3.3. Discrimination of the differen

3.3. Discrimination of the different RSIVs by multiplex PCR
As shown in Fig. 3, the Pst I restriction fragment of RSIV CH-1 had 92.9% nucleotide
sequence homology with RSIV Namhae (or the reference sequence of RSIV Ehime-1).
However, we found two highly variable regions with a deletion of three continuous
nucleotides in RSIV Sachun and CH-1 at position 36–38 and 432–434, respectively. Two
primers were designed using the sequences of two variable regions, 24–41 (sense primer
NF) and 425–446 (antisense primer CR) in the Pst I restriction fragment of RSIV Namhae
and CH-1, respectively. Additionally, other two primers were designed, AF (sense primer)
and AR (antisense primer), derived from the sequence of 300–319 and 836–855 in the Pst
I regions conserved in all three different RSIV isolates (Fig. 3). Although two of the
primers, NF and CR, will bind specifically only to the DNA templates of RSIV Namhae
and CH-1, respectively, the other two primers, AF and AR, will bind to the DNA templates
of all three different types of RSIVs during PCR. The binding sites of the primers in PCR
is illustrated in Fig. 4.
In a PCR assay with the AF/AR primer set, amplicons of the expected sizes (556, 832,
and 144 bp, respectively) were obtained from the DNA of all three types RSIVs, while
with the NF/AR set only RSIV Namhae showed an amplicon, and with the AF./CR primer
set, only RSIV CH-1 showed an amplicon (Fig. 5). However, PCR with the NF/CR primer
set with each DNA template of three different types of RSIVs did not produce any
amplicons (Fig. 5D). Thus, it was possible to apply these primers to develop the multiplex
PCR for both the diagnosis of the RSIV infection with discrimination of the types of
infected RSIVs in fish. As shown in Table 2, template DNA of RSIV Namhae, Sachun and
CH-1 will produce two amplicons of 832 and 556 bp, one amplicon of 556 bp, and two
amplicons of 553 and 144 bp, respectively in multiplex PCR with the combined four
primers (NF, AF, CR, and AR).
The results of multiplex PCR were analyzed by electrophoresis. We found the
resulting amplicons matched exactly the expected patterns and sizes of the different
templates of the isolated viral DNAs. Different concentrations of viral DNA or
inhibitors present in the infected tissues appear not to have interfered with the assay
because the same results were obtained after PCR with the plasmids containing the
target regions (Fig. 6). Additionally, when we used as templates the viral DNA isolated
from equivalent amounts of infected spleens, the density of the amplicon for RSIV

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.3 การเลือกปฏิบัติของ RSIVs แตกต่างกันโดย multiplex PCRดังแสดงในรูป 3, Pst ฉันส่วนข้อจำกัดของ RSIV CH 1 มีนิวคลีโอไทด์ 92.9%ลำดับการ homology กับนัม RSIV (หรือการอ้างอิงลำดับของฮิเมะ RSIV-1)อย่างไรก็ตาม เราพบสองตัวแปรสูงภูมิภาคกับการลบของสามอย่างต่อเนื่องนิวคลีโอไทด์ใน RSIV Sachun และ CH-1 ที่ตำแหน่ง 36 – 38 และ 432-434 ตามลำดับ สองไพรเมอร์ที่ถูกออกแบบโดยใช้ลำดับที่ของสองตัวแปรภูมิภาค 24 – 41 (รองพื้นรู้สึกNF) 425-446 (antisense ไพร CR) ในแฟ้ม Pst และผมส่วนข้อจำกัดของนัม RSIVและ CH-1 ตามลำดับ นอกจากนี้ ออกแบบไพรเมอร์อื่น ๆ สอง AF (รองพื้นรู้สึก)และ AR (antisense ไพร), มาจากลำดับของ 300 – 319 และ 836 – 855 ในแฟ้ม Pstผมภูมิภาคในทั้งสามแตกต่างกัน RSIV แยก (3 รูป) แม้ว่าที่สองของการไพรเมอร์ NF และ CR จะผูกพันเฉพาะกับแม่แบบดีเอ็นเอของนัม RSIV เท่านั้นและ CH-1 ตามลำดับ การอื่น ๆ สองไพรเมอร์ AF และ AR จะผูกกับดีเอ็นเอแม่แบบของทั้งหมดสามชนิด RSIVs ระหว่าง PCR เว็บไซต์รวมของไพรเมอร์ใน PCRแสดงในรูปที่ 4ในการทดสอบ PCR กับชุดรองพื้น AF/AR, amplicons ขนาดที่คาดไว้ (556, 832144 bp ตามลำดับ) ได้ในขณะที่ได้รับจากดีเอ็นเอของทั้งสามประเภท RSIVsด้วย NF/AR ตั้งเดียวนัม RSIV แสดงให้เห็นว่าการ amplicon และ AF. / CR สีรองพื้นการตั้งค่า เท่า RSIV CH-1 แสดงให้เห็นว่าการ amplicon (5 รูป) อย่างไรก็ตาม PCR กับไพรเมอร์ NF/CRชุด ด้วยแต่ละแม่แบบดีเอ็นเอของสามชนิด RSIVs ได้ผลิตใด ๆamplicons (รูป 5D) ดังนั้น มันเป็นไปได้ที่จะใช้ไพรเมอร์เหล่านี้จะพัฒนาการมัลติเพล็กซ์PCR สำหรับทั้งการวินิจฉัยการติดเชื้อ RSIV มีแบ่งแยกประเภทของRSIVs การติดเชื้อในปลา ดังแสดงในตารางที่ 2 แม่แบบดีเอ็นเอนัมแฮ RSIV, Sachun และCH 1 จะผลิต amplicons สองของ bp 832 และ 556, amplicon หนึ่งของ 556 bp และสองamplicons ของ 553 และ 144 bp ใน multiplex PCR กับสี่รวมตามลำดับไพรเมอร์ (NF, AF, CR และ AR)มีวิเคราะห์ผลลัพธ์ของ multiplex PCR โดยอิ เราพบการเกิด amplicons ตรงตรงรูปแบบและขนาดต่าง ๆแม่แบบของดีเอ็นเอไวรัสที่แยก ความเข้มข้นแตกต่างกันของไวรัสดีเอ็นเอ หรือสารยับยั้งอยู่ในเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อจะไม่ มีการแทรกแซง ด้วยการทดสอบเนื่องจากได้รับผลเดียวกันหลังจาก PCR ด้วย plasmids ที่ประกอบด้วยการเป้าหมายภูมิภาค (6 รูป) นอกจากนี้ เมื่อเราใช้เป็นแม่แบบแยกดีเอ็นเอไวรัสจากจำนวนเทียบเท่าติดเชื้อ spleens ความหนาแน่นของ amplicon สำหรับ RSIV

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.3 การเลือกปฏิบัติของ RSIVs ที่แตกต่างกันโดย multiplex PCR
ดังแสดงในรูป 3, Pst ฉันข้อ จำกัด ส่วนของ RSIV CH-1 มี 92.9% เบื่อหน่าย
ลำดับที่คล้ายคลึงกันกับ RSIV Namhae (หรือลำดับการอ้างอิงของ RSIV Ehime-1).
อย่างไรก็ตามเราพบว่าทั้งสองภูมิภาคตัวแปรอย่างมากกับการลบสามอย่างต่อเนื่อง
นิวคลีโอใน RSIV Sachun และ CH-1 ที่ตำแหน่ง 36-38 และ 432-434 ตามลำดับ สอง
ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ลำดับของสองภูมิภาคตัวแปร 24-41 (ความรู้สึกไพรเมอร์
อิท) และ 425-446 (แอนตี้ไพรเมอร์ซีอาร์) ในการ จำกัด ชิ้นส่วน Pst ฉัน RSIV Namhae
และ CH-1 ตามลำดับ นอกจากนี้อีกสองไพรเมอร์ได้รับการออกแบบ AF (ความรู้สึกไพรเมอร์)
และ AR (แอนตี้ไพรเมอร์) ที่ได้มาจากลำดับของ 300-319 และ 836-855 ในแปซิฟิกของ
ฉันภูมิภาคอนุรักษ์ในทั้งสามสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน RSIV (รูปที่. 3) แม้ว่าทั้งสองของ
ไพรเมอร์อิทและซีอาจะผูกพันเฉพาะเฉพาะกับแม่ดีเอ็นเอของ RSIV Namhae
และ CH-1 ตามลำดับอีกสองไพรเมอร์, AF และ AR จะผูกกับแม่แบบดีเอ็นเอ
ของทั้งสามประเภทที่แตกต่างกันของ RSIVs ในช่วง PCR เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันของไพรเมอร์ในวิธี PCR
จะแสดงในรูปที่ 4.
ในการทดสอบ PCR กับชุดไพรเมอร์ AF / AR, amplicons ของขนาดที่คาด (556, 832,
และ 144 bp ตามลำดับ) ที่ได้รับจากดีเอ็นเอของทั้งสามประเภท RSIVs ในขณะที่
มีอิท / AR ตั้งค่าได้เพียง RSIV Namhae แสดงความ amplicon และด้วยไพรเมอร์ AF./CR
ชุดเท่านั้น RSIV CH-1 แสดงให้เห็น amplicon (รูปที่. 5) อย่างไรก็ตาม PCR กับไพรเมอร์อิท / CR
ตั้งกับแต่ละแม่แบบดีเอ็นเอสามประเภทที่แตกต่างกันของ RSIVs ไม่ได้ผลิตใด ๆ
amplicons (รูป. 5D) ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่จะนำไปใช้ไพรเมอร์เหล่านี้เพื่อพัฒนา multiplex
PCR สำหรับทั้งการวินิจฉัยการติดเชื้อ RSIV กับการเลือกปฏิบัติของประเภทของ
RSIVs ติดเชื้อในปลา ดังแสดงในตารางที่ 2 ดีเอ็นเอแม่แบบของ RSIV Namhae, Sachun และ
CH-1 จะผลิตสอง amplicons ของ 832 และ 556 bp หนึ่ง amplicon 556 bp และสอง
amplicons 553 และ 144 bp ตามลำดับใน multiplex PCR กับรวมสี่
ไพรเมอร์ (NF, AF, CR และ AR).
ผลของการ multiplex PCR มาวิเคราะห์โดย electrophoresis เราพบ
amplicons ส่งผลให้เกิดการจับคู่ตรงรูปแบบที่คาดหวังและขนาดที่แตกต่างกันของ
แม่แบบของดีเอ็นเอของเชื้อไวรัสบางแห่ง ความเข้มข้นแตกต่างกันของสารพันธุกรรมของไวรัสหรือ
โปรตีนอยู่ในเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อไม่ปรากฏว่าจะมีการแทรกแซงด้วยการทดสอบ
เพราะผลลัพธ์ที่เหมือนกันที่ได้รับหลังจาก PCR ที่มีพลาสมิดที่มี
ภูมิภาคเป้าหมาย (รูปที่. 6) นอกจากนี้เมื่อเราใช้เป็นแม่แบบสารพันธุกรรมของไวรัสที่แยกได้
จากปริมาณเทียบเท่าของม้ามติดเชื้อความหนาแน่นของ amplicon สำหรับ RSIV