Swabs The swabs dipped in 1 ml of d

Swabs
The swabs dipped in 1 ml of distilled water during transportation, were vortexed for 30 seconds onds followed by centrifugation at 800 g for 10 minutes.[7] Pellet was resuspended in 100 μl of Page saline which was spread onto the 1.5% NNA plate overlaid with E. coli and was incubated and processed in a similar manner as that for water samples.
Nucleic acid extraction, amplification and sequencing
The nucleic acid was extracted from culture by phenol-chloroform-isoamyl alcohol method as previously described. [8] Extracted deoxynucleic acid (DNA) was subjected to PCR (polymerase chain reaction) amplification (Thermo Scientific Thermal Cycler) of 18S rRNA sequences using primers common for FLA as described earlier which amplify Acanthamoeba spp, H. vermiformis, N. fowleri, Vannella spp. and Vahlkampfia ovis. [8-10] Briefly, reaction mixture of 25 μl consisted of buffer, 0.2 mM dNTPs (Sigma) and 20 pmol each of primers and 1.25 units of Taq DNA polymerase (Sigma). The amplification cycle included 40 cycles of denaturation 94°C for 4 min annealing (63°C for 1 min) and extension (74°C for 3.5 min) followed by a final extension at 72°C for 10 min. The resultant amplicons were subjected to agarose gel (2%) electrophoresis. The samples were also subjected to amplification by Naegleria specific primers and Acanthamoeba specific primers (JDP1 and JDP2) as previously described.[10,11] Briefly, Naegleria DNA amplification consisted of 50 cycles of denaturation (95°C for 15 s), annealing (58°C for 30 s), and extension (72°C for 45 s). The PCR amplification cycle for JDP primers was standardised which included initial denaturation at 95°C for 10 min followed by 39 cycles of denaturation at 95°C for 1 min, annealing at 60°C for 1 min, extension at 72°C for 2 min and final extension at 72°C for 7 min. Amplified DNA products were separated by 1.5% agarose electrophoresis stained with a solution of 0.5 μg/ml of ethidium bromide and visualised under UV light using an image analyser. Acanthamoeba spp were further classified into genotypes based on 18S ribosomal RNA nucleotide sequencing with the conserved primers 892C, using Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, version 3.1 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) and analysed by ABI 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems).[8,11] [Table 1]. Nucleotide similarity search was performed by BLAST search of sequenced amplicons in GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

swabs
swabs จุ่มลงใน 1 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นในระหว่างการขนส่งได้รับการ vortex เวลา 30 วินาทีชั่วตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 800 กรัมเป็นเวลา 10 นาที. [7] เม็ดถูก resuspended ใน 100 ไมโครลิตรน้ำเกลือหน้าซึ่งได้รับการแพร่กระจายเข้าสู่ 1.5% แผ่น NNA บุด้วยเชื้อ E. coli และได้รับการบ่มและประมวลผลในลักษณะที่คล้ายคลึงกับที่สำหรับตัวอย่างน้ำ.
สกัดกรดนิวคลีอิกขยายและลำดับกรดนิวคลีอิกถูกสกัดจากการเพาะเลี้ยงโดยฟีนอลคลอโรฟอร์ม isoamyl วิธีการดื่มเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
[8] deoxynucleic สกัดกรด (DNA) ได้ภายใต้การ PCR (วิธี polymerase chain reaction) ขยาย (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ Cycler ความร้อน) ของ 18S rRNA ลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ทั่วไปสำหรับ FLA ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ที่ขยาย Acanthamoeba spp เอช vermiformis เอ็น fowleri, เอสพีพี Vannella และ Vahlkampfia แกะ [8-10] สั้น ๆ , ผสมปฏิกิริยา 25 ไมโครลิตรประกอบด้วยบัฟเฟอร์ 0.2 มิลลิ dNTPs (ซิกม่า) และ 20 pmol แต่ละไพรเมอร์และ 1.25 หน่วยดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq (ซิกม่า) วงจรขยายรวม 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีหลอม (63 ° C เป็นเวลา 1 นาที) และการขยาย (74 ° C เป็นเวลา 3.5 นาที) ตามด้วยนามสกุลสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที amplicons ผลถูกยัดเยียดให้ agarose เจล (2%) อิ กลุ่มตัวอย่างที่ยังอยู่ภายใต้การขยายโดย Naegleria ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงและ Acanthamoeba ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง (JDP1 และ JDP2) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้. [10,11] สั้น ๆ , การขยาย Naegleria ดีเอ็นเอประกอบด้วย 50 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ (95 ° C เป็นเวลา 15 วินาที) หลอม (58 ° C เป็นเวลา 30 วินาที) และส่วนขยาย (72 ° C เป็นเวลา 45 วินาที) วงจรขยาย PCR สำหรับไพรเมอร์ JDP เป็นมาตรฐานซึ่งรวมถึงการสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 39 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 ° C เป็นเวลา 1 นาที, การอบที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 และการขยายนาทีสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที ขยายผลิตภัณฑ์ดีเอ็นเอถูกแยกออก 1.5% agarose อิย้อมด้วยวิธีการแก้ปัญหา 0.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ethidium bromide และมองเห็นภายใต้แสงยูวีโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ เอสพีพี Acanthamoeba ถูกจัดต่อไปในยีนอยู่บนพื้นฐานของ 18S โซมอลลำดับเบสอาร์เอ็นเอที่มี 892C ไพรเมอร์อนุรักษ์การใช้บิ๊กย้อม Terminator วงจรลำดับชุดเวอร์ชัน 3.1 (Applied Biosystems เมืองฟอสเตอร์, CA, USA) และวิเคราะห์โดย ABI 3130 ทางพันธุกรรมวิเคราะห์ (ประยุกต์ Biosystems). [8,11] [ตารางที่ 1] เบื่อหน่ายการค้นหาความคล้ายคลึงกันได้ดำเนินการโดยการค้นหาระเบิดของ amplicons ติดใจในฐานข้อมูล GenBank

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

swabs จากจุ่มลงใน 1 มิลลิลิตรของน้ำระหว่างการขนส่งได้ vortexed 30 วินาทีตามด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ onds 800 กรัม 10 นาที [ 7 ] เม็ดเป็น resuspended 100 μ l หน้าน้ำเกลือซึ่งแพร่กระจายไปยัง 1.5% nna แผ่นวางทับด้วยเชื้อ E . coli และบ่มและประมวลผลในลักษณะ คล้ายว่า ตัวอย่างน้ำ
การสกัดกรดนิวคลีอิกเครื่องขยายเสียงและจัดลำดับ
กรดนิวคลีอิกสกัดจากวัฒนธรรมโดยวิธีคลอโรฟอร์มในปริมาณแอลกอฮอล์ฟีนอลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 8 ] สกัด deoxynucleic acid ( DNA ) ถูกยัดเยียดให้ ( ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ความร้อนรอบ ) ของ 18S rRNA ลำดับการใช้ไพรเมอร์ทั่วไปตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งทุกครั้งต้องขยายและ vermiformis , H . ,fowleri vannella spp . , vahlkampfia ovis . [ 8-10 ] สั้นผสมปฏิกิริยาของ 25 μผมประกอบด้วยบัฟเฟอร์ 0.2 มม. dntps ( Sigma ) และ 20 pmol แต่ละชนิดและ 1.25 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( Sigma ) วงจรขยายเสียงรวม 40 รอบ ( 94 ° C เป็นเวลา 4 นาที การอบอ่อน ( 63 องศา C เป็นเวลา 1 นาที ) และนามสกุล ( 74 ° C เป็นเวลา 3.5 นาที ) ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 10 นาทีผลการ amplicons ถูกเจล ( 2% ) เรส ตัวอย่างที่ยังต้องขยาย โดยเฉพาะรองพื้นและไพร์เมอร์จำเพาะ ( jdp1 เอทุกครั้ง และ jdp2 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 10,11 ] สั้นเอ DNA Amplification จำนวน 50 รอบ ( ( 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาที ) การอบ ( 58 องศา C 30 ) และนามสกุล ( 72 ° C สำหรับ 45 วินาที )วงจรขยายเสียง jdp ไพรเมอร์ซึ่งเป็นมาตรฐานซึ่งรวมถึงการเริ่มต้น ( ที่ 95 องศา C นาน 10 นาที ตามด้วย 39 รอบ ( ที่ 95 องศา C เป็นเวลา 1 นาที อบอ่อนที่อุณหภูมิ 60 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีที่ 72 ° C ต่อ 2 นาทีที่ 72 ° C สุดท้ายขยายผลิตภัณฑ์ 7 นาที แถบดีเอ็นเอ แยกได้จาก 1.5% , วิธีย้อมด้วยสารละลาย 05 μ g / ml ของทิเดียมโบรไมด์และมองเห็นแสงยูวีที่ใช้วิเคราะห์ภาพ ทุกครั้งและได้แบ่งออกเป็นชนิดตาม 18S โชเน็นจัมป์การวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์กับอนุรักษ์ไพรเมอร์ 892c โดยใช้สีย้อม Terminator รอบใหญ่ลำดับ Kit , รุ่น 3.1 ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) และวิเคราะห์ข้อมูลด้วยเครื่อง ABI 3130 พันธุกรรม ( Applied Biosystems ) [ 8ตารางที่ 11 ] [ 1 ] นิวคลีโอไทด์ similarity search โดยใช้ระเบิดค้นหาในฐานข้อมูลลำดับ amplicons


ขนาด .