Development and Practical Use of RT

Development and Practical Use of RT-PCR for Seed-transmitted Prune dwarf virus in Quarantine.
Abstract
With the recent trade liberalization, various plants have been imported into Korea, and accordingly, the possibility of the introduction of plant pathogens that are not distributed in Korea has increased (Lee et al., 2013a). Among imported plants, seeds are the items that have many latent pathogens and are difficult to inspect (Min, 2009). Also, the domestic import and export of seeds are expected to increase depending on the global market expansion in the future (Shin, 2009). If seed-transmitted pathogens are introduced into Korea, they could extensively infect healthy plants during the distribution and cultivation processes, and bring about tremendous economic loss (Lee et al., 2013a). The biggest problem with seeds is viruses. In Korea, viruses with high quarantine risk are managed by classifying them into ‘prohibited,’ ‘controlled,’ ‘regulated non-quarantine,’ ‘non-quarantine’ and ‘provisionally regulated,’ based on risk assessment (www.qia.go.kr). PDV is a plant pathogenic virus that belongs to Bromoviridae Ilarvirus. In Korea, it is designated as ‘controlled’ and inspected in Prunus cerasifera, P. persica, P. armeniaca, P. mandshurica, P. avium or P. serotina seeds (including P. cerasus seeds), which are imported into the country (Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, 2013).
For a long time, the inspection of plant quarantine viruses has been performed using enzyme-linked immunosorbent assay (Stein, 1979), but this method has the disadvantages of false positive reaction and low sensitivity (Caruso et al., 2003; Priou et al., 2006). Therefore, RT-PCR methods and nested PCR methods, which are simpler and highly sensitive, have recently been studied and established in Korea (Kim et al., 2000; Lee et al., 2011a; Lee et al., 2011b; Park and Kim, 2004). In other countries, the genome variability (Fonseca et al., 2005) and coat protein expression (Raquel et al., 2008) of PDV during the infection of crops were studied; and for the diagnosis field, the duplex RT-PCR method, including the detection of PDV (Massart et al., 2008), and the multiplex one-step RT-PCR method for eight stone fruit viruses (Peiró et al., 2011) were studied. In Korea, considering the particularity of seed samples, studies using the RT-PCR and nested PCR inspection methods, which have high detection sensitivity, have been conducted, along with the use of a single condition inspection system that meets the demands of quarantine sites, inspection method dualization, alternative primer securement, and the development of a genetically modified-positive control (Lee et al., 2013a; Lee et al., 2013b; Lee et al., 2013c). However, a PDV detection method that meets the demands of domestic quarantine sites has yet to be reported. Therefore, in this study, RT-PCR, nested PCR, and a genetically modified-positive control, which meet the inspection conditions of the domestic quarantine sites of quarantine seed-transmitted PDV, were developed, and the results of the inspection, which had been performed from 2007 to 2013 using the PCR module developed in this study, were reported.
As for the PDV, which is the target for the development of the RT-PCR and nested PCR inspection methods, the leaf tissue of infected plums was imported from England (ADGEN, England) through the approval of prohibited goods import by the Animal and Plant Quarantine Agency. The cDNAs of the Alfalfa mosaic virus (AMV), Tobacco streak virus (TSV), Cucumber mosaic virus (CMV), Arabis mosaic virus(ArMV), Cherry leaf roll virus (CLRV) and Tomato ringspot virus (ToRSV), which were used in this experiment, were purchased from domestic enterprises (Bione, Korea and Plutos, Korea), and all the samples were stored in a deep freezer at −70°C.
For the PDV primer design, from the National Center for Biotechnology Information, 36 kinds of isolates, including PDV RNA-3 (NC_008038) (about 2.13 kb), and 13 kinds of Ilarvirus, including the Apple mosaic virus RNA-3 (NC_0035480), were used (Supplementary Table 1). The obtained sequences of the viruses were aligned using BioEdit (Hall, 1999), and PDV species-specific sequences were searched at the 51–59°C annealing condition using DNAMAN software package version 6.0 (Pan et al., 2000; Lee et al., 2013c). The searched primers were 21 forward primers and 11 reverse primers (total of 33 primers), which were 18–24 nt, respectively (Supplementary Table 2). Using these primers, 167 primer sets that are capable of PCR amplification were combined (Supplementary Table 3).
The RNA extraction from the samples, RT-PCR and nested PCR were carried out using the same methods as those described in previous papers (Lee et al., 2013a; Lee et al., 2013b; Lee et al., 2013c). After the reaction was completed, the electrophoresis of the PCR products was performed for 100 minutes using 1.2% agarose gel (150 ml) by adding 4 μl of TopRed nucleic acid gel stain (Biopure, United Kingdom). Then it was observed under UV light.
In the first selection, one-step RT-PCR for the primer sets of 167 combinations was performed using the total RNA, including the PDV (i.e., the target virus) as the template. Among these, 30 sets (sets 6, 7, 10, 27, 28, 32, 48, 49, 69, 86, 100, 101, 142 and 164) were selected, which had high reaction intensity and did not show a non-specific reaction (non-specific reaction sets 1, 2, 3, 4, 8, 9, 14, 24, 25, 26, 30, 43, 44, 66, 79, 96, 110, 138, 139, 140, 141, 154 and 155) that interfered with the diagnosis (Fig. 1). In the second selection, the non-specificity to AMV, TSV and CMV, which belong to Bromoviridae, was examined for the selected 30 primer sets. The 17 primer sets, which formed bands for the three kinds of viruses (AMV, TSV and CMV), were excluded, and sets 7, 10, 27, 28, 32, 48, 49, 69, 86, 100, 101, 142 and 164 (total of 13 sets) were selected (Fig. 2). In the third selection, the non-specificity to the three kinds of viruses (ArMV, CLRV and ToRSV), which can infect a host that can be infected with PDV, was examined. Among the 13 primer sets, only two primer set (sets 7 and 27), which did not form non-specific bands, were selected (Fig. 3). Thus, primer set 7 (PDV_F20/C10 and 739 nt) and primer set 27 (PDV_F10/C20 and 673 nt), which can specifically detect PDV, were finally selected (Table 1). Nested PCR primers, which can again amplify the product of the selected primer sets, were also selected. The selected primers were PDV_F60/PDV_C80, and the end-product was 305 bp (data not shown).

Fig. 1.
First selection of species-specific primers for the PDV detection.

Fig. 2.
Second selection of species-specific primers for the PDV detection.

Fig. 3.
Third selection of species-specific primers for the PDV detection.

Table 1.
Selected primer sets for RT-PCR and nested PCR of PDV
PDV is a ‘controlled’ quarantine virus, and is not distributed in Korea. Accordingly, there were difficulties in using a sample as a control, and thus, the control was produced using a plasmid. Using the pGEM®-T easy vector (Promega, USA), the cloning was performed using the PCR amplification product, which includes all the selected RT-PCR primer sets, as the insert DNA. Using a site-directed mutagenesis kit (Nelson and McClelland, 1992), CTCGAG, which is the sequence with which the restriction enzyme XhoI can react, was inserted into 305 nt, which is the nested PCR amplification product (Supplementary Fig. S1). If the nested PCR product is cut into two bands with the reaction with the restriction enzyme XhoI (Supplementary Fig. S2) or if the inserted six nucleotides are found during the sequencing, it would be judged that the product has been contaminated from the genetically modified-positive control developed in this study.
Using the PCR module (RT-PCR, nested PCR and modified-positive control plasmid) developed in this study, PDV was inspected in Prunus cerasifera, P. persica, P. armeniaca, P. mandshurica, P. cerasus andP. avium and P. serotina seeds, which were imported into Korea from 2007 to September 2013. According to the Disease and Insect Pest Information System (http://10.110.128.100), which is the intranet system of the Animal and Plant Quarantine Agency, PDV has been detected in a total of 18 cases since 2007, in the quarantine inspection for PDV over all the import routes, which included those for cargo (air, ship, railroad and land), mail and carry-on baggage. PDV was detected in Prunus persica seeds (13 cases), P. armeniacaseeds (two cases), P. cerasus seeds (one case), P. avium or P. serotina seeds (one case), and Prunus mandshurica seeds (one case). PDV was detected most frequently in 2009 (12 out of 18 cases).
The RT-PCR and nested PCR inspection methods and the genetically modified-positive control of the plant quarantine seed-transmitted PDV that was developed in this study will be continuously used for plant quarantine in a prompt and accurate manner, and are expected to contribute to the plant quarantine in the future.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

พัฒนาและปฏิบัติใช้ของ RT-PCR สำหรับไวรัสแคระส่งเมล็ดบ๊วยในตรวจสอบบทคัดย่อมีการเปิดเสรีทางการค้าล่าสุด พืชต่าง ๆ มีการนำเข้าในเกาหลี และตามลำดับ เป็นไปได้ของการแนะนำของโรคพืชที่ไม่กระจายในเกาหลีได้เพิ่มขึ้น (Lee et al., 2013a) ผู้นำเข้าพืช เมล็ดพืชเป็นสินค้าที่มีโรคแฝงอยู่มาก และยากต่อการตรวจสอบ (นาที 2009) ยัง การนำเข้าภายในประเทศและส่งออกเมล็ดพันธุ์คาดว่าจะเพิ่มขึ้นในตลาดโลกขยายตัวในอนาคต (ชิน 2009) ส่งเมล็ดโรคจะนำเข้าเกาหลี พวกเขาสามารถอย่างกว้างขวางติดเชื้อสุขภาพพืชในระหว่างกระบวนการจัดจำหน่ายและเพาะปลูก แล้วนำมาเกี่ยวกับการสูญเสียทางเศรษฐกิจมหาศาล (Lee et al., 2013a) ปัญหาที่ใหญ่ที่สุดของเมล็ดพันธุ์เป็นไวรัส เกาหลี จัดการไวรัส ด้วยเฉพาะที่สูงความเสี่ยงโดยจัดประเภทเป็นการ 'ห้าม 'ควบคุม 'ควบคุมไม่ตรวจสอบ 'ไม่เฉพาะ' และ 'สู่ควบคุม ตามการประเมินความเสี่ยง (ส่วน www.qia.go.kr) PDV เป็นไวรัส pathogenic พืชที่ Bromoviridae Ilarvirus เกาหลี มันถูกกำหนดให้เป็น 'ควบคุม' และตรวจสอบใน cerasifera นาง P. persica, P. armeniaca, P. mandshurica, P. avium หรือ (รวม P. cerasus เมล็ด) เมล็ด P. serotina ซึ่งนำเข้าในประเทศ (สัตว์ พืช และตรวจสอบ สินค้าประมง และหน่วย งานตรวจสอบ 2013)เป็นเวลานาน การตรวจสอบไวรัสตรวจสอบโรงงานมีการใช้เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay (สไตน์ 1979), แต่วิธีนี้มีข้อเสียของปฏิกิริยาบวกเท็จและความไวต่ำ (คารุสโซ่และ al., 2003 Priou และ al., 2006) ดังนั้น วิธี RT-PCR และซ้อน PCR วิธี ซึ่งจะง่ายกว่า และมีความไวสูง ได้เพิ่งศึกษา และก่อตั้งขึ้นในประเทศเกาหลี (Kim et al., 2000 ลีเอส al., 2011a ลีเอส al., 2011b และคิม 2004) ในประเทศ สำหรับความผันผวนจีโนม (Fonseca et al., 2005) และตราโปรตีนนิพจน์ (Raquel et al., 2008) อื่น ๆ ของ PDV ในระหว่างการติดเชื้อของพืชที่ศึกษา และได้ศึกษาวิธี RT-PCR หน้า รวมถึงการตรวจพบ PDV (Massart et al., 2008), และวิธี RT-PCR ขั้นตอนเดียว multiplex แปดผลไม้หินไวรัส (Peiró et al., 2011) สำหรับฟิลด์การวินิจฉัย ในเกาหลี particularity ตัวอย่างเมล็ด พิจารณาศึกษาใช้ RT-PCR และซ้อน PCR ตรวจสอบวิธีการ ซึ่งมีความไวในการตรวจสูง ได้ดำเนิน พร้อมกับการใช้ระบบการตรวจสอบเงื่อนไขเดียวที่ตรงกับความต้องการของไซต์เฉพาะ dualization วิธีตรวจสอบ securement รองพื้นอื่น และการพัฒนาของตัวควบคุมแปลงพันธุกรรมแก้ไขบวก (Lee et al., 2013a ลีเอส al., 2013b ลีเอส al., 2013 c) อย่างไรก็ตาม วิธีตรวจ PDV ที่ตรงกับความต้องการของเว็บไซต์ตรวจสอบสินค้าภายในประเทศยังไม่ได้รายงานการ ดังนั้น ในการศึกษานี้ RT-PCR, PCR ซ้อน และควบคุมแปลงพันธุกรรมแก้ไขบวก ซึ่งตรงกับเงื่อนไขการตรวจสอบไซต์เฉพาะภายในประเทศของการตรวจสอบเมล็ดส่ง PDV ถูก พัฒนา และมีรายงานผลการตรวจสอบ ซึ่งมีการดำเนินการจาก 2007 โม PCR ที่พัฒนาในการศึกษานี้ใช้ 2013สำหรับ PDV ซึ่งเป็นเป้าหมายในการพัฒนาของ RT-PCR และวิธีการตรวจ PCR ซ้อน เนื้อเยื่อใบของพลัมที่ติดไวรัสถูกนำเข้าจากอังกฤษ (ADGEN อังกฤษ) ผ่านการอนุมัติการนำเข้าสินค้าต้องห้ามสัตว์และหน่วยงานตรวจสอบโรงงาน CDNAs ไวรัสโมเสก Alfalfa (AMV), ไวรัสอับยาสูบ (TSV), แตงกวาไวรัส (CMV) Arabis กระเบื้องโมเสค virus(ArMV) เชอร์รี่ใบม้วนราคาไวรัส (CLRV) มะเขือเทศ ringspot ไวรัส (ToRSV), ซึ่งถูกใช้ในการทดลองนี้ ซื้อจากองค์กรภายในประเทศ (เกาหลี Bione และ Plutos เกาหลี), และตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ในตู้ลึกที่ −70 องศาเซลเซียสสำหรับการออกแบบพื้น PDV แห่งชาติศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ 36 ชนิดแยก รวม PDV อาร์เอ็นเอ-3 (NC_008038) (ประมาณ 2.13 kb), และ Ilarvirus ไวรัสโมเสกแอปเปิ้ลเป็นอาร์เอ็นเอ-3 (NC_0035480), รวมทั้ง 13 ชนิดถูกใช้ (เสริมตารางที่ 1) ลำดับที่ได้รับไวรัสถูกจัดตำแหน่งใช้ BioEdit (ฮอลล์ 1999), และลำดับ species-specific PDV ถูกค้นที่เงื่อนไขหลอม 51-59° C โดยใช้ซอฟต์แวร์แพคเกจรุ่น 6.0 (Pan และ al., 2000; DNAMAN ลีเอส al., 2013 c) ไพรเมอร์ค้นหามีไพรเมอร์ไปข้างหน้า 21 และ 11 กลับไพรเมอร์ (จำนวนไพรเมอร์ 33), ซึ่งมี 18 – 24 nt ตามลำดับ (เสริมตารางที่ 2) ใช้ไพรเมอร์เหล่านี้ 167 ชุดรองพื้นที่มีความสามารถในการขยาย PCR ได้รวม (เสริมตาราง 3)แยกอาร์เอ็นเอจากตัวอย่าง RT-PCR และ PCR ซ้อนได้ดำเนินการโดยใช้วิธีเดียวกันตามที่อธิบายไว้ในเอกสารก่อนหน้า (Lee et al., 2013a ลีเอส al., 2013b ลีเอส al., 2013 c) หลังจากปฏิกิริยาเสร็จสิ้น electrophoresis ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ดำเนินการ 100 นาทีใช้ 1.2% agarose เจล (150 มล.) โดยการเพิ่ม μl 4 ของ TopRed เอ็นเจคราบ (Biopure สหราชอาณาจักร) แล้ว มันถูกพบภายใต้แสง UVในตัวเลือกแรก RT-PCR สำหรับชุดรองพื้นชุด 167 ขั้นตอนเดียวที่ดำเนินการใช้อาร์เอ็นเอรวม PDV (เช่น ไวรัสเป้าหมาย) รวมทั้งเป็นแบบ ในหมู่เหล่านี้ 30 ชุด (ชุด 6, 7, 10, 27, 28, 32, 48, 49, 69, 86, 100, 101, 142 และ 164) ถูกเลือก ซึ่งมีความเข้มสูงปฏิกิริยา และไม่ไม่ดูตัวไม่ใช่เฉพาะปฏิกิริยา (ปฏิกิริยาไม่ใช่เฉพาะชุด 1, 2, 3, 4, 8, 9, 14, 24, 25, 26, 30, 43, 44, 66, 79, 96, 110, 138, 139, 140, 141, 154 และ 155 ที่ยุ่งวินิจฉัย (Fig. 1) ในตัวเลือกที่สอง ที่ไม่ใช่-specificity AMV, TSV และ CMV ที่อยู่ Bromoviridae ถูกตรวจสอบสำหรับชุดเลือกสีรองพื้น 30 ชุดรองพื้น 17 ซึ่งมีแยกวงดนตรีรูปแบบสำหรับชนิดของไวรัส (AMV, TSV และ CMV), สาม และเลือกชุดที่ 7, 10, 27, 28, 32, 48, 49, 69, 86, 100, 101, 142 และ 164 (จำนวน 13 ชุด) (Fig. 2) ที่ไม่ใช่-specificity การสามชนิดของไวรัส (ArMV, CLRV และ ToRSV), ซึ่งสามารถติดเชื้อโฮสต์ที่สามารถติดเชื้อ PDV ถูกตรวจสอบในตัวเลือกที่สาม ระหว่างชุด 13 รองพื้น รองพื้นสองชุด (ชุด 7 และ 27), ซึ่งไม่ได้เจาะจงวง ถูกเลือก (Fig. 3) , 7 (nt PDV_F20/C10 และ 739) ตั้งพื้น และรองพื้นตั้ง 27 (PDV_F10/C20 และ 673 nt), ซึ่งสามารถตรวจสอบได้โดยเฉพาะ PDV ถูกสุดท้ายเลือก (ตารางที่ 1) ยังได้เลือกซ้อน PCR ไพรเมอร์ ซึ่งอีกครั้งสามารถขยายผลิตภัณฑ์ชุดรองพื้นเลือก ไพรเมอร์เลือกได้ PDV_F60/PDV_C80 และผลิตภัณฑ์สุดท้ายได้ 305 bp (ข้อมูลไม่แสดง) Fig. 1ตัวเลือกแรกของไพรเมอร์ species-specific ตรวจ PDV Fig. 2ตัวเลือกที่สองของไพรเมอร์ species-specific ตรวจ PDV Fig. 3ตัวเลือกที่สามของไพรเมอร์ species-specific ตรวจ PDV ตารางที่ 1เลือกชุดสีรองพื้นสำหรับ RT-PCR และ PCR ซ้อน PDVPDV ไวรัสเฉพาะ 'ควบคุม' และไม่กระจายในเกาหลี ดังนั้น มีความยากลำบากในการใช้ตัวอย่างเป็นตัวควบคุม และดังนั้น การที่ตัวควบคุมถูกผลิตใช้ plasmid เป็น โดยใช้เวกเตอร์ง่ายของ pGEM ®-T (Promega สหรัฐอเมริกา), การโคลนที่ดำเนินการโดยใช้ PCR ขยายผลิตภัณฑ์ ซึ่งรวมชุดทั้งหมดที่เลือก RT-PCR พื้น ดีเอ็นเอแทรก ใช้ชุด mutagenesis ไซต์โดยตรง (เนลสันและ McClelland, 1992), CTCGAG ซึ่งเป็นลำดับที่เอนไซม์จำกัด XhoI สามารถตอบสนอง ถูกแทรกลงใน 305 nt ซึ่งซ้อน PCR ขยายผลิตภัณฑ์ (ฟิกเสริม S1) ถ้าผลิตภัณฑ์ PCR ซ้อนถูกตัดเป็นสองวงกับปฏิกิริยากับเอนไซม์จำกัด XhoI (ฟิกเสริม S2) หรือถ้าพบนิวคลีโอไทด์ที่แทรกหกระหว่างลำดับที่ มันจะตัดสินว่า ผลิตภัณฑ์มีการปนเปื้อนจากการควบคุมการแปลงพันธุกรรมแก้ไขบวกที่พัฒนาในการศึกษานี้ใช้ PCR โม (RT-PCR, PCR ซ้อน และควบคุมบวกปรับเปลี่ยน plasmid) พัฒนาในการศึกษานี้ PDV ถูกตรวจในนาง cerasifera, P. persica, P. armeniaca, P. mandshurica, P. cerasus andP avium และเมล็ดพืช P. serotina ซึ่งถูกนำเข้าสู่เกาหลีจาก 2007 ไป 2013 กันยายน ตามโรคและแมลงศัตรูพืชระบบสารสนเทศ (http://10.110.128.100), ซึ่งเป็นระบบอินทราเน็ตของสัตว์และหน่วยงานตรวจสอบโรงงาน PDV พบทั้งหมด 18 กรณี 2550 ในการตรวจสอบเฉพาะสำหรับ PDV ผ่านการนำเข้าเส้นทางทั้งหมด ซึ่งรวมผู้สำหรับขนส่งสินค้า (อากาศ เรือ รถไฟ และที่ดิน), จดหมายและหิ้วกระเป๋าเดินทาง PDV พบนาง persica เมล็ด (13 คดี), P. armeniacaseeds (2 กรณี), P. cerasus เมล็ด (กรณีเดียว), P. avium หรือ P. serotina เมล็ดพืช (กรณีที่หนึ่ง), และนาง mandshurica เมล็ดพืช (กรณีเดียว) PDV พบบ่อยที่สุดในปี 2552 (กรณี 12 จาก 18)RT-PCR และวิธีตรวจ PCR ซ้อน และควบคุมแปลงพันธุกรรมแก้ไขบวกของการตรวจสอบสินค้าพืช PDV ส่งเมล็ดที่ได้รับการพัฒนาในการศึกษานี้จะต่อเนื่องใช้สำหรับตรวจสอบโรงงานอย่างรวดเร็ว และถูกต้อง และคาดว่าจะนำไปสู่การตรวจสอบโรงงานในอนาคต

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การพัฒนาและการใช้ในทางปฏิบัติของ RT-PCR สำหรับเมล็ดพันธุ์ส่งไวรัสแคระพรุนในกักกัน. บทคัดย่อด้วยการเปิดเสรีการค้าที่ผ่านมาพืชต่างๆได้รับนำเข้ามาในประเทศเกาหลีและตามความเป็นไปได้ของการแนะนำของเชื้อโรคพืชที่ไม่ได้จัดจำหน่ายในประเทศเกาหลีได้เพิ่มขึ้น (Lee et al., 2013a) ในบรรดาพืชที่นำเข้าเมล็ดเป็นรายการที่มีเชื้อโรคแฝงจำนวนมากและเป็นเรื่องยากที่จะตรวจสอบ (ต่ำสุด 2009) นอกจากนี้การนำเข้าประเทศและส่งออกของเมล็ดที่คาดว่าจะเพิ่มขึ้นอยู่กับการขยายตัวของตลาดโลกในอนาคต (ชิน 2009) ถ้าเชื้อโรคเมล็ดส่งจะนำเข้าสู่ประเทศเกาหลีที่พวกเขาอาจจะติดเชื้ออย่างกว้างขวางพืชที่มีสุขภาพในระหว่างกระบวนการการจัดจำหน่ายและการเพาะปลูกและนำมาซึ่งความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างมาก (Lee et al., 2013a) ปัญหาที่ใหญ่ที่สุดที่มีเมล็ดเป็นไวรัส ในประเทศเกาหลีไวรัสที่มีความเสี่ยงสูงกักกันมีการจัดการโดยจำแนกให้เป็น 'ห้าม' 'ควบคุม' 'การควบคุมที่ไม่ได้กักกัน' 'ที่ไม่ได้กักกัน' และ 'การควบคุมชั่วคราว' ขึ้นอยู่กับการประเมินความเสี่ยง (www.qia.go .kr) PDV เป็นพืชไวรัสที่ทำให้เกิดโรคที่เป็น Bromoviridae Ilarvirus ในประเทศเกาหลีมันถูกกำหนดให้เป็น 'การควบคุมและการตรวจสอบใน Prunus cerasifera พี persica พี armeniaca พี mandshurica พี avium หรือเมล็ดพี serotina (รวมทั้งเมล็ด cerasus พี) ซึ่งจะนำเข้ามาในประเทศ (สัตว์, พืชและประมงกักกันและหน่วยงานตรวจสอบ 2013). เป็นเวลานาน, การตรวจสอบของไวรัสพืชกักกันที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (สไตน์, 1979) แต่วิธีนี้มีข้อเสียของการเกิดปฏิกิริยาบวกเท็จ และความไวต่ำ (คารูโซ et al, 2003;.. Priou et al, 2006) ดังนั้นวิธี RT-PCR และวิธี PCR ที่ซ้อนกันซึ่งเป็นที่เรียบง่ายและมีความสำคัญอย่างมากเมื่อเร็ว ๆ นี้ได้รับการศึกษาและเป็นที่ยอมรับในเกาหลี (คิม et al, 2000;.. ลี, et al, 2011a; ลี, et al, 2011b. Park และ คิม, 2004) (. Fonseca et al, 2005) ในประเทศอื่น ๆ แปรปรวนจีโนมและการแสดงออกของโปรตีนเสื้อ (. Raquel et al, 2008) ของ PDV ระหว่างการติดเชื้อของพืชมีการศึกษา; และสำหรับเขตข้อมูลการวินิจฉัยเพล็กซ์วิธี RT-PCR ซึ่งรวมถึงการตรวจสอบของ PDV นี้ (Massart et al., 2008) และวิธีการหลายขั้นตอนเดียว RT-PCR เพื่อหาไวรัสผลไม้หินแปด (Peiró et al., 2011) การศึกษา ในประเทศเกาหลีเมื่อพิจารณาเป็นพิเศษตัวอย่างเมล็ดพันธุ์การศึกษาโดยใช้ RT-PCR และซ้อนกันวิธีการตรวจสอบวิธี PCR ซึ่งมีความไวต่อการตรวจจับสูงได้รับการดำเนินการพร้อมกับการใช้งานของระบบการตรวจสอบสภาพเดียวที่ตรงกับความต้องการของสถานที่กักกัน, วิธีการตรวจสอบ dualization ไพรเมอร์ทางเลือกที่ยึดและการพัฒนาของการควบคุมการดัดแปลงทางพันธุกรรมบวก (Lee et al,, 2013a.. ลี, et al, 2013b. ลี, et al, 2013c) อย่างไรก็ตามวิธีการตรวจสอบ PDV ที่ตรงกับความต้องการของสถานที่กักกันในประเทศยังไม่ได้รับรายงาน ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้ RT-PCR ซ้อนกัน PCR และการควบคุมการดัดแปลงทางพันธุกรรมบวกซึ่งตามเงื่อนไขการตรวจสอบในสถานที่กักกันในประเทศส่งเมล็ดกักกัน PDV, ได้รับการพัฒนาและผลของการตรวจสอบที่มี รับการดำเนินการ 2007-2013 โดยใช้โมดูล PCR การพัฒนาในการศึกษาครั้งนี้ได้รับรายงาน. สำหรับ PDV ซึ่งเป็นเป้าหมายในการพัฒนา RT-PCR และวิธีการที่ซ้อนกันตรวจสอบ PCR ที่เนื้อเยื่อใบของพลัมที่ติดเชื้อถูกนำเข้ามาจาก อังกฤษ (ADGEN อังกฤษ) ผ่านความเห็นชอบของสินค้าที่ต้องห้ามนำเข้าจากสัตว์และพืชหน่วยงานกักกัน cDNAs ของไวรัสโมเสค Alfalfa (AMV) ไวรัสแนวยาสูบ (TSV) ไวรัสแตงกวา (CMV) ไวรัส Arabis (ArMV) ไวรัสใบม้วนเชอร์รี่ (CLRV) และมะเขือเทศไวรัสใบด่างจุดวงแหวน (ToRSV) ซึ่งถูกนำมาใช้ ในการทดลองนี้ถูกซื้อมาจากองค์กรในประเทศ (Bione เกาหลีและ Plutos เกาหลี) และกลุ่มตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ในช่องแช่แข็งลึกที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียส. สำหรับการออกแบบไพรเมอร์ PDV จากศูนย์แห่งชาติสำหรับข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ 36 ชนิดของเชื้อรวมทั้ง PDV RNA-3 (NC_008038) (ประมาณ 2.13 กิโลไบต์) และ 13 ชนิดของ Ilarvirus รวมทั้งแอปเปิ้ลไวรัส RNA-3 (NC_0035480) ถูกนำมาใช้ (เสริมตารางที่ 1) ลำดับที่ได้รับของไวรัสถูกจัดชิดโดยใช้ BioEdit (ฮอลล์ 1999) และลำดับ PDV สายพันธุ์เฉพาะถูกค้นที่ 51-59 ° C สภาพหลอมใช้แพคเกจซอฟต์แวร์ DNAMAN รุ่น 6.0 (แพน et al, 2000;. ลี et al, . 2013c) ไพรเมอร์สืบค้น 21 ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์ 11 (ทั้งหมด 33 ไพรเมอร์) ซึ่งเป็นเอ็นที 18-24 ตามลำดับ (ตารางที่ 2 ประกอบ) การใช้ไพรเมอร์เหล่านี้ 167 ไพรเมอร์ชุดที่มีความสามารถในการขยาย PCR มารวมกัน (เสริมตารางที่ 3). การสกัด RNA จากตัวอย่างที่ RT-PCR และ PCR ที่ซ้อนกันได้ดำเนินการโดยใช้วิธีการเดียวกับที่อธิบายไว้ในเอกสารก่อนหน้า (ลีเอต อัล, 2013a.. ลี, et al, 2013b. ลี, et al, 2013c) หลังจากเกิดปฏิกิริยาเสร็จ electrophoresis ผลิตภัณฑ์ PCR ได้ดำเนินการ 100 นาทีโดยใช้ 1.2% agarose เจล (150 มล.) โดยการเพิ่ม 4 ไมโครลิตรของกรดนิวคลี TopRed คราบเจล (Biopure สหราชอาณาจักร) จากนั้นก็จะพบว่าภายใต้แสงยูวี. ในการเลือกครั้งแรกขั้นตอนเดียว RT-PCR สำหรับชุดไพรเมอร์ 167 ชุดที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้อาร์เอ็นเอทั้งหมดรวมทั้ง PDV (เช่นไวรัสเป้าหมาย) เป็นแม่แบบ ในจำนวนนี้ 30 ชุด (ชุด 6, 7, 10, 27, 28, 32, 48, 49, 69, 86, 100, 101, 142 และ 164) ได้รับการคัดเลือกที่มีความเข้มสูงปฏิกิริยาและไม่ได้แสดงความไม่ ปฏิกิริยาเฉพาะ (ปฏิกิริยาที่ไม่เฉพาะเจาะจง 1 ชุด, 2, 3, 4, 8, 9, 14, 24, 25, 26, 30, 43, 44, 66, 79, 96, 110, 138, 139, 140, 141, 154 และ 155) ที่แทรกแซงการวินิจฉัย (รูปที่ 1). ในการเลือกที่สองที่ไม่ได้เฉพาะเจาะจงเพื่อ AMV, TSV และ CMV ซึ่งเป็น Bromoviridae ได้รับการตรวจสอบสำหรับ 30 ชุดไพรเมอร์ที่เลือก 17 ชุดไพรเมอร์ซึ่งเป็นวงดนตรีที่ทั้งสามชนิดของไวรัส (AMV, TSV และ CMV) ได้รับการยกเว้นและชุด 7, 10, 27, 28, 32, 48, 49, 69, 86, 100, 101, 142 และ 164 (รวมเป็น 13 ชุด) ได้รับการคัดเลือก (รูปที่. 2) ในการเลือกที่สามที่ไม่เฉพาะเจาะจงกับสามชนิดของไวรัส (ArMV, CLRV และ ToRSV) ซึ่งสามารถติดเชื้อโฮสต์ที่สามารถติดเชื้อ PDV ได้รับการตรวจสอบ ในบรรดา 13 ชุดไพรเมอร์เพียงสองชุดไพรเมอร์ (7 ชุดและ 27) ซึ่งไม่ได้รูปแบบวงดนตรีที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้รับการคัดเลือก (รูปที่. 3) ดังนั้นไพรเมอร์ตั้ง 7 (PDV_F20 / C10 และ 739 เอ็นที) และไพรเมอร์ตั้ง 27 (PDV_F10 / C20 และ 673 เอ็นที) ซึ่งสามารถตรวจสอบได้โดยเฉพาะ PDV ได้รับการคัดเลือกในที่สุด (ตารางที่ 1) ไพรเมอร์ PCR ที่ซ้อนกันอีกครั้งซึ่งสามารถขยายผลิตภัณฑ์ชุดไพรเมอร์ที่เลือกที่ถูกเลือก ไพรเมอร์ที่เลือกได้ PDV_F60 / PDV_C80 และสิ้นผลิตภัณฑ์เป็น 305 bp (ไม่ได้แสดงข้อมูล). รูป 1. เลือกแรกของไพรเมอร์สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการตรวจสอบ PDV. รูป 2. เลือกที่สองของไพรเมอร์สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการตรวจสอบ PDV. รูป 3. เลือกที่สามของไพรเมอร์สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการตรวจสอบ PDV. ตารางที่ 1 เลือกชุดไพรเมอร์สำหรับ RT-PCR และ PCR ที่ซ้อนกันของ PDV PDV คือ 'ควบคุม' ไวรัสกักกันและไม่กระจายในเกาหลี ดังนั้นมีความยากลำบากในการใช้ตัวอย่างเป็นตัวควบคุมและทำให้ควบคุมได้รับการผลิตโดยใช้พลาสมิด ใช้pGEM®-T ง่ายเวกเตอร์ (Promega, USA) โคลนได้ดำเนินการในการใช้ผลิตภัณฑ์ขยาย PCR ซึ่งรวมถึงทุกคนที่เลือกชุดไพรเมอร์ RT-PCR เป็นดีเอ็นเอแทรก โดยใช้ชุดฉับเว็บไซต์กำกับ (เนลสันและแมคคลีแลนด์ 1992) CTCGAG ซึ่งเป็นลำดับที่มีเอนไซม์ซึ่งข้อ จำกัด XhoI สามารถตอบสนองถูกใส่เข้าไปในเอ็นที 305 ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ที่ขยาย PCR ที่ซ้อนกัน (เสริมรูป. S1) หากผลิตภัณฑ์ PCR ซ้อนที่ถูกตัดออกเป็นสองวงดนตรีที่มีปฏิกิริยากับเอนไซม์ข้อ จำกัด XhoI (เสริมรูป. S2) หรือหากนิวคลีโอหกใส่ที่พบในระหว่างการจัดลำดับก็จะได้รับการตัดสินว่าผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการปนเปื้อนจากการดัดแปลงทางพันธุกรรม บวกการควบคุมการพัฒนาในการศึกษาครั้งนี้. ใช้โมดูล PCR (RT-PCR, พลาสมิดที่ซ้อนกัน PCR และการควบคุมการปรับเปลี่ยนบวก) การพัฒนาในการศึกษาครั้งนี้ได้รับการตรวจสอบ PDV ใน Prunus cerasifera พี persica พี armeniaca พี mandshurica, พี cerasus ANDP avium พีเมล็ด serotina ซึ่งถูกนำเข้ามาจากเกาหลี 2007 ถึงเดือนกันยายน 2013 ตามที่โรคและแมลงศัตรูพืชระบบสารสนเทศ (http://10.110.128.100) ซึ่งเป็นระบบอินทราเน็ตของสัตว์และพืชกักกันหน่วยงานที่ PDV ได้รับการตรวจพบในทั้งหมด 18 กรณีตั้งแต่ปี 2007 ในการตรวจสอบกักกันโรคสำหรับ PDV เหนือทุกเส้นทางที่นำเข้าซึ่งรวมถึงผู้ที่อยู่สำหรับการขนส่งสินค้า (อากาศเรือรถไฟและที่ดิน) mail และดำเนินการเกี่ยวกับสัมภาระ PDV ถูกตรวจพบใน Prunus persica เมล็ด (13 ราย) พี armeniacaseeds (สองราย) พีเมล็ด cerasus (กรณีหนึ่ง), พีพี avium หรือเมล็ด serotina (กรณีหนึ่ง) และ Prunus เมล็ด mandshurica (กรณีหนึ่ง) . PDV พบบ่อยที่สุดในปี 2009 (12 จาก 18 ราย). RT-PCR และซ้อนกันวิธีการตรวจสอบวิธี PCR และการควบคุมการดัดแปลงทางพันธุกรรมบวกของ PDV เมล็ดส่งกักกันพืชที่ได้รับการพัฒนาในการศึกษาครั้งนี้จะถูกนำมาใช้อย่างต่อเนื่อง พืชกักกันในลักษณะที่รวดเร็วและถูกต้องและได้รับการคาดหวังว่าจะนำไปสู่การกักกันพืชในอนาคต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การพัฒนาและการใช้ประโยชน์ของเมล็ดลูกพรุน RT-PCR เพื่อส่งคนแคระไวรัสกักกัน นามธรรม

กับการเปิดเสรีการค้าล่าสุด พืชต่าง ๆได้ถูกนำเข้าสู่เกาหลี และตามความเป็นไปได้ของการแนะนำของพืชเชื้อโรคที่ไม่กระจายในเกาหลีมีเพิ่มขึ้น ( ลี et al . , ที่มีมากกว่า ) ของนำเข้าพืชเมล็ดเป็นสินค้าที่มีเชื้อโรคที่แฝงอยู่มากมาย และเป็นการยากที่จะตรวจสอบ ( มิน , 2009 ) ทั้งนี้ การนำเข้าในประเทศ และส่งออก ของเมล็ดพันธุ์ ที่คาดว่าจะเพิ่มขึ้นตามการขยายตัวของตลาดโลกในอนาคต ( ชิน , 2009 ) ถ้าเมล็ดส่งเชื้อโรคจะเข้าไปในเกาหลี พวกเขาสามารถอย่างกว้างขวางทำให้พืชแข็งแรงระหว่างกระบวนการและการปลูกและ นำมาซึ่งความสูญเสียทางเศรษฐกิจมหาศาล ( ลี et al . , ที่มีมากกว่า ) ปัญหาที่ใหญ่ที่สุดกับ เมล็ด เป็นไวรัส ในเกาหลี , ไวรัสที่มีความเสี่ยงสูงที่ถูกกักกันการจัดการโดยจัดให้เป็น ' ห้าม ' ' ควบคุม ' ' ควบคุมกักกันปลอด ' ' และ ' ' ไม่ใช่กักกันชั่วคราวการควบคุม ' ขึ้นอยู่กับการประเมินความเสี่ยง ( www.qia ไป เคอาร์ )pdv เป็นพืชเชื้อโรคไวรัสที่เป็นของ bromoviridae ilarvirus . ในเกาหลี มันเป็นเขตควบคุม และตรวจสอบในศาสนา cerasifera การทดสอบความเป็น armeniaca , หน้า , หน้า , หน้า mandshurica , หน้าหรือหน้าจาก serotina เมล็ด ( รวมทั้งหน้า cerasus เมล็ด ) ที่นำเข้าประเทศ ( สัตว์ พืช ประมง และ หน่วยงานตรวจสอบและกักกัน , 2013 ) .
เป็นเวลานานการตรวจสอบไวรัสกักกันพืชได้รับการปฏิบัติโดยใช้ enzyme-linked immunosorbent assay ( Stein , 1979 ) แต่วิธีนี้มีข้อเสียของปฏิกิริยาบวกเท็จและความไวต่ำ ( คารูโซ et al . , 2003 ; priou et al . , 2006 ) ดังนั้น วิธี RT-PCR และวิธี PCR ที่ซ้อนกัน ซึ่งจะง่ายกว่า และความไวสูงที่เพิ่งถูกศึกษา และก่อตั้งขึ้นในเกาหลี ( Kim et al ., 2000 ; ลี et al . , 2011a ; ลี et al . , 2011b ; ปาร์คกับคิม , 2004 ) ในประเทศอื่น ๆโดยความแปรปรวน ( ฟอนเซคา et al . , 2005 ) และการแสดงออกของโปรตีนหุ้ม ( Raquel et al . , 2008 ) ของ pdv ในระหว่างการติดเชื้อของพืชศึกษา และเพื่อการวินิจฉัยฟิลด์ , เพล็กซ์ 4 วิธี ได้แก่ การตรวจหา pdv ( massart et al . , 2008 )และแบบ Real-Time RT-PCR วิธี 8 ผลไม้หินไวรัส ( peir ó et al . , 2011 ) เพื่อ ในเกาหลี เมื่อพิจารณารายละเอียดของตัวอย่างเมล็ดพันธุ์ , การศึกษาการใช้เทคนิค PCR และวิธีการตรวจสอบด้วย ซึ่งมีความไวในการตรวจสอบสูง ได้ดำเนินการพร้อมกับการใช้เพียงครั้งเดียว สภาพการตรวจสอบระบบที่ตรงกับความต้องการของเว็บไซต์ตรวจสอบวิธีการตรวจสอบความปลอดภัย dualization รองพื้น , ทดแทนและการพัฒนาดัดแปลงพันธุกรรมบวกการควบคุม ( ลี et al . , ที่มีมากกว่า ; ลี et al . , 2013b ; ลี et al . , 2013c ) อย่างไรก็ตาม pdv วิธีการตรวจที่ตรงกับความต้องการของเว็บไซต์กักกันในประเทศยังไม่ได้รับรายงาน ดังนั้นในการศึกษานี้วิธีซ้อนกัน PCR และดัดแปลงพันธุกรรมบวกการควบคุมซึ่งตรงกับการตรวจสอบเงื่อนไขในเว็บไซต์กักกันของเมล็ดกักกันส่ง pdv มีการพัฒนา และผลการตรวจสอบที่ได้จาก 2007 2013 โดยใช้ PCR โมดูลที่พัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ได้รายงาน .
สำหรับ pdv ซึ่งเป็นเป้าหมายของการพัฒนา และซ้อนกัน 4 . การตรวจสอบวิธี PCR ,ใบเนื้อเยื่อพลัมที่ติดเชื้อก็นำเข้าจากอังกฤษ ( adgen , อังกฤษ ) ผ่านการอนุมัติของห้ามนำเข้าสินค้า โดยสัตว์และหน่วยงานกักกันพืช การ cdnas ของ Alfalfa mosaic virus ( และ ) , ไวรัส ( TSV ) แนวยาสูบ แตงกวาฝังไวรัส ( ซีเ มวี ) , อลาบัส mosaic virus ( armv ) , เชอร์รี่ใบไม้ม้วนไวรัส ( clrv ) ringspot ไวรัสมะเขือเทศ ( torsv ) ซึ่งถูกใช้ในการทดลองนี้ซื้อจากองค์กรภายในประเทศ ( bione , เกาหลีและดาวพลูโต , เกาหลี ) และตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ในช่องแช่แข็งลึกที่− 70 องศา สำหรับ pdv
รองพื้นออกแบบจากศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ 36 ชนิดของสายพันธุ์ รวมทั้ง pdv rna-3 ( nc_008038 ) ( ประมาณ 2.13 KB ) และ 13 ชนิดของ ilarvirus , รวมทั้งแอปเปิ้ลฝังไวรัส rna-3 ( nc_0035480 )ใช้ ( ตารางประกอบ 1 ) การวิเคราะห์ลำดับของไวรัสชิดใช้ bioedit ( Hall , 1999 ) และ pdv เฉพาะ - ขยายพันธุ์ลำดับถูกตรวจค้นที่ 51 ° C ( 59 dnaman การหลอมสภาพใช้แพคเกจซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 6.0 ( แพน et al . , 2000 ; ลี et al . , 2013c ) ค้นหาโดย 21 ไปข้างหน้าและย้อนกลับด้วยไพรเมอร์ 11 ( รวม 33 ชนิด ) ที่ 18 – 24 NT ,ตามลำดับ ( ตารางประกอบ 2 ) ใช้ไพรเมอร์รองพื้นเหล่านี้ , 167 ชุด ที่สามารถขยายได้โดยรวม ( ตารางเพิ่มเติม 3 ) .
ยีนการสกัดจากตัวอย่างและเทคนิค RT-PCR ซ้อนกันได้ทดลองใช้วิธีการเดียวกันกับที่อธิบายไว้ในบทความก่อนหน้านี้ ( ลี et al . , ที่มีมากกว่า ; ลี et al . , et al 2013b ; ลี . 2013c ) หลังจากปฏิกิริยาสมบูรณ์มีตัวอย่างของผลิตภัณฑ์ PCR ได้ 100 นาทีใช้ 1.2 % เจล ( 150 มล. ) โดยการเพิ่ม 4 μ l topred กรดนิวคลีอิกเจลคราบ ( biopure , สหราชอาณาจักร ) ก็พบว่าภายใต้แสง UV .
ในการคัดเลือกครั้งแรก Real-Time RT-PCR เพื่อไพรเมอร์ชุด 167 ชุดการใช้อาร์เอ็นเอทั้งหมด รวมทั้ง pdv ( คือเป้าหมายไวรัส ) เป็นแม่แบบระหว่างนี้ 30 ชุด ( ชุด 6 , 7 , 10 , 27 , 28 , 32 , 48 , 49 , 69 , 86 , 100 , 101 , 142 และ 164 ) ที่ซึ่งมีความเข้มสูงและไม่ได้แสดงปฏิกิริยาตอบสนองแบบไม่จำเพาะ ( ปฏิกิริยาเฉพาะชุด 1 , 2 , 3 , 4 , 8 9 , 14 , 24 , 25 , 26 , 30 , 43 , 44 , 66 , 79 , 83 , 110 , 138 , 139 , 140 , 141 , 154 และ 155 ) ที่ขัดขวางการวินิจฉัย ( รูปที่ 1 ) ในส่วนที่สองไม่มีความจำเพาะต่อและแพลตฟอร์มและ ซีเ มวี ซึ่งเป็นของ bromoviridae ถูกตรวจสอบเพื่อคัดเลือก 30 ไพรเมอร์ชุด 17 ชุดไพรเมอร์ซึ่งเกิดแถบสำหรับสามชนิดของไวรัส ( และแพลตฟอร์มและ ซีเ มวี ) ได้รับการยกเว้น และชุดที่ 7 , 10 , 27 , 28 , 32 , 48 , 49 , 69 , 86 , 100 , 101 , 142 และ 164 ( รวม 13 ชุด ) เลือก ( รูปที่ 2 ) . ในส่วนที่สามที่ไม่เฉพาะเจาะจงกับชนิดของไวรัส ( armv clrv , และ torsv ) ซึ่งสามารถติดเชื้อโฮสต์ที่สามารถติดเชื้อ pdv , ตรวจสอบ ระหว่างรองพื้นรองพื้น 13 ชุด ชุด 2 ( ชุด 7 และ 27 ) ซึ่งไม่ได้ฟอร์มวงดนตรีชนิดนี้ถูกเลือก ( รูปที่ 3 ) ดังนั้น แนวทางการตั้งค่า 7 ( pdv_f20 / ล้างพวกเขาและ NT ) และไพรเมอร์ชุด 27 ( pdv_f10 อย่างดี 673 / และ NT ) ซึ่งสามารถตรวจจับ pdv โดยเฉพาะ ,ในที่สุดก็เลือก ( ตารางที่ 1 ) ด้วย PCR ไพรเมอร์ซึ่งอีกครั้งสามารถขยายผลิตภัณฑ์ของที่เลือกใช้ชุด ก็เลือก เลือกโดย pdv_f60 / pdv_c80 และสินค้าสิ้น 305 BP ( ข้อมูลไม่แสดง ) .

รูปที่ 1
เลือกแรกของเผ่าพันธุ์ - เฉพาะสำหรับการตรวจหาดีเอ็นเอ pdv .

รูปที่ 2
เลือกที่สองของเผ่าพันธุ์ - เฉพาะสำหรับการตรวจหาดีเอ็นเอ pdv


รูปที่ 3เลือกที่สามของเผ่าพันธุ์ - เฉพาะสำหรับการตรวจสอบดีเอ็นเอ pdv


ชุดโต๊ะ 1 . เลือกรองพื้นสำหรับเทคนิค PCR ของซ้อนกันและ pdv
pdv เป็น ' ควบคุม ' กักกันไวรัส และไม่ได้ถูกเผยแพร่ในเกาหลี ตาม มีความยากลำบากในการใช้ตัวอย่างเป็นตัวควบคุม ดังนั้น การควบคุมผลิตโดยใช้พลาสมิด การใช้เวกเตอร์ pgem ® - T ง่าย ( promega , USA )การโคลนการใช้ PCR ขยายผลิตภัณฑ์ซึ่งมีทั้งหมด 4 ชุด เลือกสีรองพื้นที่แทรกดีเอ็นเอ การใช้เว็บไซต์โดยตรงของชุด ( Nelson และคลี , 1992 ) , ctcgag ซึ่งเป็นลําดับที่ xhoi เอนไซม์ ปฏิกิริยาได้ถูกแทรกลงใน 305 NT ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ PCR ( เพิ่มเติมรูปซ้อนกัน ( S1 )หากผลิตภัณฑ์ถูกตัดออกโดยซ้อนกันสองวง มีปฏิกิริยากับเอนไซม์ xhoi ( เพิ่มเติมรูป S2 ) หรือถ้าใส่ 6 นิวคลีโอไทด์ที่พบในลำดับก็จะตัดสินว่าผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการปนเปื้อนจากการดัดแปลงพันธุกรรม บวก การควบคุมพัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ ใช้วิธีนี้
, โมดูลที่ซ้อนกันและแก้ไขพลาสควบคุมบวก ) ซึ่งพัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ pdv ถูกตรวจสอบในศาสนา cerasifera การทดสอบความเป็น armeniaca , หน้า , หน้า , หน้า mandshurica , หน้า cerasus andp . จากหน้า serotina และเมล็ดพันธุ์ที่นำเข้าเกาหลีจาก 2550 ถึงกันยายน 2013 ตามระบบข้อมูลโรคและแมลงศัตรูพืช ( http : / / 10.110.128.100 )ซึ่งเป็นระบบอินทราเน็ตของสัตว์และหน่วยงานกักกันพืช pdv ได้รับการตรวจพบในทั้งหมด 18 ราย ตั้งแต่ปี 2007 ในการตรวจสอบกักกัน pdv ผ่านเส้นทางทั้งหมดที่นำเข้า ซึ่งได้แก่ พวกสินค้า ( เครื่องบิน , เรือ , รถไฟและที่ดิน ) , อีเมล์และแบกสัมภาระ pdv ถูกตรวจพบในอันดับลิงการทดสอบความเป็นเมล็ด ( 13 ราย ) , หน้า armeniacaseeds ( 2 ราย ) , หน้า cerasus เมล็ด ( กรณีหนึ่ง )หน้าหรือหน้าจาก serotina เมล็ด ( คดี ) , และศาสนา mandshurica เมล็ด ( กรณีหนึ่ง ) pdv พบบ่อยที่สุดในปี 2009 ( 12 จาก 18 ราย และจากการตรวจสอบด้วยเทคนิค
วิธีการและดัดแปลงพันธุกรรมบวกการควบคุมของการกักกันพืช เมล็ดพันธุ์ที่ส่ง pdv ที่ถูกพัฒนาขึ้นในการศึกษานี้จะใช้สำหรับกักกันพืชอย่างต่อเนื่องในลักษณะที่รวดเร็วและถูกต้องและคาดว่าจะส่งผลให้พืชกักกันในอนาคต

.