3.2. C. vulgaris transformationPEG-

3.2. C. vulgaris transformation
PEG-mediated transformation has been demonstrated to be an effective
method to introduce genes into the protoplasts of microalgae,
which can be prepared by enzymatic cell wall removal [28,41]. In our
experiment, a combination of enzyme cocktail of cellulase, macerozyme
and pectinase proved effective to digest C. vulgaris cell wall, leading to
the production of over 80% protoplasts. The enzymatically prepared
protoplasts of C. vulgaris were transformed with plasmid pBI-EGFP by
using the PEG method, allowed to recover in non-selective medium
overnight for cell wall regeneration, and were then spread on selective
agar plates supplementedwith 30 μg/mL G418. After 2–3weeks of incubation,
G418-resistant colonies became visible on selective agar plates
(Fig. 3b).
To ensure that the emergence of these colonies is not caused by
spontaneous or induced mutation in algal cells that may confer resistance
to G418, protoplasts subjected to the same transformation procedure
but without addition of plasmid (hereinafter referred to as
untransformed protoplasts) were also plated onto selective agar plates
as a control. As expected, the untransformed protoplasts that were capable
of growing on non-selective agar plates could not survive under
selection of G418 (Fig. 3). The overall transformation efficiencywas calculated
and reached up to 356±30 colony forming units (cfu) per μg of
plasmid pBI-EGFP DNA. The G418-resistant colonies were restreaked
three times on selective agar plates, and then inoculated into selective
liquid media for the following characterization.
3.3. Characterization of transformants
Genomic DNA samples from wild type (WT) and G418-resistant
strains were analyzed by PCR amplification to examine the presence
of the EGFP gene. By using primers specific to the EGFP gene, two random
selected putative transformants, G1 and G2, both showed positive
signals observed as a band of expected size (730 bp), while WT lacked
the PCR product (Fig. 4a), indicating successful gene integration into
the C. vulgaris genome.
To provide more evidence for nuclear integration of the transgene,
southern blot analysis was performed on DNA samples prepared from
two above transformants and WT strain. Genomic DNA was digested
with EcoRI, and then hybridized with a 493-bp DIG-labeled probe specific
to the nptII gene. As expected, the positive control of plasmid
DNA sample showed a 14-kb band (Fig. 4b). Both transformants G1
and G2 showed positive signals observed as a single band of approximately
6 kb on their respective EcoRI-cleaved DNA profiles, while WT
showed no bands (Fig. 4b). These results further indicated that the
EGFP gene had been successfully integrated in the genome of C. vulgaris.
Also, EGFP steady-state mRNA levels were examined in both two
transformants by RT-PCR. The results showed that the 720-bp EGFP
gene was amplified in both G1 and G2, and transformant G2 had a
higher EGFP expression level than the G1 did (Fig. 4c). In contrast, no
amplification of cDNA was detected inWT cells.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2. c. vulgaris แปลงได้ถูกสาธิต PEG mediated แปลงให้ มีประสิทธิภาพวิธีการแนะนำยีนเข้าไปในโปของ microalgaeซึ่งสามารถเตรียม โดยเอาผนังเซลล์เอนไซม์ในระบบ [28,41] ในของเราการทดลอง การรวมกันของค็อกเทลเอนไซม์ cellulase, macerozyme ของและ pectinase พิสูจน์ประสิทธิภาพย่อยผนังเซลล์ C. vulgaris นำไปการผลิตของกว่า 80% โป เตรียม enzymaticallyโป C. vulgaris ถูกแปลง ด้วย EGFP pBI plasmid โดยใช้วิธี PEG อนุญาตการกู้คืนในไม่ใช้นอนสำหรับฟื้นฟูเซลล์ผนัง และได้แพร่กระจายไปแล้วในงานagar แผ่น supplementedwith 30 μg/mL G418 หลังจาก 2 – 3weeks ของคณะทันตแพทยศาสตร์อาณานิคม G418 ทนก็ปรากฏให้เห็นบนแผ่นงาน agar(Fig. 3b)เพื่อให้แน่ใจว่า การเกิดขึ้นของอาณานิคมเหล่านี้ไม่เกิดจากขาด หรือเหนี่ยวนำให้กลายพันธุ์ในเซลล์ algal ที่อาจประสาทต้านทานการ G418 โปภายใต้กระบวนการเปลี่ยนแปลงเดียวกันแต่ ไม่เพิ่ม (ซึ่งต่อไปนี้เรียกว่า plasmidโป untransformed) ยังถูกเคลือบบนแผ่น agar เลือกเป็นตัวควบคุม ตามที่คาดไว้ โป untransformed ที่มีความสามารถในการของการเติบโตใน agar ไม่เลือก แผ่นอาจไม่รอดภายใต้เลือก G418 (Fig. 3) Efficiencywas การเปลี่ยนแปลงโดยรวมที่คำนวณได้และเดินทางถึงโคโล 356±30 หน่วย (cfu) ต่อ μg ของการขึ้นรูปplasmid DNA pBI-EGFP อาณานิคม G418 ทนถูก restreakedสามครั้งใน agar เลือกแผ่น และ inoculated เป็นงานแล้วสื่อของเหลวสำหรับการจำแนกต่อไปนี้3.3. คุณสมบัติของ transformantsGenomic DNA อย่างชนิดป่า (WT) และ G418 ทนสายพันธุ์ถูกวิเคราะห์ โดยขยาย PCR เพื่อตรวจสอบสถานะของยีน EGFP โดยเฉพาะยีน EGFP สองสุ่มไพรเมอร์เลือก putative transformants, G1 และ G2 พบทั้งบวกสังเกตสัญญาณเป็นวงขนาดที่คาดไว้ (730 คะแนน bp), ใน ขณะที่ขาด WTผลิตภัณฑ์ PCR (Fig. 4a), ระบุการรวมยีนที่ประสบความสำเร็จในกลุ่ม C. vulgarisเพื่อให้หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับรวม transgene นิวเคลียร์คืนในตาภาคใต้วิเคราะห์ทำตามตัวอย่างดีเอ็นเอที่เตรียมจากสองข้าง transformants และ WT สายพันธุ์ Genomic DNA ถูกต้องด้วย EcoRI และจากนั้น เป็นการโพรบชื่อ DIG 493-bpการยีน nptII เป็นที่คาดการณ์ การควบคุมบวกของ plasmidตัวอย่างดีเอ็นเอที่พบวง 14-kb (Fig. 4b) Transformants ทั้ง G1และ G2 แสดงให้เห็นสัญญาณสังเกตเป็นวงเดียวของประมาณบวกฐานที่ 6 บนโปรไฟล์ EcoRI แหวกดีเอ็นเอของพวกเขาเกี่ยวข้อง ขณะ WTแสดงให้เห็นว่าไม่มีวง (Fig. 4b) ผลลัพธ์เหล่านี้เพิ่มเติมระบุที่ยีน EGFP ได้ถูกรวมในจีโนมของ C. vulgaris เสร็จเรียบร้อยแล้วยัง มีการตรวจสอบระดับ mRNA-ท่อน EGFP ในทั้งสองtransformants โดย RT-PCR ผลพบว่า EGFP 720-bpมีขยายยีนในเซลล์ G1 และ G2 และ transformant G2 มีการระดับสูงของนิพจน์ EGFP กว่า G1 ไม่ได้ (Fig. 4 c) ในทางตรงกันข้าม ไม่ขยายของ cDNA ถูก inWT ตรวจพบเซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2 C. vulgaris เปลี่ยนแปลง
PEG-พึ่งการเปลี่ยนแปลงได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีประสิทธิภาพวิธีการที่จะแนะนำยีนเข้าไปใน protoplasts ของสาหร่ายที่ซึ่งสามารถจัดทำขึ้นโดยการกำจัดของผนังเซลล์ของเอนไซม์[28,41] ของเราในการทดสอบการรวมกันของค๊อกเทลของเอนไซม์เซลลูเลส, macerozyme และเพคติเนพิสูจน์ประสิทธิภาพในการย่อยผนังเซลล์ vulgaris ซีที่นำไปสู่การผลิตกว่า80% โปรโตพลา เตรียมเอนไซม์โปรโตพลาของขิงซีถูกเปลี่ยนด้วยพลาสมิด pBI-EGFP โดยใช้วิธีPEG ได้รับอนุญาตในการกู้คืนในสื่อไม่ได้รับเลือกในชั่วข้ามคืนสำหรับการฟื้นฟูเซลล์ผนังและถูกแพร่กระจายนั้นเลือกแผ่นวุ้น supplementedwith 30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร G418 หลังจาก 2-3weeks ของการบ่มอาณานิคมG418 ทนกลายเป็นมองเห็นได้บนแผ่นวุ้นเลือก(รูป. 3b.) เพื่อให้แน่ใจว่าการเกิดขึ้นของอาณานิคมเหล่านี้ไม่ได้เกิดจากการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นเองหรือเหนี่ยวนำให้เกิดในเซลล์สาหร่ายที่อาจหารือต้านทานจะG418, โปรโตพลา ภายใต้การเปลี่ยนแปลงขั้นตอนเดียวกันแต่ไม่มีการเพิ่มของพลาสมิด (ต่อไปนี้จะเรียกว่าuntransformed โปรโตพลา) ได้รับการชุบยังบนแผ่นวุ้นเลือกเป็นตัวควบคุม เป็นที่คาดหวังของโปรโตพลา untransformed ที่มีความสามารถของการเจริญเติบโตบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อไม่ได้รับเลือกไม่สามารถอยู่รอดได้ภายใต้การเลือกG418 (รูปที่. 3) efficiencywas การเปลี่ยนแปลงโดยรวมคำนวณและถึงถึง356 ± 30 อาณานิคมสร้างหน่วย (cfu) ต่อไมโครกรัมของพลาสมิดpBI-EGFP ดีเอ็นเอ อาณานิคมทน G418 ถูก restreaked สามครั้งบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่เลือกและเชื้อแล้วลงในการเลือกสื่อของเหลวลักษณะดังต่อไปนี้. 3.3 ลักษณะของ transformants ตัวอย่างดีเอ็นเอจีโนมจากป่าประเภท (น้ำหนัก) และ G418 ทนสายพันธุ์ที่นำมาวิเคราะห์โดยขยายPCR ในการตรวจสอบการปรากฏตัวของยีนEGFP โดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงกับยีน EGFP สองสุ่มtransformants สมมุติเลือก G1 และ G2 ทั้งแสดงให้เห็นในเชิงบวกสัญญาณตั้งข้อสังเกตว่าเป็นวงดนตรีที่มีขนาดคาด(730 bp) ขณะที่ WT ขาดผลิตภัณฑ์PCR (รูป. 4a) แสดงให้เห็นการแสดงออกของยีนที่ประสบความสำเร็จ บูรณาการในจีโนมvulgaris ซี. เพื่อให้หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับการรวมนิวเคลียร์ของยีน, การวิเคราะห์ blot ภาคใต้ได้ดำเนินการเกี่ยวกับตัวอย่างดีเอ็นเอที่เตรียมจากสองtransformants ข้างต้นและความเครียด WT ดีเอ็นเอถูกย่อยด้วย EcoRI และไฮบริดแล้วด้วย 493-bp สอบสวน DIG ติดฉลากที่เฉพาะเจาะจงกับยีนnptII เป็นที่คาดหวังการควบคุมในเชิงบวกของพลาสมิดตัวอย่างดีเอ็นเอแสดงให้เห็นว่าวง 14 กิโลไบต์ (รูป. 4b) ทั้งสอง transformants G1 และ G2 แสดงให้เห็นสัญญาณบวกสังเกตเห็นเป็นวงเดียวประมาณ6 กิโลเกี่ยวกับโปรไฟล์ดีเอ็นเอของตน EcoRI-ตัดขณะ WT แสดงให้เห็นว่าไม่มีวงดนตรี (รูป. 4b) ผลเหล่านี้ยังชี้ให้เห็นว่ายีน EGFP ได้รับการประสบความสำเร็จในแบบบูรณาการของจีโนมซี vulgaris ได้. นอกจากนี้ EGFP mRNA มั่นคงของรัฐในระดับที่มีการตรวจสอบทั้งสองtransformants โดย RT-PCR ผลการศึกษาพบว่า 720 bp EGFP ยีนถูกขยายทั้งใน G1 และ G2 และ transformant G2 มีระดับการแสดงออกEGFP สูงกว่า G1 ได้ (รูป. 4c) ในทางตรงกันข้ามไม่มีการขยายของยีนที่ตรวจพบเซลล์ inWT

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.2 . C . vulgaris แปลง
ตรึงโดยการแปลงได้แสดงเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพ
แนะนำยีนเข้าไปในเซลล์ของสาหร่าย
, ซึ่งสามารถเตรียมโดยเอนไซม์ในการกำจัดเซลล์ผนัง [ 28,41 ] ในการทดลองของเรา
, การรวมกันของเอนไซม์เซลลูเลสและค็อกเทล , เอนไซม์ macerozyme
พิสูจน์ประสิทธิภาพย่อย C . vulgaris ผนังเซลล์า

,การผลิตกว่า 80% ต่อ . การ enzymatically เตรียม
พลาสต์ C . vulgaris ถูกเปลี่ยนด้วย egfp pbi พลาสมิดโดย
ใช้ PEG วิธีการอนุญาตให้กู้ไม่เลือกขนาดกลาง
ค้างคืนผนังเซลล์ใหม่ และจากนั้นการแพร่กระจายบนแผ่นวุ้นเลือก
supplementedwith 30 μ g / ml g418 . หลังจาก 2 - 3 ตะหาก 1
,g418 ป้องกันอาณานิคมกลายเป็นมองเห็นได้บนแผ่นวุ้นเลือก

( รูปที่ 3B ) เพื่อให้แน่ใจว่า การเกิดขึ้นของอาณานิคมเหล่านี้ไม่ได้เกิดจาก
ธรรมชาติ หรือการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ในเซลล์ของสาหร่ายที่อาจหารือเพื่อต้านทาน
g418 เลส , ภายใต้เดียวกันแต่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงกระบวนการ
2
พลาสมิด ( ต่อไปจะเรียกว่าuntransformed พลาสต์ ) ยังชุบลงบนแผ่นเลือกวุ้น
เป็นตัวควบคุม อย่างที่คาดไว้ untransformed เซลล์ที่มีความสามารถในการเจริญเติบโตไม่เลือกวุ้น

จานไม่สามารถอยู่รอดภายใต้การ g418 ( รูปที่ 3 ) การเปลี่ยนแปลงโดยรวมและค่า
efficiencywas ถึงถึง 356 ± 30 อาณานิคมสร้างหน่วย ( CFU ) ต่อμ g
pbi egfp พลาสมิดดีเอ็นเอการ g418 ป้องกันอาณานิคมได้ถูก restreaked
3 ครั้งบนแผ่นวุ้นที่เลือก แล้วเลือกเชื้อเหลวสำหรับคุณสมบัติต่อไปนี้
.
3.3 . คุณสมบัติของพลาสมิดดีเอ็นเอตัวอย่างจากป่าประเภท

( WT ) และสายพันธุ์ที่ทน g418 วิเคราะห์โดยวิธี PCR ( ตรวจสอบสถานะ
ของ egfp ยีน โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะกับ egfp ยีนสองแบบสุ่มเลือกการแสดงออกและพลาสมิด G1
, G2 , ทั้งสองแสดงสัญญาณบวก
) เป็นวงดนตรีของขนาด ( 730 คาดว่า BP ) ในขณะที่น้ำหนักขาด
ผลิตภัณฑ์ PCR ( รูปที่ 4 ) แสดงความยีนเข้าสู่จีโนมแบบ C .
.
เพื่อให้หลักฐานเพิ่มเติมเพื่อบูรณาการนิวเคลียร์ของยีน
, การทำ Southern blot analysis คือใช้ตัวอย่างดีเอ็นเอจาก
ทั้งสองข้างและพลาสมิดโดยสายพันธุ์ ดีเอ็นเอถูกย่อย
ด้วยแล้ว ) กับส่วน BP ขุดป้าย
เฉพาะโพรบเพื่อ nptii ยีน ตามที่คาดไว้ , ควบคุมบวกของพลาสมิดดีเอ็นเอตัวอย่าง พบวงดนตรี
14 กิโล ( ภาพ 4B ) ทั้ง transformants G1
และ G2 มีสัญญาณบวกสังเกตเป็นวงเดียวประมาณ
6 KB บนชิ้นส่วนของตนแหวก โปรไฟล์ดีเอ็นเอในขณะที่น้ำหนัก
ไม่พบแถบ ( ภาพ 4B ) ผลลัพธ์เหล่านี้เพิ่มเติม พบว่า ยีน ได้บูรณาการ egfp
เรียบร้อยแล้วในจีโนมของ C . vulgaris .
ยัง คงที่ระดับ mRNA egfp ตรวจร่างกายทั้ง 2
transformants โดย RT-PCR . ผลการศึกษาพบว่า 720 BP egfp
ยีน G1 และ G2 ขยายทั้งในและ / G2 มี
สูงกว่า egfp การแสดงออกระดับมากกว่า G1 ได้ ( ภาพที่ 4C )ในทางตรงกันข้าม ไม่
เพิ่มปริมาณ cDNA ที่ตรวจพบ inwt เซลล์