 . ตัวอย่างตรวจใน Hitachi 7600 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนภายใต้ 80 กิโลโวลต์ที่ใช้ในการเก็บรวบรวม และ micrographs AMT การจับภาพซอฟต์แวร์ควบคุมเครื่องยนต์ AMT er50 5 ล้านพิกเซล ( กล้อง CCD ที่ใช้เทคนิคขั้นสูงคอร์ป , เดนเวอร์ , MA ) .

จริยธรรมการวิจัยขั้นตอนการอนุมัติ

ใช้ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยสุขภาพ&ความปลอดภัยทางชีวภาพ ( Biosafety คณะกรรมการที่มหาวิทยาลัยเอมอรีไฟล์# : 08-2528-11 ) ไม่มีคนหรือสัตว์ที่ถูกใช้ไป :



ผลกำหนดความเข้มข้นของ สารสกัดจากพืชปลอดพิษ

การคัดเลือกสารสกัดจากพืชที่มีศักยภาพสำหรับไวรัสต้องใช้ความเข้มข้นที่เป็นพิษปลอดสาร . ต่อด้วยไตรแพนจึงใช้สีน้ำเงินย้อมได้ . เซลล์จะถูก 48 H กับพบความเข้มข้นของ N . sativa , R rosea หรือ sไนกร้าแยก และจำนวนเซลล์มีชีวิตแต่ละความเข้มข้น ของสารสกัด เทียบกับตัวทำละลาย การรักษาเพียงอย่างเดียว คือความมุ่งมั่น สำหรับสารสกัดจากพืชทั้งหมด จำนวนเซลล์ลดลงเมื่อเพิ่มความเข้มข้นของสารสกัดสดในการตอบสนองลักษณะ ( รูปที่ 1 ) ความเข้มข้นสูงสุดของสารสกัดจากพืชที่ไม่ได้ลดจำนวนเซลล์มีชีวิตเมื่อเทียบกับการควบคุมที่ใช้ตรวจคัดกรองไวรัสตามมาทั้งหมด

รูปที่ 1

รูปที่ 1 การกำหนดความเข้มข้นของแต่ละสารสกัดจากพืชปลอดพิษ . เวโรเซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 48 ชั่วโมง กับพบความเข้มข้นของสารสกัดจากพืช ใช้เซลล์อิสระจำนวน 3 ครั้ง มี 4 ซ้ำต่อโดยการใช้ไตรแพน . . . . . . .
. sativa และ R .โรซี่สกัดไม่ขัดขวาง IBV ในขณะที่ S ไนกร้าแยกทำ

สารต้านไวรัสอาจแสดงผลผ่านหลายกลไก ดังนั้น การใช้สารสกัดได้ก่อน ระหว่าง และหลังการติดเชื้อจะเพิ่มความเป็นไปได้ของการตรวจหาฤทธิ์ต้านการกระทํา เซลล์จะถูกสำหรับ 24 ชั่วโมงก่อนที่จะพบความเข้มข้นของเชื้อด้วยสารสกัดไวรัสได้รับการรักษาสำหรับ 20 นาทีก่อนการติดเชื้อและสารสกัดที่เป็นปัจจุบันในช่วง 1 ชั่วโมง การดูดซึมของไวรัสต่อเซลล์ เซลล์ จึงถือว่าเป็นอีก 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ( PI ) การรักษาด้วยตัวทำละลายอย่างเดียว ถูกใช้เป็นตัวควบคุม เวลา 24 ชั่วโมง PI เซลล์มีสายตาประเมิน ผล cytopathic ไวรัส ( CPE ) supernatants และเซลล์เก็บแยกต่างหาก และไวรัส โดยได้วัดได้

ของไวรัสโดยเอ็น , สารสกัดและการ supernatants เซลล์ก็ไม่แตกต่างจากการควบคุม ( รูปที่ 2A ) ไม่คาดคิด , R rosea แยกปฏิบัติ supernatants และเซลล์มีขนาดเล็ก แต่การหาก , เพิ่มโดยไวรัส ( รูปที่ 2B ) บนมืออื่น ๆ , S . ไนกร้าแยกเซลล์รักษาไม่พบตรวจพบถุงที่ Moi ของ 01 และลดลงโดยไวรัสโดยคำสั่งของขนาดหก ( ตัวเลข& 2C 2D ) การยับยั้งไม่เป็นที่ดีใน S . ไนกร้าสกัดตัวอย่างได้รับการรักษาเมื่อสูงขึ้น มท. 1 ถูกใช้ ( รูปที่ 2 ) อย่างไรก็ตาม สารนี้ยังมีขนาดใหญ่ โดยลดไวรัสประมาณสี่คำสั่งของขนาดเทียบกับตัวทำละลาย การรักษาคน โดยไวรัสลดลงด้วยการเพิ่ม .สารสกัดในขนาดความเข้มข้นไนกร้าตอบสนองลักษณะบ่งชี้ว่า การรักษาสารสกัดเอสไนกร้าเป็นผู้รับผิดชอบในการยับยั้งไวรัส .

รูปที่ 2
รูปที่ 2
N , และ R . rosea สกัดไม่ขัดขวาง IBV ในขณะที่ S ไนกร้าแยกทำ ( D ) เป็นเซลล์ก็ผ่านตลอด 24 ชั่วโมงและไวรัสสำหรับ 20 นาทีกับ 3.75 × 10-4 g / ml . , สารสกัดจาก  1.5 × 10-4 g / ml . . . . . . .
sสารสกัดยับยั้งไนกร้า IBV ที่ขั้นตอนแรกในกระบวนการการติดเชื้อ

เริ่มเปิดโปงกลไกซึ่งเอสไนกร้าสกัดยับยั้ง IBV เราประเมิน ผลกระทบของการรักษาในสหรัฐอเมริกาเข้าไนกร้าแยก IBV ซ้ำ ชุดของเชื้อ ทำในที่เฉพาะเซลล์ได้รับการรักษาด้วยสารสกัดก่อนการติดเชื้อ ( pre-c ) เท่านั้น ไวรัสได้รับการรักษาก่อนที่จะติดเชื้อ ( pre-v )หรือการรักษาตามเชื้อเสร็จ ( หลัง ) การรักษา pre-c ไม่ได้ผลในการลดใด ๆในที่สัมพันธ์กับการรักษาด้วยสารเคมี ไวรัสชนิดเดียว ( รูปที่ 3 ) ในทำนองเดียวกัน โดยไวรัสไม่ได้ลดลงในเซลล์ของตัวอย่างที่ได้รับการโพสต์การรักษา อย่างไรก็ตาม การโพสต์การรักษาได้ผลในเจียมเนื้อเจียมตัว สามพับ ลดไตเตอร์ของ supernatants .บนมืออื่น ๆ , การรักษา pre-v มีผลในการลดระดับของอันดับของขนาดในเซลล์และคำสั่งของขนาดใน supernatants สี่สาม ชัดเจน , ออกจากสามย่อ การทดสอบ , pre-v รักษาคนเดียว พบสารมากที่สุด อย่างไรก็ตามการรักษานี้จะไม่เพียงพอสำหรับการลดโดยไวรัสในระดับเดียวกับเมื่อทั้ง 3 วิธีรวมกัน