2.3. Identification of meat species

2.3. Identification of meat species using multiplex PCR
A consensus multiplex PCR method, which was firstly established by Matsunaga et al. (1999), was used to assay pork, beef, chicken and mutton in the food samples with minor modification. A common forward primer SIM1 (50-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-30) and 4 species-specific reverse primers [mutton primer M1 (50-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-30),
chicken primer C1 (50-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-30),
beef primer B1 (50-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-30),
pork primer P1 (50-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-30)
were synthesized, targeting the regions on the mitochondrial cytochrome b genes (Fig. 1). Compared to Matsunaga’s method, we designed a common reverse primer M1 to simultaneously identify goat and
sheep (mutton) due to the almost equivalent prices of these 2 meats. Besides, the horse meat was not examined because it was rare on the market. The multiplex PCR reactions were run on an ABI Veritee 96-
well PCR System (ABI, USA). The experimental parameters optimized by Matsunaga et al. (1999), including the ratio of primers and the PCR conditions, were used in the present assay. The multiplex PCR
reaction was run in a 50 mL volume: 25 mL of 2_PCR reaction master mix (Takara, Japan), 1 mL DNA template and the mix of 5 primes containing SIM1, M1, C1, B1 and P1 (1:0.2:3:0.6:0.6) (the ratio 1
means 20pmol primer/50ml PCR solution). The PCR conditions were as follows : denaturation at 94 _C for 3 min, followed by 35 cycles of 30 s at 94 _C, 30 s at 60 _C, 30 s at 72 _C, and a final polymerization at
72 _C for 7 min. After amplification, 15 mL of the PCR products were electrophoresed on 2% agarose gel with 0.5 mg/ml ethidium bromide.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 บัตรประจำตัวของสายพันธุ์เนื้อใช้ multiplex PCR
วิธี multiplex PCR มติซึ่งเป็นที่ยอมรับในตอนแรกโดย Matsunaga ตอ​​ัล (1999), ถูกใช้ในการวิเคราะห์การเนื้อหมูเนื้อไก่และเนื้อแกะในตัวอย่างอาหารที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยไพรเมอร์ทั่วไป SIM1 ไปข้างหน้า (50 gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa-30) และ 4 สายพันธุ์เฉพาะไพรเมอร์กลับ [เนื้อแกะ m1 ไพรเมอร์ (50 gcctatgaatgctgtggctattgtcgc-30),
ไพรเมอร์ไก่ c1 (50 aagatacagatgaagaagaatgaggcg-30),
ไพรเมอร์เนื้อ b1 (50 - ctagaaaagtgtaagacccgtaatataag-30),
หมู p1 ไพรเมอร์ (50 gctgatagtagatttgtgatgaccgta-30)
ถูกสังเคราะห์การกำหนดเป้​​าหมายในภูมิภาคยลยีน cytochrome b (รูปที่ 1) เมื่อเทียบกับวิธีการ Matsunaga ของเราได้ออกแบบไพรเมอร์ทั่วไป m1 กลับพร้อมกันระบุแพะและแกะ
(เนื้อแกะ) อันเนื่องมาจากราคาที่เทียบเท่าเกือบทั้ง 2 เนื้อสัตว์ นอกจากเนื้อม้าไม่ได้รับการตรวจสอบเพราะมันเป็นที่หายากในตลาด ปฏิกิริยา pcr หลายคนทำงานใน veritee ABI 96 -
ทั้งระบบ pcr (ช่วยเหลือ, usa) พารามิเตอร์การทดลองที่ดีที่สุดโดย Matsunaga ตอ​​ัล (1999) รวมทั้งอัตราส่วนของไพรเมอร์และเงื่อนไข pcr ถูกนำมาใช้ในการทดสอบปัจจุบัน multiplex PCR
ปฏิกิริยาได้รับการทำงานในปริมาณ 50 มล. 25 มล. ผสมหลัก 2_pcr ปฏิกิริยา (TAKARA, ญี่ปุ่น) 1 มล. แม่ dna และส่วนผสมจาก 5 จำนวนเฉพาะที่มี SIM1, m1, c1, b1 และ p1 (1:0.2 : 3:0.6:0.6) (อัตราส่วน 1
หมายความ 20pmol primer/50ml pcr การแก้ปัญหา) เงื่อนไข pcr มีดังนี้ denaturation ที่ 94 _c เป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบ 30 วินาทีที่ 94 _c, 30 วินาทีที่ 60 _c, 30 วินาทีที่ 72 _c และพอลิเมอสุดท้ายที่ _c
72 เป็นเวลา 7 นาที หลังจากการขยาย, 15 มล. ของผลิตภัณฑ์ pcr ถูก electrophoresed 2% เจล agarose 0.5 mg / ml ethidium โบรไมด์.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การระบุพันธุ์เนื้อใช้ multiplex PCR
มติ multiplex PCR วิธี ซึ่งประการแรกได้ก่อตั้งขึ้นโดย Matsunaga et al. (1999), ใช้ assay หมู เนื้อ ไก่ และ mutton ในตัวอย่างอาหารมีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย พื้นไปข้างหน้าทั่วไป SIM1 (50-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-30) และ 4 species-specific กลับไพรเมอร์ [พื้น mutton M1 (50-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-30),
ไก่พื้น C1 (50-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-30),
เนื้อรองพื้น B1 (50-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-30),
หมูพื้น P1 (50-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-30)
ถูกสังเคราะห์ กำหนดเป้าหมายในภูมิภาคบนยีน mitochondrial cytochrome b (Fig. 1) เมื่อเทียบกับวิธีการของ Matsunaga เราออกแบบทั่วไปกลับพื้น M1 พร้อมระบุแพะ และ
แกะ (mutton) เนื่องจากราคาเกือบเท่าของเนื้อสัตว์เหล่านี้ 2 นอกจาก เนื้อม้าถูกตรวจสอบ เพราะมันหายากในตลาด ปฏิกิริยา PCR multiplex ถูกเรียกใช้ในการลักชัวรี่ Veritee 96-
ดี PCR ระบบ (ABI สหรัฐอเมริกา) ทดลองการใช้พารามิเตอร์ที่เหมาะโดย Matsunaga et al. (1999), รวมทั้งอัตราส่วนของไพรเมอร์และเงื่อนไข PCR ถูกใช้ในการวิเคราะห์นำเสนอ PCR ต่าง ๆ ๅ
ปฏิกิริยาถูกรันในปริมาตร 50 mL: 25 mL 2_PCR ปฏิกิริยาหลักผสม (Takara ญี่ปุ่น), 1 mL ดีเอ็นเอแม่แบบ และผสมผสานของโรงแรมไพรม์ 5 ประกอบด้วย SIM1, M1, C1, B1 และ P1 (1:0.2:3:0.6:0.6) (อัตราส่วน 1
หมายความว่า โซลูชัน PCR 50 ml รองพื้น 20pmol) เงื่อนไข PCR มีดังนี้: denaturation ที่ _C 94 สำหรับ 3 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 30 s ที่ 94 _C, 30 s ที่ 60 _C, 30 s ที่ 72 _C, polymerization ขั้นสุดท้ายที่
_C 72 สำหรับนาที 7 หลังจากขยาย 15 mL ผลิตภัณฑ์ PCR ถูก electrophoresed ในเจ 2% agarose กับโบรไมด์ ethidium 0.5 mg/ml.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 . การระบุตัวตนของสายพันธุ์เนื้อโดยใช้วิธี pcr แบบมัลติเพล็กซ์แบบมัลติเพล็กซ์ฉันทามติ pcr
ที่ซึ่งได้ถูกสร้างขึ้นโดย matsunaga et al .อันดับแรก ( 1999 )ได้ถูกนำมาใช้ในการสอบเนื้อแกะเนื้อไก่และเนื้อหมูเนื้อวัวในตัวอย่างอาหารที่พร้อมด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย.ที่ร่วมกันส่งต่อเชื้อปะทุซิมการ์ด 1 ( 50 - gacctcccagctccatcaaacatctcatcttgatgaaa 30 )และ 4 สายพันธุ์ - เฉพาะย้อนกลับ primers [เนื้อแกะเชื้อปะทุม. 1 ( 50 - gcctatgaatgctgtggctattgtcgc 30 ),
ไก่เชื้อปะทุ C 1 ( 50 - aagatacagatgaagaagaatgaggcg 30 ),
เนื้อเชื้อปะทุ B 1 ( 50 - ctagaaaagtgtaagacccgtaatataag 30 ),
หมูเชื้อปะทุ P 1 ( 50 - 30 gctgatagtagatttgtgatgaccgta )
มีสังเคราะห์ความถี่,เป้าหมายในเขตพื้นที่ที่ยีน B cytochrome mitochondrial (รูปที่ 1 ) เมื่อเทียบกับวิธีการของเราได้รับการออกแบบ matsunaga Primer ย้อนกลับทั่วไปที่ม. 1 เพื่อระบุแพะและแกะ
(เนื้อแกะ)เนื่องจากมีราคาเท่ากับที่เกือบจะ 2 เนื้อเหล่านี้ได้พร้อมกัน นอกจากเนื้อม้าไม่ได้ตรวจสอบเพราะมันหาได้ยากในตลาด ปฏิกิริยา pcr แบบมัลติเพล็กซ์ที่เป็นการวิ่งบน ABI veritee 96 -
:รวมถึง pcr ระบบ( ABI USA ) พารามิเตอร์ที่ปรับแต่งโดยทดลอง matsunaga et al . ( 1999 )ซึ่งรวมถึงสัดส่วนของ primers pcr และเงื่อนไขที่จะถูกใช้ในปัจจุบันที่สอบ. จะ pcr แบบมัลติเพล็กซ์
ปฏิกริยาก็เรียกใช้ใน 50 มล.: 25 มล.ของ 2 _pcr ปฏิกริยา Master ผสม( takara ,ญี่ปุ่น), 1 มล.ดีเอ็นเอเทมเพลตและผสมให้เข้ากันของ 5 กำจัดขนได้ดีแม้เส้นที่มี sim1 , M 1 , C 1 ,, B 1 และ P 1 ( 1 : 0.2 : 3 : 0.6 - 0.6 )(ที่อัตราส่วน 1
หมายความว่ามล. 20 pmol เชื้อปะทุ/ 50 โซลูชัน pcr ) จะ pcr เงื่อนไขดังนี้: denaturation ที่ 94 _c สำหรับ 3 นาที,ตามด้วย 35 รอบ 30 S ที่ _c 94 , 30 S ที่ 60 _c , 30 S ที่ 72 _c ,และสุดท้ายลิเมอร์ที่
72 _c สำหรับ 7 นาทีหลังจากการขยายสัญญาณเสียง, 15 มล.ของ pcr สินค้า electrophoresed ใน 2% agarose เจลพร้อมด้วย 0.5 มก./ ML ethidium ไม่น่าทึ่ง.