Desai and Mehta (1985) reported the

Desai and Mehta (1985) reported the influence of polyamines on shoot, root and callus production from leaf discs. Rodriguez et al. (2007) obtained shoots from nodal segments cultured on WPM medium (Lloyd and McCown, 1980) supplemented with 8.8 μM benzyladenine (BA), whereas leaf explants cultured in the same conditions showed callus formation without shoot development. On the other hand, Pinto et al. (2010) induced bud production on MS medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with BA, thidiazuron (TDZ), and AgNO3 using leaf segments of greenhouse plants, and hypocotyls excised from axenic seedlings. Shoot elongation and plant development only occurred from buds obtained from hypocotyls explants cultured on MSM medium supplemented with gibberellic acid (GA3), in flasks with vented lids. Thus, the objective of this work was to systematically study new strategies for in vitro culture of P. alata aiming at developing efficient plant production protocols as well as establishing callogenesis and cell suspension cultures for further phytochemical and pharmacological studies.

2 Material and methods
2.1 Plant material and culture conditions
Fruits of P. alata were purchased in local markets. Seeds were separated from arils, then washed and dried for 2 days in the shade, and stored in a refrigerator for one month. Basal media consisted of B5 (Gamborg et al., 1968), MS or MSM (Monteiro et al., 2000) salts, containing MS vitamins and 3% (w/v) sucrose, and solidified with 0.7% (w/v) agar (Merck). MSM medium formulation is a modification of MS medium based on the composition of leaves of field-grown plants of P. edulis f. flavicarpa. It contains reduced concentrations of nitrogen, potassium, zinc, boron and chloride, associated to increased concentrations of calcium, magnesium, sulfur, iron, manganese, copper, sodium and EDTA, and does not contain iodine. The reduction of chloride is achieved by changing the calcium source from calcium chloride to calcium nitrate. The pH for all media was adjusted to 5.8 and growth regulators were added at different concentrations before autoclaving for 15 min at 121 °C. All inorganic chemicals used were P.A. grade, and biochemical reagents were of the best grade available from Sigma Chemical Co.

Cultures were maintained in a growth chamber at 25 ± 2 °C in the dark or under a 16 h photoperiod, using a total irradiance of 96 μmol m−2 s−1 provided by cool-white fluorescent lamps.

2.2 Establishment of primary cultures
Seeds of P. alata were surface-sterilized with 1.0% (w/v) sodium hypoclorite for 20 min with agitation and washed three times with sterile deionized water. Disinfected seeds were distributed between two layers of sterile filter paper soaked with 2.5% gibberellic acid (GA3) for 5 days. After this period, the seeds were mechanically scarified with a scalpel, and inoculated on ½ MS medium (half-strength of MS salts, MS vitamins, and 1.5% (w/v) sucrose) solidified with 0.7% agar (Merck), followed by incubation in a germinator with a photoperiod of 8 h using a total irradiance of 28.7 μmol m−2 s−1 provided by cool-white fluorescent lamps and alternate temperatures (30 °C for 8 h and 20 °C for 16 h) for 60 days (Osipi and Nakagawa, 2005). In order to obtain primary cultures, shoot apices and nodal segments were excised from 30-day old seedlings, inoculated on ½ MSM medium (half-strength of MSM salts, MS vitamins and 1.5% (w/v) sucrose) solidified with 0.7% agar, and incubated under a 16-h photoperiod.

In order to optimize shoot elongation, stem segments (2.0 cm) containing two nodes were excised from plants obtained 60 days after initiation of primary cultures, and inoculated on B5, ½ B5 or ½ MSM medium supplemented with 5 or 10% coconut water (Sigma–Aldrich Chemical Co.). Three flasks containing four explants each were cultured per treatment and maintained under standard culture conditions for 30 days. Experiments were repeated twice.

2.3 Plant regeneration and callus induction
Plants of the primary cultures described above were used as sources of explants for experiments of micropropagation and induction of callogenesis. Nodal (0.5 cm) and internodal segments (1.0 cm) were inoculated on MSM media supplemented with different concentrations of BA (4.4, 8.8, 13.2, 17.6, 22.0 μM), α-naphthaleneacetic acid (NAA) (5.4, 10.8, 16.2, 21.6, 27.0 μM) or picloram (PIC) (4.1, 8.3, 12.4, 16.6, 20.7 μM), and incubated in the presence of light. Leaf segments with the midvein (1.0 cm2) were cultured with either the adaxial or abaxial surface in contact with MSM supplemented with different concentrations of BA (4.4, 13.2, 22.0, 31.0, 44.4 μM), NAA (5.4, 16.2, 26.9, 37.8, 54 μM) or PIC (4.1, 12.4, 20.7, 28.9, 41.4 μM), and maintained in the presence or absence of light.

Four glass flasks (8 cm × 7 cm) closed with polypropylene caps containing three explants each were cultured per treatment, and each experiment was repeated three times. Sub-cultures were performed after 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Desai และ เมห์ตา ( 1985 ) รายงานว่า อิทธิพลของ polyamines ในการถ่ายภาพ , รากและการผลิตแคลลัสจากแผ่นใบ Rodriguez et al . ( 2550 ) ที่ได้ยิงจากส่วนปมเพาะเลี้ยงให้เกิดขนาดกลาง ( ลอยด์ และเมิ่กเคาน์ , 1980 ) เติม benzyladenine ( BA ) 8.8 μเมตร ส่วนใบ เลี้ยงเพาะในเงื่อนไขเดียวกัน มีการสร้างแคลลัสโดยการพัฒนาการถ่ายภาพ บนมืออื่น ๆ , ปิ่นโต et al . ( 2010 ) กระตุ้นการผลิตหน่อบนอาหาร MS ( อาหารสูตร Murashige and Skoog , 1962 ) ที่เติม BA , thidiazuron ( TDZ ) และ agno3 โดยใช้ส่วนของใบที่ตัดจากเรือนกระจกพืชและสาร axenic ต้นกล้า ยิงยืดตัวและพัฒนาพืชเท่านั้น ที่เกิดจากตา ที่ได้จากเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วยสารระหว่างกรดจิบเบอเรลลิ ( GA3 ) , ขวดที่มีฝาระบายอากาศ . ดังนั้น วัตถุประสงค์ของงานนี้คือระบบการศึกษากลยุทธ์ใหม่สำหรับการเพาะหน้าชุมเห็ดเทศหมายใจที่พัฒนาระบบการผลิตพืชที่มีประสิทธิภาพ ตลอดจนการสร้างวัฒนธรรมและ callogenesis เซลล์ แขวนลอย ในการศึกษาทางพฤกษเคมีและเภสัชวิทยา .2 วัสดุและวิธีการ2.1 วัสดุเพาะเลี้ยงพืชและผลไม้หน้า ชุมเห็ดเทศ ซื้อในตลาดท้องถิ่น เมล็ด แยกจาก arils แล้วล้างและอบแห้ง 2 วันในที่ร่ม และเก็บในตู้เย็นเป็นเวลาหนึ่งเดือน แรกเริ่มสื่อประกอบด้วย B5 ( Gamborg et al . , 1968 ) , MS หรือ MSM ( มอนเตโร่ et al . , 2000 ) เกลือ ประกอบด้วยนางสาววิตามินและ 3% ( w / v ) ซูโครส และแข็งกับ 0.7 % ( w / v ) agar ( Merck ) ระหว่างกลางคือการแก้ไขสูตร MS ที่ขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของใบไม้ของเขตปลูกพืชของ P . ตับเต่า เอฟ flavicarpa . มันมีการลดความเข้มข้นของไนโตรเจน โพแทสเซียม สังกะสี โบรอน และคลอไรด์ ที่เกี่ยวข้อง เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของแคลเซียม , แมกนีเซียม , กำมะถัน เหล็ก แมงกานีส ทองแดง และโซเดียม EDTA และไม่มีไอโอดีน การลดลงของคลอไรด์ได้ โดยเปลี่ยนแหล่งแคลเซียมจากแคลเซียม คลอไรด์ แคลเซียมไนเตรท . pH ให้สื่อปรับดีขึ้นและสารควบคุมการเจริญเติบโต เพิ่มความเข้มข้นที่แตกต่างกันก่อนที่จะอัตราส่วนโฟกัส 15 นาทีที่อุณหภูมิ 121 องศา สารเคมีที่ใช้ทั้งหมดทุกเกรด และชีวเคมีรีเอเจนต์เป็นเกรดที่ดีที่สุดจาก ซิกม่า เคมี จำกัดวัฒนธรรมที่ถูกเก็บรักษาไว้ในการเจริญเติบโตไม่มี ที่ 25 ± 2 ° C ในที่มืดหรือภายใต้แสง 16 ชั่วโมง การใช้ฉายรังสีทั้งหมด 96 μ mol m − 2 s − 1 โดยเย็นหลอดสีขาว2.2 จัดตั้งวัฒนธรรมหลักเมล็ดพันธุ์แห่งหน้า ชุมเห็ดเทศ ฆ่าเชื้อที่ผิวด้วย 1% ( w / v ) โซเดียม hypoclorite 20 นาทีด้วยการกวน และล้างสามครั้งกับเป็นหมันคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ ฆ่าเชื้อเมล็ดกระจายอยู่ระหว่างสองชั้นของหมันไส้กรองกระดาษที่แช่ด้วย 2.5% กรดจิบเบอเรลลิ ( GA3 ) เป็นเวลา 5 วัน หลังจากระยะเวลานี้ เมล็ดเครื่องเทศ scarified กับมีดผ่าตัด , และหัวเชื้อใน½ MS ( แรงครึ่งหนึ่งของเกลือ MS , MS วิตามินและ 1.5 % ( w / v ) ซูโครส ) แข็งกับ 0.7% agar ( Merck ) รองลงมา คือ การบ่มเพาะใน germinator ที่มีต่อ 8 ชั่วโมง การใช้ฉายรังสีทั้งหมด การคิดμ mol m − 2 s − 1 ให้หลอดขาวเย็นและอุณหภูมิสลับ 30 ° C เป็นเวลา 8 ชั่วโมงและ 20 ° C เป็นเวลา 16 ชั่วโมง ) สำหรับ 60 วัน ( osipi กับ Nakagawa , 2005 ) เพื่อรับวัฒนธรรมหลัก และยิง apices ส่วนข้อ ถูกตัดจากต้นที่อายุ 30 วัน แต่ในชายรักชาย½ขนาดกลาง ( แรงครึ่งหนึ่งของเกลือ เพิ่ม MS วิตามินและ 1.5 % ( w / v ) ซูโครส ) แข็งกับ 0.7% วุ้น โดยภายใต้ 16-h แสง .เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการยิง การยืดตัว ส่วนก้าน ( 2.0 ซม. ) ที่มีสองโหนดถูกตัดจากพืชได้ 60 วันหลังจากที่เริ่มต้นของวัฒนธรรมหลัก และหัวเชื้อใน B5 , ½ B5 หรือ½เพิ่มเติม 5 หรือ 10 % น้ำมะพร้าว ( ซิกม่า Aldrich และ Chemical Co . ) สามขวดอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ประกอบด้วยสี่กันต่อ การรักษา และรักษาวัฒนธรรมภายใต้เงื่อนไขมาตรฐานสำหรับ 30 วัน ทดลองซ้ำ 2 ครั้ง2.3 พืชและการงอกของแคลลัสพืชในวัฒนธรรมหลักที่อธิบายข้างต้นถูกใช้เป็นแหล่งอาหารสำหรับการทดลองของการขยายพันธุ์และชักนำของ callogenesis . ข้อ ( 0.5 ซม. ) และ internodal กลุ่ม ( ซม ) ปลูกเชื้อบน MSM สื่อเสริมด้วยระดับความเข้มข้นของ BA ( 4.4 , 8.8 , 13.2 17.6 , T4 , μ M ) , แอลฟาไพร่ฟ้าประชาชน acid ( NAA ) ( 5.4 , 10.8 , 16.2 , 21.6 27.0 μ , M ) หรือ พอล ดิแรก ( PIC ) ( . , 8.3 , 12.4% , 16.6 , 20.7 μ m ) และบ่มในการแสดงตนของแสง ใบส่วนที่มีเส้นกึ่งกลางใบไม้ ( 1.0 CM2 ) เพาะเลี้ยง ไม่ซื้อสิทธิ์ขายเสียง ผิวแก่ หรือติดต่อกับ MSM อาหารเสริมระดับความเข้มข้นของ BA ( 4.4 13.2 , T4 31.0 , , μ / M ) , NAA ( 5.4 , 16.2 , 26.9 37.8 , 54 , μ M ) หรือรูปภาพ ( 4.1 , 12.4% ตามลำดับหมาย , 41.4 , μ m ) และรักษาในการแสดงตนหรือขาดของแสง4 ขวดแก้ว ( 8 cm × 7 ซม. ) ปิดด้วยโพรพิลีนหมวกที่มีสามชิ้นส่วนแต่ละเพาะเลี้ยงต่อ การรักษา และแต่ละทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง วัฒนธรรมที่ถูกย่อยต่อ