(1995). After the preamplification

(1995). After the preamplification reaction, the reaction mixture was diluted to 150 μl with double distilled
H2O (dd H2O). The 10 μl PCR selective amplification system contained 1 μl of product from the diluted preamplification
reaction, 25 ng of both selective primers, 0.3 units of Taq DNA polymerase, 0.2 mM of each dNTP, 1.5 mM MgCl2 1X PCR buffer. All amplification reactions were performed in a Touch gene model thermocycler (Techne). Initially, three individuals from three studied strains were chosen to test the variation of 66 primer combinations (data not shown). With these individuals the polymorphism rates and the total number of bands with the 66 primer combinations were evaluated. The most useful primer combinations were considered those having the highest polymorphism rate that also
generate a reasonable number of clearly detectable total fragments. Using results from the evaluation of 66 primer combinations based on 3 individuals, the ten most-polymorphic primer combinations, producing clearly readable bands, were selected for the subsequent analyses with at least 30 samples. Gel analysis: An equal volume of loading buffer
(Formamide 10 ml, Xylene cyanol FF 10 mg, Bromophenol blue 10 mg, 0.5 M EDTA pH 8.0 200 μl) was added to each sample, and denatured at 95°C for 3 min then placed on ice for 2 min before loading. 4 μl of samples loaded onto 6% denaturing polyacrylamide gel matrix (7 M Urea; 19:1 Acrylamide: bis; 1X TBE buffer). The electrophoresis parameters were set to 75 Watt, 50°C and a run time of 1.5 hours was selected.Bands detected by the silver staining procedure
(Promega, Technical manual No.023) and gel images were scanned and saved as jpeg files for scoring and further
analysis. Two typical gels are shown in Figure 1a,b.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(1995) หลังจากปฏิกิริยา preamplification ผสมปฏิกิริยาถูกผสมกับ μl 150 กับคู่กลั่นเอชทูโอ (dd H2O) ระบบขยายงาน PCR μl 10 อยู่ 1 μl ผลิตภัณฑ์จาก preamplification แตกออกปฏิกิริยา 25 ng ของไพรเมอร์ทั้งสองเลือก Taq DNA พอลิเมอเรสหน่วย 0.3, 0.2 mM ของแต่ละ dNTP, 1.5 มม. MgCl2 บัฟเฟอร์ X PCR 1 ปฏิกิริยาขยายทั้งหมดถูกทำในการสัมผัสยีนรุ่น thermocycler (Techne) ตอนแรก สามคนจากสามสายพันธุ์ศึกษาได้เลือกการทดสอบความแปรปรวนของชุดพื้น 66 (ข้อมูลไม่แสดง) กับบุคคลเหล่านี้ ราคาโพลิมอร์ฟิซึมและวงกับชุดรองพื้น 66 จำนวนที่ประเมิน ผสมรองพื้นมีประโยชน์มากที่สุดได้ถือที่มีโพลิมอร์ฟิซึมสูงอัตราที่ยังสร้างจำนวนชิ้นส่วนทั้งหมดสามารถตรวจสอบได้อย่างชัดเจนเหมาะสม โดยใช้ผลจากการประเมินชุดพื้น 66 ตามบุคคลที่ 3 ชุดรองพื้นส่วนใหญ่ polymorphic สิบ ผลิตวงอ่านชัดเจน ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์ต่อด้วยตัวอย่างน้อย 30 เจลอาบน้ำวิเคราะห์: มีปริมาตรเท่ากับโหลดบัฟเฟอร์(Formamide 10 ml ไซ cyanol FF 10 mg, Bromophenol บลู 10 มก. 0.5 M EDTA pH 8.0 200 μl) ถูกเพิ่มเข้าไปแต่ละอย่าง และ denatured ที่ 95° C สำหรับ 3 นาที แล้ววางบนน้ำแข็ง 2 นาทีก่อนที่จะโหลด Μl 4 ตัวอย่างโหลดลง 6% denaturing เจ polyacrylamide เมตริกซ์ (7 M Urea; 19:1 อะคริลาไมด์: bis; 1 X TBE บัฟเฟอร์) Electrophoresis พารามิเตอร์ถูกตั้งค่า 75 วัตต์ 50° C และเลือกเวลา 1.5 ชั่วโมง วงที่ตรวจพบ โดยขั้นตอนการย้อมสีเงิน(Promega คู่มือเทคนิค No.023) และเจภาพสแกน และบันทึกเป็นไฟล์ jpeg สำหรับคะแนน และเพิ่มเติมวิเคราะห์ เจสองปกติจะแสดงในรูปที่ 1a, b

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( 1995 ) หลังจาก preamplification ปฏิกิริยา , ปฏิกิริยาผสมเจือจางกับ 150 μ L กับคู่กลั่น
H2O ( DD H2O ) 10 μผมเลือกแบบ PCR ระบบที่มีอยู่ 1 μลิตรของผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาเจือจาง preamplification
25 นาโนทั้งเลือกไพรเมอร์ 0.3 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค , 0.2 มม. ของแต่ละ dntp 1.5 มม. MgCl2 ใช้ PCR bufferปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนยีนทั้งหมดในสัมผัสแบบเทอร์โมไซเคล ์ ( techne ) ตอนแรก , สามบุคคลจากสามการศึกษาสายพันธุ์ เลือกที่จะทดสอบการเปลี่ยนแปลงของ 66 ผสมรองพื้น ( ข้อมูลไม่แสดง ) กับเหล่านี้แต่ละบุคคล - อัตราและจำนวนวง 66 ผสมรองพื้นถูกประเมินผสมรองพื้นที่มีประโยชน์มากที่สุด ถือว่าเป็นผู้ที่มีคะแนนสูงสุด ) ที่ยัง
สร้างเหมาะสมจำนวนชัดเจนได้ รวมเศษ การใช้ผลจากการประเมินของ 66 ชุดไพรเมอร์ ตาม 3 บุคคลสิบสายพันธุ์ส่วนใหญ่ผสมรองพื้นผลิตอย่างชัดเจนอ่านวงเลือกการวิเคราะห์ที่ตามมาด้วย อย่างน้อย 30 คน การวิเคราะห์เจล : ปริมาณเท่ากันของโหลดบัฟเฟอร์
( Formamide 10 มิลลิลิตร ไซลีน cyanol FF 10 mg , โบรโมฟีนอลบลู 10 mg 0.5 M EDTA pH 8.0 200 μ L ) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละตัวอย่าง และใช้ที่ 95 องศา C เป็นเวลา 3 นาที แล้ววางไว้บนน้ำแข็ง 2 นาทีก่อนการโหลด 4 μลิตรตัวอย่างที่โหลดลง 6% ี่ polyacrylamide gel matrix ( 7 M ยูเรีย ; 19 :1 อะคริลาไมด์ : ทวิ ; 1x ทีบีบัฟเฟอร์ ) วิธีพารามิเตอร์ถูกตั้งค่าที่ 75 วัตต์ 50 ° C และใช้เวลา 1.5 ชั่วโมงเลือก แถบตรวจโดยการย้อมสีเงินขั้นตอน
( promega , คู่มือ no.023 ทางเทคนิค ) และเจลภาพถูกสแกนและบันทึกเป็นไฟล์ JPEG สำหรับคะแนนและการวิเคราะห์ต่อไป

แบบสองเจลจะแสดงในรูปที่ 8 พ.