- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
MethodsStrains and culture mediaH.
Methods
Strains and culture media
H. volcanii strains (see Additional file 1: Table S2)
were provided by Thorsten Allers of the University of
Nottingham, UK, and grown in media adapted from previous
studies [47]. Rich medium (Hv-YPC) contained 144 g
NaCl, 21 g MgSO4 × 7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g
KCl, 12 mM Tris-HCl pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution,
1.0 ml trace element solution, 5.0 g yeast extract,
1.0 g casamino acids, and 1.0 g peptone per liter. Hv-YPC
used to culture GFP biofilms for EPS staining also contained
0.5% glucose.
Hv-Ca medium contained 144 g NaCl, 21 g MgSO4 ×
7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g KCl, 12 mM Tris-HCl
pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution, 1.0 ml trace element
solution, 5.0 g casamino acids, 0.125 ml 6.4 mg/ml
thiamine solution, and 0.125 ml 0.8 mg/ml biotin solution
per liter.
A basal-salts starvation medium (Hv-starve) contained
all components in Hv-YPC other than complex nutrients
(i.e., yeast extract, casamino acids and peptone). Solid
media contained 18 g of agar per liter. When required,
uracil was provided at 50 μg/ml (ΔpyrE2 strains), thymidine
and hypoxanthine at 40 μg/ml (ΔhdrB strains), tryptophan
at 50 μg/ml (ΔtrpA strains), and novobiocin at 0.30 μg/ml
for antibiotic selection.
Development of GFP-expressing Haloferax volcanii
H1206 strain
Two H. volcanii uracil auxotrophic strains were developed
for constitutive GFP-expression and cell imaging by CLSM
and epifluorescence microscopy (see Additional file 1:
Table S2). The strain H1206(pJAM1020) was based on
selection through novobiocin resistance using a previously
developed vector [59], and a second strain H1206
(pSC409GFP) was based on the gene pyrE2 and uracil
autotrophy [44,46,47]. Plasmid pSC409GFP was constructed
by amplifying the region from pJAM1020
containing red-shifted GFP and P2 promoter for constitutive
expression in haloarchaeal species [59], and
inserting this construct into the shuttle vector pTA409
[101] (see Additional file 1: Tables S2 and S3). Each plasmid
was transformed into the strain H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)
using the PEG-based method as previously developed
[49,102,103], and transformants were selected on Hv-
Ca medium without uracil for H1206(pSC409GFP) or
containing novobiocin for H1206(pJAM1020). H. volcanii
H1206 is identical to H26 other than an additional deletion
of the mrr gene, which encodes a restriction endonuclease
that cleaves methylated foreign DNA, allowing transformation
without passage through an Escherichia coli dam
mutant [46]. Growth kinetics of each GFP strain in liquid
Hv-YPC medium were measured by optical density and
were unchanged from the parental strain.
Biofilm growth systems
The media described above were prepared and used to
cultivate H. volcanii biofilms using the experimental
growth methods described below. All biofilms were incubated
at 42°C unless otherwise stated.
Colony biofilms
Colony biofilms as shown in Figure 1B were prepared on
13-mm polycarbonate filters (0.2-μm pore size, Sigma,
St. Louis, MO, Z365041) as previously described [7,23]. Diluted
H. volcanii culture (OD 600 nm = 0.1) was transferred
onto the surface of sterile filters previously placed directly
on the surface of the solid medium with sterile forceps.
After the culture medium penetrated the filter and evaporated,
the plates were inverted and incubated. Filters were
transferred to fresh plates under sterile conditions every
48 h during the growth period.
Static liquid biofilms
SL-biofilms were set up by aliquoting inoculated growth
medium into six-well plates and Petri dishes (as in
Figures 1C, 2K and 4, and see Additional files 3, 4, 5, 6 and
7: Movies 2–6), or chamber slides (Lab-Tek II, with 0.7 cm2
growth area per well; as in the top left panel of Figure 1C
and Figure 2I,J). A borosilicate glass coupon (Biosurfaces
Technologies Corporation, Bozeman, MT, RD 128-GL) or a
piece of coverglass was placed inside the six-well plates (as
in Figure 1C) to provide a biofilm growth surface that could
be visualized directly through microscopy.
Biofilm staining and microscopy preparation
The properties and experimental parameters used for all
dyes in this study are summarized in Additional file 1:
Table S1. The final concentration of each staining solution
was optimized based on either the manufacturer’s
protocol or a previous study. CR staining was performed
using the alkaline CR method [104,105]. Biofilms were
stained and prepared for microscopy as described below
for each growth method.
Colony biofilms
Mature colony biofilms were stained by transferring a
staining solution in Hv-starve medium directly on top of
the colony biofilm and incubating at room temperature
for 60 min. Cross sections of stained colony biofilms
Strains and culture media
H. volcanii strains (see Additional file 1: Table S2)
were provided by Thorsten Allers of the University of
Nottingham, UK, and grown in media adapted from previous
studies [47]. Rich medium (Hv-YPC) contained 144 g
NaCl, 21 g MgSO4 × 7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g
KCl, 12 mM Tris-HCl pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution,
1.0 ml trace element solution, 5.0 g yeast extract,
1.0 g casamino acids, and 1.0 g peptone per liter. Hv-YPC
used to culture GFP biofilms for EPS staining also contained
0.5% glucose.
Hv-Ca medium contained 144 g NaCl, 21 g MgSO4 ×
7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g KCl, 12 mM Tris-HCl
pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution, 1.0 ml trace element
solution, 5.0 g casamino acids, 0.125 ml 6.4 mg/ml
thiamine solution, and 0.125 ml 0.8 mg/ml biotin solution
per liter.
A basal-salts starvation medium (Hv-starve) contained
all components in Hv-YPC other than complex nutrients
(i.e., yeast extract, casamino acids and peptone). Solid
media contained 18 g of agar per liter. When required,
uracil was provided at 50 μg/ml (ΔpyrE2 strains), thymidine
and hypoxanthine at 40 μg/ml (ΔhdrB strains), tryptophan
at 50 μg/ml (ΔtrpA strains), and novobiocin at 0.30 μg/ml
for antibiotic selection.
Development of GFP-expressing Haloferax volcanii
H1206 strain
Two H. volcanii uracil auxotrophic strains were developed
for constitutive GFP-expression and cell imaging by CLSM
and epifluorescence microscopy (see Additional file 1:
Table S2). The strain H1206(pJAM1020) was based on
selection through novobiocin resistance using a previously
developed vector [59], and a second strain H1206
(pSC409GFP) was based on the gene pyrE2 and uracil
autotrophy [44,46,47]. Plasmid pSC409GFP was constructed
by amplifying the region from pJAM1020
containing red-shifted GFP and P2 promoter for constitutive
expression in haloarchaeal species [59], and
inserting this construct into the shuttle vector pTA409
[101] (see Additional file 1: Tables S2 and S3). Each plasmid
was transformed into the strain H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)
using the PEG-based method as previously developed
[49,102,103], and transformants were selected on Hv-
Ca medium without uracil for H1206(pSC409GFP) or
containing novobiocin for H1206(pJAM1020). H. volcanii
H1206 is identical to H26 other than an additional deletion
of the mrr gene, which encodes a restriction endonuclease
that cleaves methylated foreign DNA, allowing transformation
without passage through an Escherichia coli dam
mutant [46]. Growth kinetics of each GFP strain in liquid
Hv-YPC medium were measured by optical density and
were unchanged from the parental strain.
Biofilm growth systems
The media described above were prepared and used to
cultivate H. volcanii biofilms using the experimental
growth methods described below. All biofilms were incubated
at 42°C unless otherwise stated.
Colony biofilms
Colony biofilms as shown in Figure 1B were prepared on
13-mm polycarbonate filters (0.2-μm pore size, Sigma,
St. Louis, MO, Z365041) as previously described [7,23]. Diluted
H. volcanii culture (OD 600 nm = 0.1) was transferred
onto the surface of sterile filters previously placed directly
on the surface of the solid medium with sterile forceps.
After the culture medium penetrated the filter and evaporated,
the plates were inverted and incubated. Filters were
transferred to fresh plates under sterile conditions every
48 h during the growth period.
Static liquid biofilms
SL-biofilms were set up by aliquoting inoculated growth
medium into six-well plates and Petri dishes (as in
Figures 1C, 2K and 4, and see Additional files 3, 4, 5, 6 and
7: Movies 2–6), or chamber slides (Lab-Tek II, with 0.7 cm2
growth area per well; as in the top left panel of Figure 1C
and Figure 2I,J). A borosilicate glass coupon (Biosurfaces
Technologies Corporation, Bozeman, MT, RD 128-GL) or a
piece of coverglass was placed inside the six-well plates (as
in Figure 1C) to provide a biofilm growth surface that could
be visualized directly through microscopy.
Biofilm staining and microscopy preparation
The properties and experimental parameters used for all
dyes in this study are summarized in Additional file 1:
Table S1. The final concentration of each staining solution
was optimized based on either the manufacturer’s
protocol or a previous study. CR staining was performed
using the alkaline CR method [104,105]. Biofilms were
stained and prepared for microscopy as described below
for each growth method.
Colony biofilms
Mature colony biofilms were stained by transferring a
staining solution in Hv-starve medium directly on top of
the colony biofilm and incubating at room temperature
for 60 min. Cross sections of stained colony biofilms
0/5000
MethodsStrains and culture mediaH. volcanii strains (see Additional file 1: Table S2)were provided by Thorsten Allers of the University ofNottingham, UK, and grown in media adapted from previousstudies [47]. Rich medium (Hv-YPC) contained 144 gNaCl, 21 g MgSO4 × 7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 gKCl, 12 mM Tris-HCl pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution,1.0 ml trace element solution, 5.0 g yeast extract,1.0 g casamino acids, and 1.0 g peptone per liter. Hv-YPCused to culture GFP biofilms for EPS staining also contained0.5% glucose.Hv-Ca medium contained 144 g NaCl, 21 g MgSO4 ×7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g KCl, 12 mM Tris-HClpH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution, 1.0 ml trace elementsolution, 5.0 g casamino acids, 0.125 ml 6.4 mg/mlthiamine solution, and 0.125 ml 0.8 mg/ml biotin solutionper liter.A basal-salts starvation medium (Hv-starve) containedall components in Hv-YPC other than complex nutrients(i.e., yeast extract, casamino acids and peptone). Solidmedia contained 18 g of agar per liter. When required,uracil was provided at 50 μg/ml (ΔpyrE2 strains), thymidineand hypoxanthine at 40 μg/ml (ΔhdrB strains), tryptophanat 50 μg/ml (ΔtrpA strains), and novobiocin at 0.30 μg/mlfor antibiotic selection.Development of GFP-expressing Haloferax volcaniiH1206 strainTwo H. volcanii uracil auxotrophic strains were developedfor constitutive GFP-expression and cell imaging by CLSMand epifluorescence microscopy (see Additional file 1:Table S2). The strain H1206(pJAM1020) was based onselection through novobiocin resistance using a previouslydeveloped vector [59], and a second strain H1206(pSC409GFP) was based on the gene pyrE2 and uracilautotrophy [44,46,47]. Plasmid pSC409GFP was constructedby amplifying the region from pJAM1020containing red-shifted GFP and P2 promoter for constitutiveexpression in haloarchaeal species [59], andinserting this construct into the shuttle vector pTA409[101] (see Additional file 1: Tables S2 and S3). Each plasmidwas transformed into the strain H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)using the PEG-based method as previously developed[49,102,103], and transformants were selected on Hv-Ca medium without uracil for H1206(pSC409GFP) orcontaining novobiocin for H1206(pJAM1020). H. volcaniiH1206 is identical to H26 other than an additional deletionof the mrr gene, which encodes a restriction endonucleasethat cleaves methylated foreign DNA, allowing transformationwithout passage through an Escherichia coli dammutant [46]. Growth kinetics of each GFP strain in liquidHv-YPC medium were measured by optical density andwere unchanged from the parental strain.Biofilm growth systemsThe media described above were prepared and used tocultivate H. volcanii biofilms using the experimentalgrowth methods described below. All biofilms were incubatedat 42°C unless otherwise stated.Colony biofilmsColony biofilms as shown in Figure 1B were prepared on13-mm polycarbonate filters (0.2-μm pore size, Sigma,St. Louis, MO, Z365041) as previously described [7,23]. DilutedH. volcanii culture (OD 600 nm = 0.1) was transferredonto the surface of sterile filters previously placed directlyon the surface of the solid medium with sterile forceps.After the culture medium penetrated the filter and evaporated,the plates were inverted and incubated. Filters weretransferred to fresh plates under sterile conditions every48 h during the growth period.Static liquid biofilmsSL-biofilms were set up by aliquoting inoculated growthmedium into six-well plates and Petri dishes (as inFigures 1C, 2K and 4, and see Additional files 3, 4, 5, 6 and7: Movies 2–6), or chamber slides (Lab-Tek II, with 0.7 cm2growth area per well; as in the top left panel of Figure 1Cand Figure 2I,J). A borosilicate glass coupon (BiosurfacesTechnologies Corporation, Bozeman, MT, RD 128-GL) or apiece of coverglass was placed inside the six-well plates (asin Figure 1C) to provide a biofilm growth surface that couldbe visualized directly through microscopy.Biofilm staining and microscopy preparationThe properties and experimental parameters used for alldyes in this study are summarized in Additional file 1:Table S1. The final concentration of each staining solutionwas optimized based on either the manufacturer’sprotocol or a previous study. CR staining was performedusing the alkaline CR method [104,105]. Biofilms wereทิ้งคราบ และเตรียมพร้อมสำหรับ microscopy อธิบายไว้ด้านล่างสำหรับแต่ละวิธีการเจริญเติบโตBiofilms อาณานิคมBiofilms อาณานิคมผู้ใหญ่มีสี โดยถ่ายโอนเป็นโซลูชันในอด Hv โดยตรงในด้านของการย้อมสีbiofilm อาณานิคมและ incubating ที่อุณหภูมิห้องสำหรับ 60 นาทีข้ามส่วนของ biofilms อาณานิคมทิ้งคราบ
การแปล กรุณารอสักครู่..
วิธี
สายพันธุ์และวัฒนธรรมสื่อ
เอช volcanii สายพันธุ์ (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S2)
มีให้โดย Thorsten Allers ของมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม, สหราชอาณาจักรและเติบโตขึ้นในสื่อที่ดัดแปลงมาจากที่ก่อนหน้านี้
การศึกษา [47] กลางรวย (HV-YPC) มี 144 กรัม
โซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 × 7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม
KCl, 12 มิลลิ Tris-HCl พีเอช 7.5, 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2,
1.0 ml ติดตามการแก้ปัญหาองค์ประกอบ 5.0 กรัมสารสกัดจากยีสต์,
1.0 กรัมกรดซามิโนและเปปโตน 1.0 กรัมต่อลิตร HV-YPC
ใช้ในการไบโอฟิล์มวัฒนธรรม GFP สำหรับการย้อมสีเป็นกำไรต่อหุ้นยังมี
น้ำตาลกลูโคส 0.5%.
กลาง HV-Ca บรรจุ 144 กรัมโซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 ×
7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม KCl, 12 mM Tris-HCl
ค่า pH 7.5 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2 1.0 มลธาตุ
แก้ปัญหา 5.0 กรัมกรดซามิ, 0.125 มล 6.4 mg / ml
แก้ปัญหาวิตามินบีและ 0.125 มล 0.8 mg / แก้ปัญหาไบโอตินมิลลิลิตร
ต่อลิตร.
ฐาน-เกลือกลางอดอยาก (HV-อด) มี
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV-YPC อื่น ๆ นอกเหนือจากสารอาหารที่ซับซ้อน
(เช่นสารสกัดจากยีสต์, กรดซามิและเปปโตน) ของแข็ง
สื่อที่มี 18 กรัมของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อลิตร เมื่อต้อง
ถูกจัดให้ uracil ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔpyrE2) thymidine
และ hypoxanthine ที่ 40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔhdrB), โพรไบโอ
ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔtrpA) และ novobiocin ที่ 0.30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
สำหรับการเลือกยาปฏิชีวนะ .
การพัฒนา GFP-แสดง Haloferax volcanii
ความเครียด H1206
สอง H. volcanii uracil auxotrophic สายพันธุ์ได้รับการพัฒนา
สำหรับส่วนประกอบแสดงออก GFP และการถ่ายภาพมือถือโดย CLSM
และกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S2) H1206 ความเครียด (pJAM1020) ก็ขึ้นอยู่กับ
ตัวเลือกผ่านความต้านทาน novobiocin ใช้ก่อนหน้านี้
ได้รับการพัฒนาเวกเตอร์ [59] และสายพันธุ์ที่สอง H1206
(pSC409GFP) ก็ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracil
autotrophy [44,46,47] พลาสมิด pSC409GFP ถูกสร้างขึ้น
โดยขยายภูมิภาคจาก pJAM1020
มีโปรโมเตอร์แดงขยับ GFP และ P2 เป็นส่วนประกอบสำหรับ
การแสดงออกในรูป haloarchaeal [59] และ
ใส่นี้สร้างเป็นรถรับส่งเวกเตอร์ pTA409
[101] (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1 ตาราง S2 และ S3 ) พลาสมิดแต่ละ
ก็กลายเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2Δmrr)
โดยใช้วิธี PEG-based เช่นการพัฒนาก่อนหน้านี้
[49102103] และ transformant ที่ได้รับการคัดเลือกใน Hv-
Ca กลางโดยไม่ต้อง uracil สำหรับ H1206 (pSC409GFP) หรือ
ที่มี novobiocin สำหรับ H1206 (pJAM1020) H. volcanii
H1206 เป็นเหมือน H26 อื่น ๆ นอกเหนือจากการลบเพิ่มเติม
ของยีน MRR ซึ่ง encodes endonuclease ข้อ จำกัด
ที่แข็งกระด้าง methylated ดีเอ็นเอต่างประเทศช่วยให้การเปลี่ยนแปลง
ได้โดยไม่ต้องผ่านทาง Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลว
กลาง HV-YPC ถูกวัดโดยความหนาแน่นของแสงและ
มีการเปลี่ยนแปลงไปจากสายพันธุ์ของพ่อแม่.
Biofilm ระบบการเจริญเติบโตของ
สื่ออธิบายไว้ข้างต้นได้รับการเตรียมความพร้อมและใช้ในการ
เพาะปลูก H. volcanii ไบโอฟิล์มโดยใช้การทดลอง
วิธีการเจริญเติบโตอธิบายไว้ด้านล่าง ไบโอฟิล์มทั้งหมดถูกบ่ม
ที่อุณหภูมิ 42 ° C ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
อาณานิคมไบโอฟิล์มดังแสดงในรูปที่ 1B ถูกจัดทำขึ้นใน
13 มมฟิลเตอร์โพลีคาร์บอเนต (0.2 ไมครอนขนาดรูขุมขน, Sigma,
เซนต์หลุยส์, MO, Z365041) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 7,23] ปรับลด
เอช วัฒนธรรม volcanii (OD 600 นาโนเมตร = 0.1) ถูกย้าย
ลงบนพื้นผิวของตัวกรองผ่านการฆ่าเชื้อก่อนหน้านี้วางโดยตรง
บนพื้นผิวของสื่อที่เป็นของแข็งที่มีคีมหมัน.
หลังจากอาหารเลี้ยงเชื้อทะลุตัวกรองและระเหย
แผ่นถูกคว่ำและบ่ม กรองถูก
ถ่ายโอนไปยังแผ่นสดภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อทุก
48 ชั่วโมงในช่วงระยะเวลาการเจริญเติบโต.
ของเหลวคงไบโอฟิล์ม
SL-ไบโอฟิล์มได้รับการจัดตั้งขึ้นโดย aliquoting เชื้อเจริญเติบโตของ
กลางเป็นแผ่นหกดีและจานเลี้ยงเชื้อ (เช่นใน
รูปที่ 1C, 2K และ 4 และ ดูแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ
7: ภาพยนตร์ 2-6) หรือภาพนิ่งห้อง (Lab เต็กครั้งที่สอง 0.7 cm2
พื้นที่การเจริญเติบโตต่อกันในขณะที่แผงด้านซ้ายบนของรูป 1C
และรูปที่ 2I, J ) แก้ว borosilicate คูปอง (Biosurfaces
เทคโนโลยีคอร์ปอเรชั่น Bozeman, MT, RD 128-GL) หรือ
ชิ้นส่วนของ coverglass ถูกวางไว้ภายในแผ่นหกดี (เช่น
ในรูปที่ 1C) เพื่อให้พื้นผิวการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มที่สามารถ
มองเห็นได้โดยตรงผ่านกล้องจุลทรรศน์ .
การย้อมสีและการจัดเตรียม Biofilm กล้องจุลทรรศน์
คุณสมบัติและพารามิเตอร์การทดลองใช้สำหรับทุก
สีย้อมในการศึกษานี้ได้สรุปไว้ในแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S1 ความเข้มข้นสุดท้ายของการแก้ปัญหาการย้อมสีแต่ละ
ถูกปรับให้เหมาะสมขึ้นอยู่กับอย่างใดอย่างหนึ่งของผู้ผลิต
โปรโตคอลหรือศึกษาก่อนหน้านี้ การย้อมสี CR ถูกดำเนินการ
โดยใช้วิธีการ CR ด่าง [104,105] ไบโอฟิล์มได้รับการ
ย้อมสีและเตรียมพร้อมสำหรับการใช้กล้องจุลทรรศน์ตามที่อธิบายไว้ข้างล่างนี้
สำหรับวิธีการเจริญเติบโตของแต่ละ.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
ไบโอฟิล์มอาณานิคมผู้ใหญ่มีการย้อมโดยการโอน
การแก้ปัญหาการย้อมสีใน HV-อดกลางตรงด้านบนของ
ไบโอฟิล์มอาณานิคมและการบ่มที่อุณหภูมิห้อง
เป็นเวลา 60 นาที ส่วนครอสของไบโอฟิล์มอาณานิคมเปื้อน
สายพันธุ์และวัฒนธรรมสื่อ
เอช volcanii สายพันธุ์ (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S2)
มีให้โดย Thorsten Allers ของมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม, สหราชอาณาจักรและเติบโตขึ้นในสื่อที่ดัดแปลงมาจากที่ก่อนหน้านี้
การศึกษา [47] กลางรวย (HV-YPC) มี 144 กรัม
โซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 × 7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม
KCl, 12 มิลลิ Tris-HCl พีเอช 7.5, 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2,
1.0 ml ติดตามการแก้ปัญหาองค์ประกอบ 5.0 กรัมสารสกัดจากยีสต์,
1.0 กรัมกรดซามิโนและเปปโตน 1.0 กรัมต่อลิตร HV-YPC
ใช้ในการไบโอฟิล์มวัฒนธรรม GFP สำหรับการย้อมสีเป็นกำไรต่อหุ้นยังมี
น้ำตาลกลูโคส 0.5%.
กลาง HV-Ca บรรจุ 144 กรัมโซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 ×
7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม KCl, 12 mM Tris-HCl
ค่า pH 7.5 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2 1.0 มลธาตุ
แก้ปัญหา 5.0 กรัมกรดซามิ, 0.125 มล 6.4 mg / ml
แก้ปัญหาวิตามินบีและ 0.125 มล 0.8 mg / แก้ปัญหาไบโอตินมิลลิลิตร
ต่อลิตร.
ฐาน-เกลือกลางอดอยาก (HV-อด) มี
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV-YPC อื่น ๆ นอกเหนือจากสารอาหารที่ซับซ้อน
(เช่นสารสกัดจากยีสต์, กรดซามิและเปปโตน) ของแข็ง
สื่อที่มี 18 กรัมของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อลิตร เมื่อต้อง
ถูกจัดให้ uracil ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔpyrE2) thymidine
และ hypoxanthine ที่ 40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔhdrB), โพรไบโอ
ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔtrpA) และ novobiocin ที่ 0.30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
สำหรับการเลือกยาปฏิชีวนะ .
การพัฒนา GFP-แสดง Haloferax volcanii
ความเครียด H1206
สอง H. volcanii uracil auxotrophic สายพันธุ์ได้รับการพัฒนา
สำหรับส่วนประกอบแสดงออก GFP และการถ่ายภาพมือถือโดย CLSM
และกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S2) H1206 ความเครียด (pJAM1020) ก็ขึ้นอยู่กับ
ตัวเลือกผ่านความต้านทาน novobiocin ใช้ก่อนหน้านี้
ได้รับการพัฒนาเวกเตอร์ [59] และสายพันธุ์ที่สอง H1206
(pSC409GFP) ก็ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracil
autotrophy [44,46,47] พลาสมิด pSC409GFP ถูกสร้างขึ้น
โดยขยายภูมิภาคจาก pJAM1020
มีโปรโมเตอร์แดงขยับ GFP และ P2 เป็นส่วนประกอบสำหรับ
การแสดงออกในรูป haloarchaeal [59] และ
ใส่นี้สร้างเป็นรถรับส่งเวกเตอร์ pTA409
[101] (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1 ตาราง S2 และ S3 ) พลาสมิดแต่ละ
ก็กลายเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2Δmrr)
โดยใช้วิธี PEG-based เช่นการพัฒนาก่อนหน้านี้
[49102103] และ transformant ที่ได้รับการคัดเลือกใน Hv-
Ca กลางโดยไม่ต้อง uracil สำหรับ H1206 (pSC409GFP) หรือ
ที่มี novobiocin สำหรับ H1206 (pJAM1020) H. volcanii
H1206 เป็นเหมือน H26 อื่น ๆ นอกเหนือจากการลบเพิ่มเติม
ของยีน MRR ซึ่ง encodes endonuclease ข้อ จำกัด
ที่แข็งกระด้าง methylated ดีเอ็นเอต่างประเทศช่วยให้การเปลี่ยนแปลง
ได้โดยไม่ต้องผ่านทาง Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลว
กลาง HV-YPC ถูกวัดโดยความหนาแน่นของแสงและ
มีการเปลี่ยนแปลงไปจากสายพันธุ์ของพ่อแม่.
Biofilm ระบบการเจริญเติบโตของ
สื่ออธิบายไว้ข้างต้นได้รับการเตรียมความพร้อมและใช้ในการ
เพาะปลูก H. volcanii ไบโอฟิล์มโดยใช้การทดลอง
วิธีการเจริญเติบโตอธิบายไว้ด้านล่าง ไบโอฟิล์มทั้งหมดถูกบ่ม
ที่อุณหภูมิ 42 ° C ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
อาณานิคมไบโอฟิล์มดังแสดงในรูปที่ 1B ถูกจัดทำขึ้นใน
13 มมฟิลเตอร์โพลีคาร์บอเนต (0.2 ไมครอนขนาดรูขุมขน, Sigma,
เซนต์หลุยส์, MO, Z365041) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 7,23] ปรับลด
เอช วัฒนธรรม volcanii (OD 600 นาโนเมตร = 0.1) ถูกย้าย
ลงบนพื้นผิวของตัวกรองผ่านการฆ่าเชื้อก่อนหน้านี้วางโดยตรง
บนพื้นผิวของสื่อที่เป็นของแข็งที่มีคีมหมัน.
หลังจากอาหารเลี้ยงเชื้อทะลุตัวกรองและระเหย
แผ่นถูกคว่ำและบ่ม กรองถูก
ถ่ายโอนไปยังแผ่นสดภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อทุก
48 ชั่วโมงในช่วงระยะเวลาการเจริญเติบโต.
ของเหลวคงไบโอฟิล์ม
SL-ไบโอฟิล์มได้รับการจัดตั้งขึ้นโดย aliquoting เชื้อเจริญเติบโตของ
กลางเป็นแผ่นหกดีและจานเลี้ยงเชื้อ (เช่นใน
รูปที่ 1C, 2K และ 4 และ ดูแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ
7: ภาพยนตร์ 2-6) หรือภาพนิ่งห้อง (Lab เต็กครั้งที่สอง 0.7 cm2
พื้นที่การเจริญเติบโตต่อกันในขณะที่แผงด้านซ้ายบนของรูป 1C
และรูปที่ 2I, J ) แก้ว borosilicate คูปอง (Biosurfaces
เทคโนโลยีคอร์ปอเรชั่น Bozeman, MT, RD 128-GL) หรือ
ชิ้นส่วนของ coverglass ถูกวางไว้ภายในแผ่นหกดี (เช่น
ในรูปที่ 1C) เพื่อให้พื้นผิวการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มที่สามารถ
มองเห็นได้โดยตรงผ่านกล้องจุลทรรศน์ .
การย้อมสีและการจัดเตรียม Biofilm กล้องจุลทรรศน์
คุณสมบัติและพารามิเตอร์การทดลองใช้สำหรับทุก
สีย้อมในการศึกษานี้ได้สรุปไว้ในแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S1 ความเข้มข้นสุดท้ายของการแก้ปัญหาการย้อมสีแต่ละ
ถูกปรับให้เหมาะสมขึ้นอยู่กับอย่างใดอย่างหนึ่งของผู้ผลิต
โปรโตคอลหรือศึกษาก่อนหน้านี้ การย้อมสี CR ถูกดำเนินการ
โดยใช้วิธีการ CR ด่าง [104,105] ไบโอฟิล์มได้รับการ
ย้อมสีและเตรียมพร้อมสำหรับการใช้กล้องจุลทรรศน์ตามที่อธิบายไว้ข้างล่างนี้
สำหรับวิธีการเจริญเติบโตของแต่ละ.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
ไบโอฟิล์มอาณานิคมผู้ใหญ่มีการย้อมโดยการโอน
การแก้ปัญหาการย้อมสีใน HV-อดกลางตรงด้านบนของ
ไบโอฟิล์มอาณานิคมและการบ่มที่อุณหภูมิห้อง
เป็นเวลา 60 นาที ส่วนครอสของไบโอฟิล์มอาณานิคมเปื้อน
การแปล กรุณารอสักครู่..
วิธี
สื่อวัฒนธรรม h volcanii สายพันธุ์และสายพันธุ์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S1 )
มีให้โดย Thorsten ออลเลิร์สแห่งมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม , UK , และเติบโตในสื่อที่ดัดแปลงจากการศึกษาก่อนหน้า
[ 47 ] รวยปานกลาง ( HV ypc ) มีขนาด 144 g
21 กรัม MgSO4 ใ× 7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 g
12 มม. หรือกรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น
1.0 มิลลิลิตรสารละลายธาตุ 50 กรัมยีสต์สกัด กรด casamino
1.0 กรัม ตามลำดับ และ 1.0 กรัมต่อลิตร HV ypc
ใช้ GFP ไบโอฟิล์มวัฒนธรรมสำหรับ EPS staining ยังมีกลูโคส 0.5 %
.
HV CA กลางที่มีอยู่ 144 g NaCl , 21 กรัม MgSO4 ใ×
7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 กรัม 12 มม. หรือ HCl
pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น 1.0 มล. ธาตุ
โซลูชั่น 5.0 กรัมกรด casamino 0.125 มล. 6.4 มก. / มล.
วิตามินบีโซลูชั่นและ 0.125 มล. 08 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรต่อลิตร biotin โซลูชั่น
.
แรกเริ่ม เกลือการอดปานกลาง ( HV อดอาหาร ) ที่มีอยู่
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV ypc นอกจากซับซ้อนรัง
( เช่น สารสกัดจากยีสต์และกรด casamino extract ) สื่อบรรจุ 18 กรัมของแข็ง
วุ้นต่อลิตร เมื่อต้องการ
ยูราซิลให้ที่ 50 μ g / ml ( Δ pyre2 สายพันธุ์ ) , เพียง และไฮโปแซนทีนที่ 40 μ
g / ml ( Δทริป
hdrb สายพันธุ์ )50 μ g / ml ( Δ trpa สายพันธุ์ ) และโนโวไบโอซินที่ 0.30 μ g / ml
เลือกยาปฏิชีวนะ การพัฒนาของ GFP แสดง haloferax volcanii
2 H h1206 เมื่อย volcanii ยูราซิล auxotrophic สายพันธุ์ที่พัฒนาสำหรับการแสดงออกของ GFP
และภาพในเซลล์ โดย clsm
epifluorescence และกล้องจุลทรรศน์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1
ตาราง S1 ) สายพันธุ์ h1206 ( pjam1020 ) ขึ้นอยู่กับ
เลือกผ่านโนโวไบโอซินต้านทานการใช้ก่อนหน้านี้
พัฒนาเวกเตอร์ [ 59 ] , และสองสายพันธุ์ h1206
( psc409gfp ) บนพื้นฐานของยีนและ pyre2 ยูราซิล
ออโตทรอพ [ 44,46,47 ] พลาสมิด psc409gfp ถูกสร้างขึ้นโดยขยายพื้นที่จาก pjam1020
ที่มีสีแดงขยับ GFP และผู้ก่อการ P2 สำหรับพฤติกรรมการแสดงออกใน haloarchaeal
[ ]
59 ชนิด และใส่นี้สร้างเป็นรถเวกเตอร์ pta409
[ 101 ] ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S2 และ S3 ) แต่ละสายพันธุ์
กลายเป็นความเครียด h1206 ( Δ pyre2 Δ MRR )
ใช้หมุดตามวิธีที่เคยพัฒนา 49102103
[ ] , และพลาสมิดถูกเลือกใน HV -
CA กลางโดยไม่ Name สำหรับ h1206 ( psc409gfp ) หรือ
ที่มีโนโวไบโอซินสำหรับ h1206 ( pjam1020 ) volcanii
hh1206 เป็นเหมือน h26 นอกเหนือจาก
ลบเพิ่มเติมของเป็นยีนที่เข้ารหัสเป็นดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
คลีฟส์ต่างประเทศ methylated ให้เปลี่ยนแปลง
โดยไม่ผ่านการเชื้อ Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [ 46 ] จลนศาสตร์การเจริญเติบโตของ GFP ในแต่ละสายพันธุ์ของเหลว
HV ypc กลางวัดความหนาแน่นของแสงและ
อยู่ไม่เปลี่ยนแปลงจากสายพันธุ์พ่อแม่
ระบบการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์ม
สื่อที่อธิบายข้างต้นถูกเตรียมและใช้
ฝึกฝน . volcanii ไบโอฟิล์มใช้วิธีการทดลอง
การเจริญเติบโตที่อธิบายไว้ด้านล่าง ทั้งหมดอยู่ที่ 42 องศาไบโอฟิล์มบ่ม
c เว้นแต่ที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ไบโอฟิล์ม
อาณานิคมอาณานิคมไบโอฟิล์ม ดังแสดงในรูปที่ 1 บีเตรียมบน
13 มม. โพลีคาร์บอเนตกรอง ( 0.2 - μ M รูขุมขนขนาด , Sigma ,
เซนต์ หลุยส์ โม z365041 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 723 ] เจือจาง
h volcanii วัฒนธรรม ( OD 600 nm = 0.1 ) โอน
ลงบนพื้นผิวของตัวกรองที่วางอยู่โดยตรงก่อนหน้านี้เป็นหมัน
บนพื้นผิวของตัวกลางที่เป็นของแข็งได้ด้วยคีมเป็นหมัน .
หลังจากสื่อวัฒนธรรม เจาะกรองและระเหย
จานถูกเอามาบ่ม ตัวกรองที่ถูกโอนไปยังจาน
สดภายใต้สภาพปลอดเชื้อทุก 48 ชั่วโมงในช่วง
)ไฟฟ้าสถิตไบโอฟิล์ม
เหลว SL ไบโอฟิล์มถูกสร้างขึ้นโดย aliquoting จากอาหารเลี้ยงเชื้อ
ออกเป็นหกดีจานและจานเลี้ยงเชื้อ ( เช่น
ตัวเลข 1C , 2K และ 4 และดูไฟล์เพิ่มเติม 3 , 4 , 5 , 6 และ 7
: ดูหนัง 2 – 6 ) หรือภาพนิ่ง ( ห้องแล็ปเทค 2 กับ 7 CM2
การเจริญเติบโตพื้นที่ต่อได้ดี เช่นเดียวกับในแผงด้านบนซ้ายของรูป และรูป 2i
c , J ) เป็นแก้ว Borosilicate คูปอง ( biosurfaces
บริษัทเทคโนโลยีโบซแมน , MT , RD 128-gl ) หรือ
ชิ้น coverglass ถูกใส่ไว้ข้างในด้วย (
6 แผ่นในรูป 1C ) กล่าวคือพื้นผิวที่สามารถให้การมองเห็นโดยตรงผ่านกล้องจุลทรรศน์
.
ฟิล์ม staining และกล้องจุลทรรศน์การเตรียม
คุณสมบัติและพารามิเตอร์ทดลองใช้สีทั้งหมด
ในการศึกษานี้สรุปได้ ในแฟ้มอีก 1 :
ตาราง S1 .ความเข้มข้นของสารละลายแต่ละชนิดสุดท้าย
ก็เหมาะตามอย่างใดอย่างหนึ่งของผู้ผลิต
โปรโตคอลหรือการศึกษาก่อนหน้า CR staining แสดง
โดยใช้วิธี 104105 ด่าง [ CR ] ไบโอฟิล์ม (
เปรอะเปื้อนและเตรียมปตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
ของแต่ละวิธี อาณานิคมไบโอฟิล์ม
ผู้ใหญ่อาณานิคมไบโอฟิล์มถูกย้อมโดยย้าย
การแก้ไขในบทความอดอาหารกลางโดยตรงด้านบนของ
อาณานิคมและฟิล์ม เพาะที่
อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 60 นาที ข้ามส่วนของอาณานิคมไบโอฟิล์มเปื้อน
สื่อวัฒนธรรม h volcanii สายพันธุ์และสายพันธุ์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S1 )
มีให้โดย Thorsten ออลเลิร์สแห่งมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม , UK , และเติบโตในสื่อที่ดัดแปลงจากการศึกษาก่อนหน้า
[ 47 ] รวยปานกลาง ( HV ypc ) มีขนาด 144 g
21 กรัม MgSO4 ใ× 7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 g
12 มม. หรือกรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น
1.0 มิลลิลิตรสารละลายธาตุ 50 กรัมยีสต์สกัด กรด casamino
1.0 กรัม ตามลำดับ และ 1.0 กรัมต่อลิตร HV ypc
ใช้ GFP ไบโอฟิล์มวัฒนธรรมสำหรับ EPS staining ยังมีกลูโคส 0.5 %
.
HV CA กลางที่มีอยู่ 144 g NaCl , 21 กรัม MgSO4 ใ×
7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 กรัม 12 มม. หรือ HCl
pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น 1.0 มล. ธาตุ
โซลูชั่น 5.0 กรัมกรด casamino 0.125 มล. 6.4 มก. / มล.
วิตามินบีโซลูชั่นและ 0.125 มล. 08 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรต่อลิตร biotin โซลูชั่น
.
แรกเริ่ม เกลือการอดปานกลาง ( HV อดอาหาร ) ที่มีอยู่
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV ypc นอกจากซับซ้อนรัง
( เช่น สารสกัดจากยีสต์และกรด casamino extract ) สื่อบรรจุ 18 กรัมของแข็ง
วุ้นต่อลิตร เมื่อต้องการ
ยูราซิลให้ที่ 50 μ g / ml ( Δ pyre2 สายพันธุ์ ) , เพียง และไฮโปแซนทีนที่ 40 μ
g / ml ( Δทริป
hdrb สายพันธุ์ )50 μ g / ml ( Δ trpa สายพันธุ์ ) และโนโวไบโอซินที่ 0.30 μ g / ml
เลือกยาปฏิชีวนะ การพัฒนาของ GFP แสดง haloferax volcanii
2 H h1206 เมื่อย volcanii ยูราซิล auxotrophic สายพันธุ์ที่พัฒนาสำหรับการแสดงออกของ GFP
และภาพในเซลล์ โดย clsm
epifluorescence และกล้องจุลทรรศน์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1
ตาราง S1 ) สายพันธุ์ h1206 ( pjam1020 ) ขึ้นอยู่กับ
เลือกผ่านโนโวไบโอซินต้านทานการใช้ก่อนหน้านี้
พัฒนาเวกเตอร์ [ 59 ] , และสองสายพันธุ์ h1206
( psc409gfp ) บนพื้นฐานของยีนและ pyre2 ยูราซิล
ออโตทรอพ [ 44,46,47 ] พลาสมิด psc409gfp ถูกสร้างขึ้นโดยขยายพื้นที่จาก pjam1020
ที่มีสีแดงขยับ GFP และผู้ก่อการ P2 สำหรับพฤติกรรมการแสดงออกใน haloarchaeal
[ ]
59 ชนิด และใส่นี้สร้างเป็นรถเวกเตอร์ pta409
[ 101 ] ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S2 และ S3 ) แต่ละสายพันธุ์
กลายเป็นความเครียด h1206 ( Δ pyre2 Δ MRR )
ใช้หมุดตามวิธีที่เคยพัฒนา 49102103
[ ] , และพลาสมิดถูกเลือกใน HV -
CA กลางโดยไม่ Name สำหรับ h1206 ( psc409gfp ) หรือ
ที่มีโนโวไบโอซินสำหรับ h1206 ( pjam1020 ) volcanii
hh1206 เป็นเหมือน h26 นอกเหนือจาก
ลบเพิ่มเติมของเป็นยีนที่เข้ารหัสเป็นดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
คลีฟส์ต่างประเทศ methylated ให้เปลี่ยนแปลง
โดยไม่ผ่านการเชื้อ Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [ 46 ] จลนศาสตร์การเจริญเติบโตของ GFP ในแต่ละสายพันธุ์ของเหลว
HV ypc กลางวัดความหนาแน่นของแสงและ
อยู่ไม่เปลี่ยนแปลงจากสายพันธุ์พ่อแม่
ระบบการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์ม
สื่อที่อธิบายข้างต้นถูกเตรียมและใช้
ฝึกฝน . volcanii ไบโอฟิล์มใช้วิธีการทดลอง
การเจริญเติบโตที่อธิบายไว้ด้านล่าง ทั้งหมดอยู่ที่ 42 องศาไบโอฟิล์มบ่ม
c เว้นแต่ที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ไบโอฟิล์ม
อาณานิคมอาณานิคมไบโอฟิล์ม ดังแสดงในรูปที่ 1 บีเตรียมบน
13 มม. โพลีคาร์บอเนตกรอง ( 0.2 - μ M รูขุมขนขนาด , Sigma ,
เซนต์ หลุยส์ โม z365041 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 723 ] เจือจาง
h volcanii วัฒนธรรม ( OD 600 nm = 0.1 ) โอน
ลงบนพื้นผิวของตัวกรองที่วางอยู่โดยตรงก่อนหน้านี้เป็นหมัน
บนพื้นผิวของตัวกลางที่เป็นของแข็งได้ด้วยคีมเป็นหมัน .
หลังจากสื่อวัฒนธรรม เจาะกรองและระเหย
จานถูกเอามาบ่ม ตัวกรองที่ถูกโอนไปยังจาน
สดภายใต้สภาพปลอดเชื้อทุก 48 ชั่วโมงในช่วง
)ไฟฟ้าสถิตไบโอฟิล์ม
เหลว SL ไบโอฟิล์มถูกสร้างขึ้นโดย aliquoting จากอาหารเลี้ยงเชื้อ
ออกเป็นหกดีจานและจานเลี้ยงเชื้อ ( เช่น
ตัวเลข 1C , 2K และ 4 และดูไฟล์เพิ่มเติม 3 , 4 , 5 , 6 และ 7
: ดูหนัง 2 – 6 ) หรือภาพนิ่ง ( ห้องแล็ปเทค 2 กับ 7 CM2
การเจริญเติบโตพื้นที่ต่อได้ดี เช่นเดียวกับในแผงด้านบนซ้ายของรูป และรูป 2i
c , J ) เป็นแก้ว Borosilicate คูปอง ( biosurfaces
บริษัทเทคโนโลยีโบซแมน , MT , RD 128-gl ) หรือ
ชิ้น coverglass ถูกใส่ไว้ข้างในด้วย (
6 แผ่นในรูป 1C ) กล่าวคือพื้นผิวที่สามารถให้การมองเห็นโดยตรงผ่านกล้องจุลทรรศน์
.
ฟิล์ม staining และกล้องจุลทรรศน์การเตรียม
คุณสมบัติและพารามิเตอร์ทดลองใช้สีทั้งหมด
ในการศึกษานี้สรุปได้ ในแฟ้มอีก 1 :
ตาราง S1 .ความเข้มข้นของสารละลายแต่ละชนิดสุดท้าย
ก็เหมาะตามอย่างใดอย่างหนึ่งของผู้ผลิต
โปรโตคอลหรือการศึกษาก่อนหน้า CR staining แสดง
โดยใช้วิธี 104105 ด่าง [ CR ] ไบโอฟิล์ม (
เปรอะเปื้อนและเตรียมปตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
ของแต่ละวิธี อาณานิคมไบโอฟิล์ม
ผู้ใหญ่อาณานิคมไบโอฟิล์มถูกย้อมโดยย้าย
การแก้ไขในบทความอดอาหารกลางโดยตรงด้านบนของ
อาณานิคมและฟิล์ม เพาะที่
อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 60 นาที ข้ามส่วนของอาณานิคมไบโอฟิล์มเปื้อน
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- secretarial
- ครบรอบ2ปี 5เดือนเธอคือคนที่เข้ามาเติมชีว
- ฉันเคยส่งให้คุณแล้ว
- We had lots already
- วันนี้ฉันไม่ค่อยอยากตื่นเลย
- โอเค แต่ฉันอาจจะคุยกับคุณไม่เข้าใจ เพราะ
- penetration
- jack height
- Colorimetric method with Chlorophosphona
- ฉันตอบไม่ได้ คงเรียนเทอมนี้เสร็จ
- แต่ที่ฉันสัมผัสคุณเพราะฉันรักคุณมากและฉั
- somewhat
- ฉันจะกลับบ้านและใช้เวลากับครอบครัวมากที่
- 2 x "Smiling Fish" Fried Baby Clams with
- Bangkok is a long time?
- Will u marry me?
- 就大不一样了
- Organic chemistry
- because of the way that the indexes are
- Statement
- แม้ว่าเราต่างศาสนา แต่เราเป็นเพื่อนที่ดี
- indexes are structured.
- incoming
- ครบรอบ2ปี 5เดือนเธอคือคนที่เข้ามาเติมชีว
