Grouper, Epinephelus spp., is a maj

Grouper, Epinephelus spp., is a major fish species of mariculture in Singapore and other Southeast (SE) Asian countries. In recent years, with the rapidly developing aquaculture industry, viral diseases have affected severely many highly valued species such as grouper causing heavy economic losses in SE Asia (Chua et al., 1994; Chou et al., 1998). Recently, a pathogenic iridovirus was isolated from the diseased brown-spotted grouper, E.
tau_ina. The virus can infect and induce an ad- vanced cytopathic effect (CPE) in a marine fish cell line (GP) derived from the hatching embryo of grouper, E. tau_ina (Chew-Lim et al., 1994). The virus has been characterised as a member of the genus Rana_irus and the family Irido_iridae based on morphological, biochemical and genetic properties (Qin et al., 2000).
The family Irido_iridae comprises five recognized genera; Irido_irus, Chlorirido_irus, Rana_irus (FV3 and related agents), Lymphocysti virus (lymphocystis disease virus, LDV), and goldfish virus 1-like viruses (Goldfish virus 1, GFV-1) (Murphy et al., 1995). These iridoviruses are well-known pathogens of amphibians, fish and insects. Studies on the ultrastructure and morphogenesis of viruses are requisite for understanding mechanisms of viral infection and development of new vaccines and anti-viral treatments. Previous studies have shown that iridoviruses are double-stranded DNA viruses with icosahedral symmetry and diameters of 120–300 nm, and contain a spherical deoxyribonucleoprotein core surrounded by a lipid membrane
containing protein subunits (Murphy et al., 1995). There are few comprehensive studies about
the infection cycle of iridoviral pathogens and the capsid fine structure of iridovirus particles
(Berthiaume et al., 1984; Heppell and Berthiaume, 1992; Granzow et al., 1997; Zhang et al., 1999)
The present study investigated the morphogenesis of the grouper iridovirus during development
in a fish cell line. In addition, the internal fine structure of the iridovirus particles were examined
following sequential enzymatic digestions and detergent degradations of purified virons.
The iridovirus (strain A3/12/98 PPD) was isolated originally from diseased brown-spotted
grouper, E. tau_ina in Singapore and propagated on monolayers of GP cells, a permanent local
marine fish cell line derived from embryos of grouper, E. tau_ina (Chew-Lim et al., 1994). GP cells were cultured in Eagles’ minimum essential medium (EMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 0.116 M sodium chloride, 100 IU ml−1 of penicillin and 100 _g ml−1 of streptomycin. The pH of the medium was adjusted to 7.2–7.4 with 7% sodium bicarbonate and buffered with 0.5% of 1 M N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N_-[2-ehtanesulfonic acid] (HEPES). The cells were grown at 25 °C.
Confluent monolayers of GP cells prepared 24 h previously were infected with grouper iridovirus
isolate A3/12/98 at a multiplicity of infection (MOI) of approximately 0.1. After advanced CPE, the grouper iridovirus was purified as described by Qin et al. (2000). Briefly, 100 ml of remaining virus-infected cells and culture fluid were harvested and centrifuged at 12,000ืg for 30 min at 4 °C. The supernatant (SN1) was collected and stored at 4 °C while the pellet was resuspended with 2 ml of supernatant
(SN1), followed by three cycles of rapid freezing/ thawing and ultrasonication. The virus–cell debris
resuspension was then centrifuged at 4000ื for 20 min at 4 °C. The supernatant (SN2) was collected and finally pooled with SN1 overnight at 4 °C. Virus particles were pelleted from the pooled SN1 and SN2 by centrifugationat 10 000ืg for 8 h at 4 °C and resuspended in 2 ml TN buffer (50 mM Tris–HCl, 150 mM
NaCl, pH 7.5). The suspension was layered onto gradients of 15–60% (w/v) sucrose and centrifuged at 150,000ืg (Beckman, SW 41 Ti rotor) for 1 h at 4 °C. The resulting virus bands were collected by puncturing the centrifuge tubes with needle, and the virus was suspended in TN buffer and repelleted through a 20% sucrose cushion at 100,000ืg for 1 h. The virus pellet was resuspended in 200 _l of TN buffer and
stored at −20 °C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ปลาเก๋า Epinephelus โอ เป็นพันธุ์ปลาที่สำคัญของ mariculture ในสิงคโปร์และประเทศอื่น ๆ ในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ (SE) ในปีล่าสุด กับอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำพัฒนาอย่างรวดเร็ว โรคไวรัสได้ผลกระทบอย่างร้ายแรงหลายชนิดคุณค่าเช่นทำให้เกิดการสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างหนักใน SE Asia (Chua et al., 1994 ปลาเก๋า โชวและ al., 1998) ล่าสุด iridovirus อุบัติถูกแยกต่างหากจากการป่วยด่างน้ำตาลปลาเก๋า อีtau_ina ไวรัสสามารถติดเชื้อ และก่อให้เกิดการโฆษณา vanced cytopathic ผล (CPE) ในปลาทะเลเซลล์บรรทัด (GP) มาจากตัวอ่อนฟักไข่ของปลาเก๋า E. tau_ina (เคี้ยวริม et al., 1994) ไวรัสมีการดำเนินเป็นสมาชิกของสกุล Rana_irus และครอบครัว Irido_iridae ตามคุณสมบัติของ ชีวเคมี และทางพันธุกรรม (ฉินและ al., 2000) ครอบครัว Irido_iridae ประกอบด้วยห้าสกุลรู้จัก Irido_irus, Chlorirido_irus, Rana_irus (FV3 และตัวแทนที่เกี่ยวข้อง) Lymphocysti (lymphocystis โรคไวรัส ผ่าน), แล้วไวรัสไวรัส 1 เหมือนไวรัสปลาทอง (ปลาทองไวรัส 1 ภัย-1) (เมอร์ฟี่และ al., 1995) Iridoviruses เหล่านี้จะรู้จักโรคของสัตว์ ปลา และแมลง การศึกษา ultrastructure และ morphogenesis ไวรัสสำหรับความเข้าใจกลไกของการติดเชื้อไวรัสและพัฒนาความรู้ใหม่และการรักษาป้องกันไวรัสได้ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า iridoviruses ขนคู่ดีเอ็นเอไวรัส icosahedral สมมาตรและสมมาตรของ 120 – 300 nm และประกอบด้วยหลัก deoxyribonucleoprotein ทรงกลมล้อมรอบ ด้วยเยื่อไขมันประกอบด้วยโปรตีน subunits (เมอร์ฟี่และ al., 1995) มีบางการศึกษาครอบคลุมเกี่ยวกับวงจรการติดเชื้อของโรค iridoviral และ capsid ปรับโครงสร้างของอนุภาค iridovirus(Berthiaume et al., 1984 Heppell และ Berthiaume, 1992 Granzow และ al., 1997 เตียว et al., 1999) การศึกษาปัจจุบันสอบสวน morphogenesis ของ iridovirus ปลาเก๋าในระหว่างการพัฒนาในบรรทัดเซลล์ปลา นอกจากนี้ ปรับโครงสร้างภายในของอนุภาค iridovirus ถูกตรวจสอบต่อไปนี้ตามลำดับเอนไซม์ในระบบ digestions และ degradations ผงซักฟอกของ virons บริสุทธิ์ Iridovirus (ต้องใช้ A3/12/98 PPD) ถูกโดดเดี่ยวเดิมป่วยด่างสีน้ำตาลปลาเก๋า E. tau_ina ในสิงคโปร์และเผยแพร่บน monolayers GP เซลล์ ถิ่นถาวรปลาทะเลเซลล์บรรทัดมาจากโคลนของปลาเก๋า E. tau_ina (เคี้ยวริม et al., 1994) เซลล์ GP มีอ่างในอีเกิลแลนดิงต่ำสุดจำเป็นปานกลาง (ซีอาร์) ที่ประกอบด้วย 10% ครรภ์วัวเซรั่ม (FBS), 0.116 M โซเดียมคลอไรด์ ml−1 100 IU ของยาเพนนิซิลลิน และ ml−1 _g 100 ของ streptomycin PH ของตัวกลางถูกปรับปรุง 7.2-7.4 มี 7% โซเดียมไบคาร์บอเนต และ buffered ด้วย 0.5% ของ 1 M N- [2-hydroxyethyl] ข่าวลือ piperazine - N_- [2-ehtanesulfonic กรด] (HEPES) เซลล์เติบโตที่ 25 องศาเซลเซียส Monolayers confluent GP เซลล์เตรียมพร้อม 24 ชมก่อนหน้านี้ได้ติด iridovirus ปลาเก๋าแยก A3/12/98 ที่มากมายหลายหลากของเชื้อ (อย) ของประมาณ 0.1 หลังจาก CPE ขั้นสูง iridovirus ปลาเก๋าที่บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้โดยชินและ al. (2000) สั้น ๆ 100 ml ของเซลล์ติดเชื้อไวรัสที่เหลือและน้ำมันวัฒนธรรมเก็บเกี่ยว และ centrifuged ที่ 12, 000ืg ใน 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส รวบรวม และจัดเก็บที่ 4 ° C ในขณะเม็ดถูก resuspended กับ ml 2 ของ supernatant supernatant (SN1)(SN1), ตาม ด้วยรอบที่สามของแช่แข็งรวดเร็ว / thawing และ ultrasonication เศษเซลล์ไวรัสแล้วมี centrifuged resuspension ตะกอนที่ 4000ื สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส Supernatant (รายการ SN2) รวบรวม และสุดท้าย ทางถูกพูกับ SN1 ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส อนุภาคไวรัส pelleted SN1 และรายการ SN2 รวม โดย centrifugationat 10 000ืg สำหรับ h 8 ที่ 4 ° C และ resuspended ในบัฟเฟอร์ 2 ml TN (ตรี – HCl 50 มม. 150 มม.NaCl, pH 7.5) การระงับชั้นบนไล่ระดับสีของซูโครส 15 – 60% (w/v) และ centrifuged 150, 000ืg (Beckman ใบพัดตี้ 41 SW) สำหรับ h 1 ที่ 4 องศาเซลเซียส วงไวรัสได้ถูกรวบรวม โดย puncturing หลอดเครื่องหมุนเหวี่ยงด้วยเข็ม และไวรัสถูกหยุดชั่วคราวในบัฟเฟอร์ TN และ repelleted ผ่านเบาะเป็นซูโครส 20% 100, 000ืg สำหรับ 1 h เม็ดไวรัสถูก resuspended ใน _l 200 TN บัฟเฟอร์ และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จัดกลุ่ม, Epinephelus spp. เป็นสายพันธุ์ปลาที่สำคัญของการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำในสิงคโปร์และตะวันออกเฉียงใต้อื่น ๆ (SE) ประเทศในเอเชีย ในปีที่ผ่านมากับอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำการพัฒนาอย่างรวดเร็ว, โรคไวรัสได้รับผลกระทบอย่างรุนแรงหลายชนิดที่มีมูลค่าสูงเช่นปลาเก๋าที่ก่อให้เกิดความเสียหายทางเศรษฐกิจอย่างหนักในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ (Chua et al, 1994;.. โจว, et al, 1998) เมื่อเร็ว ๆ นี้ที่ทำให้เกิดโรค iridovirus แยกได้จากน้ำตาลด่างเก๋าโรคอี
tau_ina ไวรัสสามารถติดเชื้อและทำให้เกิดการปรับแก้ vanced cytopathic ผล (CPE) ในมือถือปลาทะเลสาย (GP) ที่ได้มาจากตัวอ่อนที่ฟักไข่ของปลาเก๋าอี tau_ina (เคี้ยวลิ้ม et al., 1994) ไวรัสมีลักษณะเป็นสมาชิกของสกุล Rana_irus และครอบครัว Irido_iridae ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติทางสัณฐานวิทยาชีวเคมีและทางพันธุกรรม (ฉิน et al, 2000)..
ครอบครัว Irido_iridae ประกอบด้วยห้าจำพวกได้รับการยอมรับ; Irido_irus, Chlorirido_irus, Rana_irus (FV3 และตัวแทนที่เกี่ยวข้อง) ไวรัส Lymphocysti (lymphocystis ไวรัสโรค LDV) และไวรัสไวรัสปลาทอง 1 เหมือน (ปลาทองไวรัส 1 GFV-1) (เมอร์ฟี่ et al., 1995) iridoviruses เชื้อโรคเหล่านี้จะรู้จักกันดีของสัตว์ครึ่งบกครึ่งปลาและแมลง การศึกษาและ ultrastructure morphogenesis ของไวรัสเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการทำความเข้าใจกลไกของการติดเชื้อไวรัสและการพัฒนาวัคซีนใหม่และการรักษาต่อต้านไวรัส การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าเป็นไวรัส iridoviruses ดีเอ็นเอเกลียวคู่สมมาตร icosahedral และเส้นผ่าศูนย์กลาง 120-300 นาโนเมตรและมีหลัก deoxyribonucleoprotein ทรงกลมล้อมรอบด้วยเยื่อไขมัน
ที่มีหน่วยย่อยของโปรตีน (เมอร์ฟี่ et al., 1995) มีการศึกษาน้อยที่ครอบคลุมเกี่ยวกับการเป็น
วงจรการติดเชื้อของเชื้อโรค iridoviral capsid และปรับโครงสร้างของอนุภาค iridovirus
(. Heppell และ Berthiaume 1992; Berthiaume et al, 1984 Granzow, et al, 1997;.. Zhang et al, 1999)
ในปัจจุบัน การศึกษาการตรวจสอบของ morphogenesis เก๋า iridovirus ในระหว่างการพัฒนา
ในสายพันธุ์ของเซลล์ปลา นอกจากนี้การปรับโครงสร้างภายในของอนุภาค iridovirus มีการตรวจสอบ
ต่อไปนี้เอนไซม์ย่อยลำดับและ degradations ผงซักฟอก virons บริสุทธิ์.
iridovirus (สายพันธุ์ A3 / 12/98 PPD) ถูกโดดเดี่ยวจากเดิมสีน้ำตาลด่างโรค
เก๋าอี tau_ina ในสิงคโปร์ และแพร่กระจายใน monolayers ของเซลล์ GP ท้องถิ่นถาวร
เซลล์ปลาทะเลที่ได้มาจากตัวอ่อนของปลาเก๋าอี tau_ina (เคี้ยวลิ้ม et al., 1994) GP เซลล์เพาะเลี้ยงในอีเกิลส์ 'กลางขั้นต่ำที่จำเป็น (EMEM) ที่มี 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) 0.116 M โซเดียมคลอไรด์ 100 มล. IU-1 ของยาปฏิชีวนะและ 100 มล. _g-1 ของ streptomycin ค่า pH ของกลางที่ได้รับการปรับให้ 7.2-7.4 ด้วยโซเดียมไบคาร์บอเนต 7% และเป็นกลางกับ 0.5% ของ N-M 1 [2-hydroxyethyl] piperazine-N _- [กรด 2 ehtanesulfonic] (HEPES) เซลล์ปลูกที่ 25 ° C.
monolayers ไหลมารวมกันของเซลล์ GP เตรียม 24 ชั่วโมงก่อนหน้านี้มีการติดเชื้อ iridovirus เก๋า
แยก A3 / 12/98 ที่หลายหลากของการติดเชื้อ (กระทรวงมหาดไทย) ประมาณ 0.1 หลังจาก CPE ขั้นสูงเก๋า iridovirus บริสุทธิ์ตามที่อธิบายฉิน et al, (2000) สั้น ๆ , 100 มล. เหลือของเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสและของเหลววัฒนธรรมถูกเก็บเกี่ยวและหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ืกรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ใส (SN1) ถูกเก็บรวบรวมและเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสในขณะที่เม็ดที่ถูก resuspended 2 มิลลิลิตรใส
(SN1) ตามด้วยสามรอบของการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว / ละลายและ ultrasonication เศษไวรัสมือถือ
resuspension ถูกปั่นแล้วที่ 4000 ื 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ใส (SN2) เก็บรวบรวมและสุดท้ายกับ SN1 ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส อนุภาคไวรัสที่ได้รับจากเม็ด SN1 รวบรวมและ SN2 โดย centrifugationat 10 000 ืกรัมเป็นเวลา 8 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียสและ resuspended ใน 2 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์เทนเนสซี (50 มิลลิ Tris-HCl 150 มิลลิ
โซเดียมคลอไรด์มีค่า pH 7.5) ถูกระงับชั้นบนของการไล่ระดับสี 15-60% (w / v) ซูโครสและหมุนเหวี่ยงที่ 150,000 ืกรัม (เบคค์, SW 41 โรเตอร์ Ti) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส วงดนตรีที่เกิดไวรัสที่ถูกเก็บรวบรวมโดยเจาะหลอดหมุนเหวี่ยงกับเข็มและไวรัสถูกระงับในบัฟเฟอร์เทนเนสซีและ repelleted ผ่าน 20% เบาะน้ำตาลซูโครสที่ 100,000 ืกรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เม็ดไวรัส resuspended ใน 200 _L ของ buffer เทนเนสซีและ
เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สกุลปลาหมอทะเล spp . , ปลาเก๋า , ปลาเป็นหลักของการเลี้ยงสัตว์ทะเลในสิงคโปร์และเอเชียตะวันออกเฉียงใต้อื่น ๆ ( SE ) ประเทศในเอเชีย ในปีล่าสุดกับการพัฒนาอย่างรวดเร็วของอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ ไวรัสโรคได้รับผลกระทบอย่างรุนแรงหลายมูลค่าสูง ชนิด เช่น ปลาเก๋า ก่อให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจหนักในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ( Chua et al . , 1994 ; Chou et al . , 1998 ) เมื่อเร็วๆ นี้เป็นโรคอิริโดไวรัสถูกแยกจากโรคสีน้ำตาลปลาเก๋า , E .
tau_ina . ไวรัสสามารถติดเชื้อและทำให้เกิดโฆษณา - vanced cytopathic ผล ( CPE ) ในปลาทะเลสายพันธุ์ของเซลล์ ( GP ) ที่ได้จากตัวอ่อนฟักปลากะรัง , E . tau_ina ( เคี้ยวลิม et al . , 1994 ) ไวรัสมีลักษณะเป็นสมาชิกของสกุล rana_irus และครอบครัว irido_iridae ขึ้นอยู่กับลักษณะทางสัณฐานวิทยาสมบัติทางชีวเคมี และทางพันธุกรรม ( ฉิน et al . , 2000 )
irido_iridae ครอบครัวประกอบด้วยห้ารู้จักสกุล ; irido_irus chlorirido_irus rana_irus ( fv3 , , และที่เกี่ยวข้องกับตัวแทน ) , lymphocysti ไวรัส ( ลิมโฟซิสติสโรคไวรัส ldv ) และปลาทอง ( ปลาทอง 1-like ไวรัสไวรัสไวรัส 1 , gfv-1 ) ( Murphy et al . , 1995 ) . iridoviruses เหล่านี้จะรู้จักกันดีเชื้อโรคของสัตว์ ปลา และแมลงการศึกษาในการเปลี่ยนแปลงลักษณะของไวรัสและจำเป็นสำหรับความเข้าใจของกลไกการติดเชื้อไวรัสและการพัฒนาวัคซีนใหม่และการรักษาป้องกันไวรัส การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า iridoviruses คู่เกลียวดีเอ็นเอของไวรัสกับ icosahedral สมมาตรและเส้นผ่าศูนย์กลาง 120 – 300 นาโนเมตร และมี deoxyribonucleoprotein แกนทรงกลมล้อมรอบด้วยเยื่อไขมัน
ที่ประกอบด้วยหน่วยย่อยของโปรตีน ( Murphy et al . , 1995 ) มีการศึกษาเกี่ยวกับ
การติดเชื้อรอบ iridoviral เชื้อโรคและโครงสร้างดีแคปซิดของอิริโดไวรัสอนุภาค
ครอบคลุมไม่กี่ ( berthiaume et al . , 1984 ; และ heppell berthiaume , 1992 ; granzow et al . , 1997 ; Zhang et al . , 1999 )
การศึกษาเป็นการศึกษาการเปลี่ยนแปลงลักษณะของปลากะรังอิริโดไวรัสในระหว่างการพัฒนา
ในเซลล์ ปลาเส้น นอกจากนี้ โครงสร้างดีภายในของอนุภาคอิริโดไวรัสทดสอบ
ต่อไปนี้ digestions ต่อเนื่องและผงซักฟอกเอนไซม์ degradations บริสุทธิ์ virons .
อิริโดไวรัส ( สายพันธุ์ A3 / 12 / 98 PPD ) ถูกแยกมาจากจุดสีน้ำตาลด่าง
ปลาเก๋า , E . tau_ina ในสิงคโปร์และขยายพันธุ์ใน monolayers ของ GP เซลล์ท้องถิ่น
ถาวรปลาทะเลสายพันธุ์ของเซลล์ที่ได้มาจากตัวอ่อนของปลากะรัง , E . tau_ina ( เคี้ยวลิม et al . , 1994 ) ในเซลล์เพาะเลี้ยงในขั้นต่ำที่จำเป็นของนกอินทรีขนาดกลาง ( มเ ม ) ที่มี 10% เซรั่มและทารกในครรภ์ ( FBS ) 0.116 M โซเดียมคลอไรด์ 100 IU ml − 1 ของเพนนิซิลลิน และ 100 _g ml − 1 จัง . พีเอชของอาหารปรับ 7.2 – 7.4 กับโซเดียมไบคาร์บอเนต 7% และ 2 กับ 05 % 1 M - [ ] - [ 2-hydroxyethyl piperazine-n_ 2-ehtanesulfonic กรด ] ( ฮีเปส ) เซลล์ที่ปลูกที่อุณหภูมิ 25 องศา
กระจู๋กระจี๋ monolayers ของ GP เซลล์เตรียมพร้อม 24 ชั่วโมง ก่อนหน้านี้ ติดเชื้อ ปลาเก๋าอิริโดไวรัส
แยก A3 / 12 / 98 ที่หลายหลากของการติดเชื้อ ( MOI ) ประมาณ 0.1 หลังจากทบทวนขั้นสูง ปลาเก๋าอิริโดไวรัสบริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้โดยฉิน et al . ( 2000 ) สั้น ๆ100 ml ของของเหลวและเซลล์วัฒนธรรมไทที่เหลือเก็บระดับที่ 12 , 000 ื G สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C ( สูง sn1 ) รวบรวม และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 องศา C ในขณะที่เม็ดมี resuspended 2 มิลลิลิตร นำ
( sn1 ) , ตามด้วยสามรอบอย่างรวดเร็วของการแช่แข็ง / ละลายและ ultrasonication . ไวรัส–เศษเซลล์
resuspension ก็ระดับ 4000 ืสำหรับ 20 นาทีที่ 4 ° C ( สูง sn2 ) รวบรวม และในที่สุดก็รวมกับ sn1 ค้างคืนที่ 4 ° C เป็นเม็ดอนุภาคไวรัสจาก sn1 sn2 โดยรวมและ centrifugationat 10 000 ื G 8 H 4 ° C และ resuspended 2 ml TN บัฟเฟอร์ ( 50 มม. โดย– HCL 150 mm
โซเดียมคลอไรด์พีเอช 7.5 )ถูกระงับลงไล่ชั้น 15 – 60 % ( w / v ) ที่ใช้ไฟฟ้าื 150 กรัม ( Beckman SW 41 Ti ใบพัด ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 4 องศา ส่งผลให้ไวรัสวงครั้งนี้ เจาะหลอดปั่นเหวี่ยงด้วยเข็ม และไวรัสที่ถูกระงับใน TN บัฟเฟอร์ และ repelleted ผ่านเบาะ ซูโครส 20% ที่ 100000 ืกรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ไวรัส resuspended ในการผลิต 200 _l TN และ
กันชนอุณหภูมิ− 20 ° C .