and should be used in the modified

and should be used in the modified assays discussed in Note 4. However, the quality of the dye is not critical for routine protein determination using the method described in this chapter. The data presented in Fig. 1 were obtained using Coomassie Brilliant Blue G ( C.I. 42655; product code B-0770, Sigma-Aldrich ).
6. Whenever possible the protein used to construct the calibration curve should be the same as that being determined. Often this is impractical and the dye response of a sample is quantified relative to that of a “generic” protein. Bovine serum albumin (BSA) is commonly used as the protein standard because it is inexpensive and readily available in a pure form. The major argument for using this protein is that it allows the results to be compared directly with those of the many previous studies that have used bovine serum albumin as a standard. However, it suffers from the disadvantage of exhibiting an unusually large dye response in the Bradford assay, and thus, may underestimate the protein content of a sample. Increasingly, bovine γ- globulin is being promoted as a more suitable general standard, as the dye binding capacity of this protein is closer to the mean of those proteins that have been compared (Table 2) . Because of the variation in response between different proteins, it is essential to specify the protein standard used when reporting measurements of protein amounts using the Bradford assay.
7. Generally, it is preferable to use a single new disposable polystyrene semimicrocuvette that is discarded after a series of absorbance measurements. Rinse the cuvette with reagent before use, zero the spectrophotometer on the reagent blank and then do not remove the cuvette from the machine. Replace the sample in the cuvette gently using a disposable polyethylene pipet.
8. The standard curve is nonlinear because of problems introduced by depletion of the amount of free dye. These problems can be avoided, and the linearity of the assay improved, by plotting the ratio of absorbances at 595 and 450 nm (15). If this approach is adopted, the absolute optical density of the free dye and dye–protein complex must be determined by measuring the absorbance of the mixture at each wavelength relative to that of a cuvette containing only water (and no dye reagent). As well as improving the linearity of the calibration curve, taking the ratio of the absorbances at the two wavelengths increases the accuracy and improves the sensitivity of the assay by up to 10-fold (15).
9. For routine measurement of the protein content of many samples the microassay may be adapted for use with a microplate reader (7,16). The total volume of the modified assay is limited to 210 μL by reducing the volume of each component. Ensure effective mixing of the assay components by pipetting up to 10 μL of the protein sample into each well before adding 200 μL of the dye reagent. If a wavelength of 595 nm cannot be selected on the microplate reader, absorbance may be measured at any wavelength between 570 nm and 610 nm. However, absorbance measurements at wavelengths other than 595 nm will decrease the sensitivity of response and may increase the minimum detection limit of the protocol.
10. For studies on the use of the Bradford assay in analyzing glycoproteins, see Note 9 in Chapter 3.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

และควรใช้ใน assays แก้ไขที่กล่าวในหมายเหตุ 4 อย่างไรก็ตาม คุณภาพของสีย้อมไม่ได้สำคัญสำหรับการกำหนดโปรตีนเป็นประจำโดยใช้วิธีการอธิบายไว้ในบทนี้ ข้อมูลที่นำเสนอใน Fig. 1 ได้รับมาใช้ Coomassie Brilliant Blue G (ซีไอกรุ๊ป 42655 รหัสสินค้า B-0770 ซิก Aldrich)6. หากเป็นไปได้ โปรตีนที่ใช้ในการสร้างเส้นโค้งเทียบควรเหมือนกับการกำหนด มักจะเป็นไปได้ยาก และการตอบสนองต่อสีของตัวอย่างจะ quantified สัมพันธ์ของโปรตีน "ทั่วไป" โดยทั่วไปจะใช้วัว serum albumin (บีเอสเอ) เป็นโปรตีนมาตรฐานเนื่องจากมีความพร้อมในรูปแบบที่บริสุทธิ์ และราคาไม่แพง อาร์กิวเมนต์ที่สำคัญสำหรับการใช้โปรตีนนี้เป็นที่จะช่วยให้ผลการเปรียบเทียบโดยตรงกับการศึกษาก่อนหน้านี้หลายที่ใช้วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน อย่างไรก็ตาม มัน suffers จากข้อเสียของอย่างมีระดับการตอบสนองที่ผิดปกติขนาดใหญ่ย้อมในวิเคราะห์แบรดฟอร์ด และ จึง อาจดูถูกดูแคลนโปรตีนของตัวอย่าง มาก วัวγกลอบูลินเป็นการส่งเสริมเป็นมาตรฐานทั่วไปเหมาะ เป็นกำลังผูกย้อมของโปรตีนนี้ใกล้ชิดกับ ค่าเฉลี่ยของโปรตีนเหล่านั้นที่ได้รับการเปรียบเทียบ (ตาราง 2) เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงในการตอบสนองระหว่างโปรตีนแตกต่างกัน มันเป็นสิ่งสำคัญเพื่อระบุโปรตีนมาตรฐานที่ใช้เมื่อรายงานประเมินของจำนวนโปรตีนที่ใช้ทดสอบแบรดฟอร์ด7. โดยทั่วไป ได้กว่าใช้ตัวเดียวใหม่ทิ้งโฟม semimicrocuvette ที่จะถูกยกเลิกหลังจากชุดของการวัด absorbance ล้าง cuvette กับรีเอเจนต์ก่อนใช้ ศูนย์เครื่องทดสอบกรดด่างในรีเอเจนต์ที่ว่าง และไม่เอา cuvette ที่จากเครื่อง แทนตัวอย่างใน cuvette เบา ๆ ใช้ pipet พลาสติกผ้าอ้อม8. เส้นโค้งมาตรฐานคือไม่เชิงเส้นเนื่องจากปัญหาที่นำมาใช้ โดยการลดลงของจำนวนสีฟรี สามารถหลีกเลี่ยงปัญหาเหล่านี้ และแบบดอกไม้ของการวิเคราะห์ที่ดี ขึ้น โดยพล็อตอัตราส่วนของ absorbances ที่ 595 และ 450 nm (15) ถ้านำวิธีการนี้ ความหนาแน่นออปติคอลเต็มฟรีย้อมและย้อม – โปรตีนเชิงซ้อนต้องถูกกำหนด โดยการวัด absorbance ของส่วนผสมในแต่ละความยาวคลื่นสัมพันธ์ของ cuvette ที่ประกอบด้วยน้ำเท่านั้น (และไม่รีเอเจนต์ย้อม) รวมทั้งปรับปรุงแบบดอกไม้โค้งเทียบ อัตราส่วนของการ absorbances ที่ความยาวคลื่นที่สองเพิ่มความถูกต้อง และเพิ่มความไวของการทดสอบโดยการ 10-fold (15)9. สำหรับวัดประจำของโปรตีนหลายตัวอย่าง microassay ได้ดัดแปลงเพื่อใช้กับเครื่อง microplate อ่าน (7,16) ปริมาตรรวมของทดสอบปรับเปลี่ยนเป็นจำกัด 210 μL โดยการลดปริมาตรของแต่ละส่วน ให้มีประสิทธิภาพผสมประกอบทดสอบ ด้วย pipetting ถึง μL 10 ของตัวอย่างโปรตีนในแต่ละดีก่อนที่จะเพิ่ม μL 200 ของรีเอเจนต์การย้อม ถ้าความยาวคลื่นของ 595 nm ไม่เลือกอ่าน microplate อาจวัด absorbance ที่ความยาวคลื่นใด ๆ ระหว่าง 570 nm และ 610 nm อย่างไรก็ตาม วัด absorbance ที่ความยาวคลื่น 595 nm จะไม่ลดความไวของการตอบสนอง และอาจเพิ่มจำนวนต่ำสุดตรวจสอบโพรโทคอล10. การศึกษาการใช้วิเคราะห์แบรดฟอร์ดในวิเคราะห์ glycoproteins ดู 9 หมายเหตุในบทที่ 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

และควรจะนำมาใช้ในการตรวจแก้ไขกล่าวไว้ในหมายเหตุ 4 แต่คุณภาพของสีย้อมที่ไม่สำคัญสำหรับการกำหนดโปรตีนประจำโดยใช้วิธีการที่อธิบายในบทนี้ ข้อมูลที่นำเสนอในรูป 1 ที่ได้รับการใช้สีฟ้าสดใส Coomassie จี. (CI 42655 รหัสสินค้า B-0770, Sigma-Aldrich)
6 เมื่อใดก็ตามที่เป็นไปได้โปรตีนที่ใช้ในการสร้างกราฟมาตรฐานที่ควรจะเป็นเช่นเดียวกับที่ถูกกำหนด นี้มักจะทำไม่ได้และการตอบสนองของสีย้อมตัวอย่างที่มีการวัดเทียบกับที่ของ "ทั่วไป" โปรตีน ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) เป็นที่นิยมใช้เป็นมาตรฐานโปรตีนเพราะราคาไม่แพงและหาได้ง่ายในรูปแบบที่บริสุทธิ์ อาร์กิวเมนต์ที่สำคัญสำหรับการใช้โปรตีนนี้ก็คือว่ามันจะช่วยให้ผลที่จะนำมาเปรียบเทียบโดยตรงกับผู้ที่ศึกษาก่อนหน้านี้จำนวนมากที่มีการใช้ซีรั่มอัลบูมิวัวเป็นมาตรฐาน แต่ก็ทนทุกข์ทรมานจากข้อเสียของการจัดแสดงการตอบสนองย้อมขนาดใหญ่ผิดปกติในการทดสอบแบรดฟอจึงอาจประมาทปริมาณโปรตีนของตัวอย่าง เพิ่มมากขึ้นโกลบูลิγ-วัวจะถูกเลื่อนเป็นมาตรฐานทั่วไปที่เหมาะสมมากขึ้นเช่นสีย้อมกำลังการผลิตที่มีผลผูกพันของโปรตีนนี้อยู่ใกล้กับค่าเฉลี่ยของโปรตีนเหล่านั้นที่ได้รับการเปรียบเทียบ (ตารางที่ 2) เพราะการเปลี่ยนแปลงในการตอบสนองระหว่างโปรตีนที่แตกต่างกันก็เป็นสิ่งจำเป็นในการระบุมาตรฐานโปรตีนที่ใช้เมื่อรายงานการตรวจวัดปริมาณโปรตีนโดยใช้การทดสอบแบรดฟอ.
7 โดยทั่วไปจะเป็นที่นิยมในการใช้สไตรีน semimicrocuvette ใหม่ทิ้งเดียวที่จะถูกยกเลิกหลังจากที่ชุดของการวัดการดูดกลืนแสง cuvette ล้างด้วยน้ำยาก่อนที่จะใช้เป็นศูนย์ spectrophotometer ในน้ำยาว่างเปล่าแล้วไม่เอา cuvette จากเครื่อง แทนที่ตัวอย่างใน cuvette ที่เบา ๆ โดยใช้ปิเปตพลาสติกชนิดใช้แล้วทิ้ง.
8 โค้งมาตรฐานคือไม่เชิงเส้นเนื่องจากปัญหานำโดยลดลงของปริมาณของสีย้อมฟรี ปัญหาเหล่านี้สามารถหลีกเลี่ยงและเป็นเชิงเส้นของการทดสอบที่ดีขึ้นโดยการวางแผนอัตราส่วนของ absorbances ที่ 595 และ 450 นาโนเมตร (15) หากวิธีการนี้ถูกนำมาใช้ความหนาแน่นแสงสมบูรณ์ของสีย้อมสีย้อมฟรีและโปรตีนที่ซับซ้อนจะต้องมีการกำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสงของส่วนผสมในแต่ละความยาวคลื่นเทียบกับที่ cuvette มีน้ำเพียง (และน้ำยาย้อมไม่ได้) รวมทั้งการปรับปรุงเชิงเส้นของเส้นโค้งการสอบเทียบ, การอัตราส่วนของ absorbances ที่สองความยาวคลื่นเพิ่มความแม่นยำและช่วยเพิ่มความไวของการทดสอบได้ถึง 10 เท่า (15).
9 สำหรับการตรวจวัดตามปกติของปริมาณโปรตีนของกลุ่มตัวอย่างจำนวนมาก microassay อาจจะเหมาะสำหรับใช้กับผู้อ่าน microplate (ที่ 7,16) ปริมาณรวมของการทดสอบการแก้ไขจะถูก จำกัด 210 ไมโครลิตรโดยการลดปริมาณของแต่ละองค์ประกอบ ตรวจสอบให้แน่ใจผสมส่วนประกอบที่มีประสิทธิภาพของการทดสอบโดยการปิเปตได้ถึง 10 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างในแต่ละโปรตีนอย่างดีก่อนที่จะเพิ่ม 200 ไมโครลิตรของน้ำยาย้อม ถ้าความยาวคลื่น 595 นาโนเมตรไม่สามารถเลือกในการอ่าน microplate การดูดกลืนแสงอาจจะวัดที่ความยาวคลื่นระหว่าง 570 นาโนเมตรและ 610 นาโนเมตร อย่างไรก็ตามการวัดการดูดกลืนแสงในช่วงความยาวคลื่นอื่น ๆ กว่า 595 นาโนเมตรจะลดความไวของการตอบสนองและอาจเพิ่มการตรวจสอบวงเงินขั้นต่ำของโปรโตคอล.
10 สำหรับการศึกษาเกี่ยวกับการใช้งานของแบรดฟอการทดสอบในการวิเคราะห์ไกลโคโปรตีนให้ดูหมายเหตุ 9 ในบทที่ 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และควรจะใช้ในการปรับเปลี่ยนหรือกล่าวในหมายเหตุ 4 อย่างไรก็ตาม คุณภาพของสีที่ไม่สําคัญสําหรับการหาโปรตีนตามปกติโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ในบทนี้ ข้อมูลที่แสดงในรูปที่ 1 ได้รับใช้เหล่านี้น่าจะเป็น Brilliant Blue G ( สาย 42655 ; รหัสสินค้า b-0770 , Sigma ดิช )
6เมื่อใดก็ ตามที่เป็นไปได้ โปรตีนที่ใช้ในการสร้างรูปโค้งที่ควรจะเป็นเช่นเดียวกับที่ถูกกำหนดไว้ นี้มักจะเพ้อฝันและย้อม การตอบสนองของตัวอย่างเป็นปริมาณสัมพัทธ์กับโปรตีน " ทั่วไป " อัลบูมิน ( BSA ) เป็นที่นิยมใช้เป็นมาตรฐานโปรตีน เพราะมันไม่แพง และหาได้ง่ายในรูปแบบบริสุทธิ์เหตุผลหลักสำหรับการใช้โปรตีนนี้คือ ว่า มันช่วยให้มีผลเมื่อเทียบโดยตรงกับบรรดาหลายการศึกษาก่อนหน้านี้ที่ใช้อัลบูมินเป็นมาตรฐาน แต่มันทนทุกข์ทรมานจากข้อเสียของการจัดแสดงการย้อมขนาดใหญ่ผิดปกติในการทดสอบ แบรดฟอร์ด และดังนั้นจึง อาจประมาท โปรตีนในตัวอย่าง ยิ่งขึ้นγ - วัวที่ได้เลื่อนขั้นเป็นมากขึ้นเหมาะทั่วไปมาตรฐานเป็นสีย้อมผูก ความจุของโปรตีนนี้อยู่ใกล้กับค่าเฉลี่ยของโปรตีนที่ได้รับการเปรียบเทียบ ( ตารางที่ 2 ) เพราะการเปลี่ยนแปลงในการตอบสนองระหว่างโปรตีนที่แตกต่างกัน มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะระบุโปรตีนมาตรฐานที่ใช้เมื่อรายงานการวัดปริมาณโปรตีนโดยใช้วิธี Bradford .
7โดยทั่วไปจะดีกว่าที่จะใช้เป็นเดียวใหม่ทิ้งโฟม semimicrocuvette ที่ทิ้งหลังจากที่ชุดของการวัดการดูดกลืนแสง . ล้างคิวเวตต์กับสารเคมีก่อนที่จะใช้ศูนย์วัสดุที่ใช้เปล่าแล้วเอาคิวเวตต์ จากเครื่อง แทนตัวอย่างในคิวเวตเบาๆใช้ปิเปตพลาสติกใช้แล้วทิ้ง
8กราฟมาตรฐานเป็นเส้น เพราะปัญหาการแนะนำของจำนวนของสีที่ฟรี ปัญหาเหล่านี้สามารถหลีกเลี่ยงได้ และความถี่ของการทดสอบ โดยวางแผนปรับปรุงอัตราส่วนของ absorbances ที่และ 450 nm ( 15 ) ถ้าวิธีการนี้เป็นลูกบุญธรรมความหนาแน่นของแสงที่แน่นอนของสีย้อมและย้อมฟรี–โปรตีนคอมเพล็กซ์จะต้องกำหนดโดยการวัดการดูดกลืนแสงของส่วนผสมในแต่ละความยาวคลื่น เมื่อเทียบกับที่ของคิวเวตต์ที่มีน้ำเท่านั้น ( และไม่ย้อมสารเคมี ) รวมทั้งปรับปรุงความถี่ของการปรับเส้นโค้งใช้อัตราส่วนของ absorbances ที่สองความยาวคลื่นเพิ่มความถูกต้องและช่วยเพิ่มความไวของการทดสอบได้ถึง 10 เท่า ( 15 ) .
9 สำหรับการวัดปริมาณโปรตีนตัวอย่างหลาย microassay อาจจะเหมาะสำหรับการใช้กับเครื่องอ่านพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยรูทีน ( 7,16 ) ปริมาณรวมของแบบทดสอบ ( 210 μผมโดยการลดปริมาณของแต่ละองค์ประกอบให้ผสม ( คอมโพเนนต์โดย pipetting ถึง 10 μฉันของโปรตีนในตัวอย่าง กันก่อนที่จะเพิ่ม 200 μ L ของสีย้อมสารเคมีที่มีประสิทธิภาพ ถ้าความยาวคลื่น 595 nm ไม่สามารถเลือกได้ในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นอาจวัดได้ระหว่าง 570 นาโนเมตรและ 610 nm . อย่างไรก็ตามวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นมากกว่า 595 nm จะลดความไวในการตอบสนองและอาจเพิ่มขีดจำกัดต่ำสุดของโปรโตคอล
10 การศึกษาการใช้แบคทีเรียโปรตีนแบรดฟอร์ด ในการวิเคราะห์ เห็นประกาศในบทที่ 3
9 .