Polyhistidine-tags are often used f

Polyhistidine-tags are often used for affinity purification of polyhistidine-tagged recombinant proteins expressed in Escherichia coli [2] and other prokaryotic expression systems. Bacterial cells are harvested via centrifugation and the resulting cell pellet lysed either by physical means or by means of detergents and enzymes such as lysozyme or any combination of these. At this stage raw lysate contains the recombinant protein among many other proteins originating from the bacterial host. This mixture is incubated with an affinity resin containing bound bivalent nickel or cobalt ions, which are available commercially in different varieties. Nickel and cobalt have similar properties and as they are adjacent period 4 transition metals ((v. iron triad)). These resins are generally sepharose/agarose functionalised with a chelator, such as iminodiacetic acid (Ni-IDA) and nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) for nickel and carboxylmethylaspartate (Co-CMA) for cobalt, which the polyhistidine-tag binds with micromolar affinity. The resin is then washed with phosphate buffer to remove proteins that do not specifically interact with the cobalt or nickel ion. With Ni-based methods, washing efficiency can be improved by the addition of 20 mM imidazole (proteins are usually eluted with 150-300 mM imidazole). Generally nickel-based resins have higher binding capacity, while cobalt-based resins offer the highest purity. The purity and amount of protein can be assessed by SDS-PAGE and Western blotting.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มักจะใช้แท็ก Polyhistidine สำหรับฟอกความเกี่ยวข้องของแท็ก polyhistidine recombinant โปรตีนแสดงในระบบอื่น ๆ นิพจน์ prokaryotic และ Escherichia coli [2] เซลล์แบคทีเรียจะเก็บเกี่ยวผ่าน centrifugation และเม็ดเซลล์ผลลัพธ์ lysed โดยวิธีการทางกายภาพ หรือโดยการ ใช้ผงซักฟอกและเอนไซม์เช่น lysozyme หรือชุดของข้อมูลเหล่านี้ ในขั้นตอนนี้ดิบ lysate ประกอบด้วยโปรตีน recombinant ระหว่างหลายโปรตีนอื่น ๆ ที่เกิดจากเจ้าเชื้อแบคทีเรีย ส่วนผสมนี้เป็น incubated ด้วยเรซินเป็นความสัมพันธ์ที่ประกอบด้วยผูก bivalent นิกเกิลหรือโคบอลต์กัน แตกต่างกันใช้ในเชิงพาณิชย์ นิกเกิล และโคบอลต์มีคุณสมบัติคล้ายคลึงกันและมีระยะเวลาติดกัน 4 เปลี่ยนโลหะ ((v. เหล็ก triad)) เรซิ่นนี้จะ functionalised ทั่ว sepharose/agarose กับเป็น chelator กรด iminodiacetic (Ni-IDA) และกรด nitrilotriacetic (Ni-NTA) นิกเกิลและ carboxylmethylaspartate (Co-CMA) สำหรับโคบอลต์ ซึ่งแท็ก polyhistidine binds กับความสัมพันธ์ micromolar แล้วคราบยางไม้ ด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์การเอาโปรตีนที่ไม่เฉพาะโต้ตอบกับไอออนนิกเกิลหรือโคบอลต์ วิธีใช้ Ni ล้างประสิทธิภาพสามารถปรับปรุง โดยการเพิ่มของอิมิดาโซล 20 มม. (โปรตีนมักจะ eluted ด้วยอิมิดาโซล 150-300 มิลลิเมตร) โดยทั่วไปใช้นิกเกิลเรซิ่นมีผูกสูงกำลังการผลิต ในขณะที่เรซิ่นใช้โคบอลต์มีความบริสุทธิ์สูงสุด ความบริสุทธิ์และจำนวนโปรตีนสามารถถูกประเมิน โดย SDS หน้าและ blotting วิธีตะวันตก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

polyhistidine แท็มักจะใช้สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ความสัมพันธ์ของโปรตีน polyhistidine ติดแท็กแสดงใน Escherichia coli [2] และระบบอื่น ๆ การแสดงออกของโปรคาริโอ เซลล์แบคทีเรียจะเก็บเกี่ยวผ่านการหมุนเหวี่ยงและตะกอนเซลล์ที่เกิด lysed ทั้งโดยวิธีทางกายภาพหรือโดยวิธีการผงซักฟอกและเอนไซม์เช่น lysozyme หรือการรวมกันของเหล่านี้ ในขั้นตอนนี้ lysate ดิบมีโปรตีนโปรตีนในหมู่อื่น ๆ อีกมากมายที่มาจากโฮสต์แบคทีเรีย เรื่องนี้มีส่วนผสมบ่มกับเรซินสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดที่มีนิกเกิล bivalent ผูกพันหรือไอออนโคบอลต์ซึ่งมีให้บริการในเชิงพาณิชย์ในสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน นิกเกิลและโคบอลต์มีคุณสมบัติที่คล้ายกันและที่พวกเขามีช่วงเวลาที่อยู่ติดกัน 4 โลหะทรานซิชัน ((V สามเหล็ก.)) เรซินเหล่านี้โดยทั่วไป Sepharose / agarose functionalised กับ chelator เช่นกรด iminodiacetic (Ni-IDA) และกรด nitrilotriacetic (Ni-NTA) สำหรับนิกเกิลและ carboxylmethylaspartate (Co-CMA) สำหรับโคบอลต์ซึ่ง polyhistidine แท็กผูกกับความสัมพันธ์ของไมโครโม . เรซินจะล้างแล้วด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์เพื่อเอา​​โปรตีนที่ไม่เฉพาะโต้ตอบกับไอออนโคบอลต์หรือนิเกิล ด้วยวิธีการ Ni-based, ประสิทธิภาพการซักผ้าได้ดีขึ้นโดยการเพิ่มขึ้นของ 20 มมอิมิดาโซล (โปรตีนมักจะชะกับ 150-300 มิลลิ imidazole) โดยทั่วไปเรซินนิกเกิลตามมีกำลังการผลิตที่มีผลผูกพันที่สูงขึ้นในขณะที่เม็ดโคบอลต์ที่ใช้มีความบริสุทธิ์สูงสุด ความบริสุทธิ์และปริมาณของโปรตีนที่สามารถได้รับการประเมินโดยวิธี SDS-PAGE และวิธี western blotting

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

polyhistidine แท็กมักจะใช้สำหรับติดแท็กรีคอมบิแนนท์โปรตีนบริสุทธิ์ polyhistidine แสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli [ 2 ] และระบบการแสดงออกของโพรคาริโอติกอื่น ๆ เซลล์แบคทีเรียที่ถูกเก็บเกี่ยวผ่าน 3 และเกิดเซลล์เม็ด lysed ทั้งโดยวิธีทางกายภาพหรือโดยวิธีการของผงซักฟอกและเอนไซม์ เช่น ไลโซไซม์หรือการรวมกันของเหล่านี้ในขั้นตอนนี้ lysate ที่มีรีคอมบิแนนท์โปรตีนดิบของโปรตีนที่มาจากโฮสต์อื่น ๆอีกมากมาย แบคทีเรีย ส่วนผสมนี้จะแยกเป็นพี่น้องกันเรซินที่มีนิกเกิลโคบอลต์ไอออนไบวาเลนท์ หรือผูกพัน ซึ่งพร้อมใช้งานในเชิงพาณิชย์ในสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน นิกเกิลและโคบอลต์มีคุณสมบัติคล้ายคลึงกัน และมีระยะเวลาการเปลี่ยนโลหะติดกัน 4 ( V . แก๊งเหล็ก )เรซิ่นเหล่านี้มักจะเกี่ยวข้องกับแอลบูมิ functionalised / เดี่ยว เช่น กรด iminodiacetic ( Ni ไอด้า ) และกรดไนติโลไตรอะซิติก ( Ni NTA ) สำหรับนิกเกิลและ carboxylmethylaspartate ( CO CMA ) โคบอลต์ซึ่ง polyhistidine ป้ายผูกกับโลหะ 6 . เรซินเป็นแล้วล้างด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์เพื่อเอาโปรตีนที่ไม่เฉพาะโต้ตอบกับโคบอลต์หรือนิกเกิลไอออนผมใช้วิธีที่มีประสิทธิภาพที่สามารถปรับปรุงโดยการเพิ่มของ 20 mm อิมิดาโซล ( โปรตีนมักจะมีตัวอย่างกับ 150-300 มม. อิมิดาโซล ) โดยทั่วไปใช้เรซิ่นมีความจุสูงกว่านิกเกิลโคบอลต์จากการจับ ในขณะที่เม็ดมีความบริสุทธิ์สูงสุด ความบริสุทธิ์และปริมาณของโปรตีนที่สามารถประเมินถูก Western blotting .